53血紅蛋白的提取與分離ppt課件

1、 生產(chǎn)和生活中使用酶制劑和固定化酶，都需生產(chǎn)和生活中使用酶制劑和固定化酶，都需要把從微生物細(xì)胞中提取分離出來(lái)。要把從微生物細(xì)胞中提取分離出來(lái)。 細(xì)胞中有許多種蛋白質(zhì)，怎樣才能將所需要細(xì)胞中有許多種蛋白質(zhì)，怎樣才能將所需要的酶提取分離出來(lái)呢？的酶提取分離出來(lái)呢？20192019年年4 4月月1414日宣布人類基因組序列圖完成，這標(biāo)志著進(jìn)日宣布人類基因組序列圖完成，這標(biāo)志著進(jìn)入了后基因組時(shí)代。入了后基因組時(shí)代。人類基因組：指人類基因組：指DNADNA分子所攜帶的全部遺傳信息。分子所攜帶的全部遺傳信息。蛋白質(zhì)組：生物個(gè)體表達(dá)的蛋白質(zhì)分子的總和。主要是對(duì)蛋白質(zhì)組：生物個(gè)體表達(dá)的蛋白質(zhì)分子的總和。主要是

2、對(duì)蛋白質(zhì)功能的研究蛋白質(zhì)功能的研究課題 3 血紅蛋白的提取和分離課題背景課題背景 蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)不可缺少的物質(zhì)。隨著人類基因組蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)不可缺少的物質(zhì)。隨著人類基因組計(jì)劃的進(jìn)展以及多種生物基因組測(cè)序工作的完成，人類跨計(jì)劃的進(jìn)展以及多種生物基因組測(cè)序工作的完成，人類跨入了后基因組和蛋白質(zhì)組時(shí)代。對(duì)蛋白質(zhì)的研究與應(yīng)用，入了后基因組和蛋白質(zhì)組時(shí)代。對(duì)蛋白質(zhì)的研究與應(yīng)用，首先需要獲得純度較高的蛋白質(zhì)。因此，從復(fù)雜的細(xì)胞混首先需要獲得純度較高的蛋白質(zhì)。因此，從復(fù)雜的細(xì)胞混合物中提取、分離高純度的蛋白質(zhì)是生物科學(xué)研究中經(jīng)常合物中提取、分離高純度的蛋白質(zhì)是生物科學(xué)研究中經(jīng)常要做的工作。要做的工作。

3、血紅蛋白是人和其他脊椎動(dòng)物紅細(xì)胞的主要組成成血紅蛋白是人和其他脊椎動(dòng)物紅細(xì)胞的主要組成成分負(fù)責(zé)血液中分負(fù)責(zé)血液中O2和和CO2的運(yùn)偷。在本課題中，我們將以的運(yùn)偷。在本課題中，我們將以血紅蛋白為實(shí)驗(yàn)材抖，學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)提取和分離的一些基本血紅蛋白為實(shí)驗(yàn)材抖，學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)提取和分離的一些基本才技術(shù)才技術(shù) 占細(xì)胞干重的占細(xì)胞干重的5050以上，細(xì)胞中含量最多的有機(jī)物以上，細(xì)胞中含量最多的有機(jī)物關(guān)于血紅蛋白關(guān)于血紅蛋白1、元素組成、元素組成2、分子結(jié)構(gòu)、分子結(jié)構(gòu)3、顏色、顏色4、存在細(xì)胞、存在細(xì)胞5、生理功能、生理功能6 、獲得方法、獲得方法、 根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形

4、狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度和如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度和吸附的性質(zhì)和對(duì)其他分子的親和力等等，可以用來(lái)分離不吸附的性質(zhì)和對(duì)其他分子的親和力等等，可以用來(lái)分離不同蛋白質(zhì)。同蛋白質(zhì)。問(wèn)：依據(jù)什么來(lái)分離和提取蛋白質(zhì)原理問(wèn)：依據(jù)什么來(lái)分離和提取蛋白質(zhì)原理P65T5P65T51313）基礎(chǔ)知識(shí)基礎(chǔ)知識(shí)閱讀并回答（閱讀并回答（P64P64） 1 1、凝膠色譜法另一個(gè)名稱；、凝膠色譜法另一個(gè)名稱； 2 2、凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的依據(jù)；、凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的依據(jù)； 3 3、凝膠的實(shí)質(zhì)；、凝膠的實(shí)質(zhì)； 4 4、凝膠色譜法、凝膠色譜法 5 5、凝膠色譜法的原理。、凝膠色譜法的原理

5、?；A(chǔ)知識(shí)（一）基礎(chǔ)知識(shí)（一） 凝膠色譜法凝膠色譜法1 1、凝膠色譜法的別名：分配色譜法、凝膠色譜法的別名：分配色譜法 是根據(jù)相對(duì)分予質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方是根據(jù)相對(duì)分予質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。法。 4 4、凝膠、凝膠 性質(zhì)：一些微小的多孔球體，球內(nèi)含許多貫穿的通性質(zhì)：一些微小的多孔球體，球內(nèi)含許多貫穿的通道；道； 化學(xué)本質(zhì)：多糖類化合物：化學(xué)本質(zhì)：多糖類化合物： 實(shí)例：葡聚糖、瓊脂糖：實(shí)例：葡聚糖、瓊脂糖：2 2、凝膠色譜法的概念：、凝膠色譜法的概念： 根據(jù)被分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大小，利根據(jù)被分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大小，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，來(lái)進(jìn)

6、行分離。用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，來(lái)進(jìn)行分離?；A(chǔ)知識(shí)（一）基礎(chǔ)知識(shí)（一） 凝膠色譜法凝膠色譜法3 3、依據(jù)的特性蛋白質(zhì)分子量的大小。、依據(jù)的特性蛋白質(zhì)分子量的大小。 原理：當(dāng)不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí)，相原理：當(dāng)不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí)，相對(duì)（對(duì)（ ）的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入）的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程（凝膠內(nèi)部的通道，路程（ ），移動(dòng)速），移動(dòng)速度（度（ ），而（），而（ ）的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在（在（ ）挪動(dòng)，路程（）挪動(dòng)，路程（ ），），移動(dòng)速度（移動(dòng)速度（ ），相對(duì)分子質(zhì)量不同），相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以分離。的蛋白質(zhì)因

7、此得以分離。相對(duì)分子質(zhì)量較小相對(duì)分子質(zhì)量較小較長(zhǎng)較長(zhǎng)較慢較慢相對(duì)分子質(zhì)量較大相對(duì)分子質(zhì)量較大凝膠外部凝膠外部較短較短較快較快基礎(chǔ)知識(shí)（一）基礎(chǔ)知識(shí)（一） 凝膠色譜法凝膠色譜法基礎(chǔ)知識(shí)（一）基礎(chǔ)知識(shí)（一） 凝膠色譜法凝膠色譜法基礎(chǔ)知識(shí)（一）基礎(chǔ)知識(shí)（一） 凝膠色譜法凝膠色譜法1、我們?cè)谑裁吹胤接龅竭^(guò)緩沖物質(zhì)的？、我們?cè)谑裁吹胤接龅竭^(guò)緩沖物質(zhì)的？2、緩沖物質(zhì)有哪些？、緩沖物質(zhì)有哪些？3、緩沖溶液的作用是什么？、緩沖溶液的作用是什么？4、怎樣配制緩沖溶液？、怎樣配制緩沖溶液？基礎(chǔ)知識(shí)（二緩沖溶液基礎(chǔ)知識(shí)（二緩沖溶液1 1、緩沖溶液概念、緩沖溶液概念 在一定的范圍內(nèi)，能對(duì)抗外來(lái)少量強(qiáng)酸、強(qiáng)堿在一定的范

8、圍內(nèi)，能對(duì)抗外來(lái)少量強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或稍加稀釋不引起溶液或稍加稀釋不引起溶液PHPH發(fā)生明顯變化的作用叫發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。能夠抵制外界的酸或堿的對(duì)溶液的能夠抵制外界的酸或堿的對(duì)溶液的PHPH值的影值的影響，維持響，維持PHPH基本不變?；静蛔??；A(chǔ)知識(shí)（二緩沖溶液基礎(chǔ)知識(shí)（二緩沖溶液3 3、緩沖溶液配制、緩沖溶液配制 通常由通常由1 12 2種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同PHPH范圍內(nèi)范圍內(nèi)使用的緩沖液。使用的緩

9、沖液。弱酸和弱酸鹽組合弱酸和弱酸鹽組合4 4、緩沖溶液的組分分類、緩沖溶液的組分分類基礎(chǔ)知識(shí)（二緩沖溶液基礎(chǔ)知識(shí)（二緩沖溶液弱堿和弱堿鹽弱堿和弱堿鹽多元弱酸的酸式鹽和其他所對(duì)應(yīng)的次級(jí)鹽多元弱酸的酸式鹽和其他所對(duì)應(yīng)的次級(jí)鹽思索：思索： 你認(rèn)為在血紅蛋白整個(gè)實(shí)驗(yàn)中用的緩沖液是什你認(rèn)為在血紅蛋白整個(gè)實(shí)驗(yàn)中用的緩沖液是什么？么？ 它的目的是什么？它的目的是什么？ 使用的是磷酸緩沖液，目的是利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)使用的是磷酸緩沖液，目的是利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的的PHPH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察( (紅色紅色) )和科學(xué)研究和科學(xué)研究( (活性

10、活性) )?；A(chǔ)知識(shí)（二緩沖溶液基礎(chǔ)知識(shí)（二緩沖溶液 生物體內(nèi)進(jìn)行的各種生物化學(xué)反應(yīng)都是在一定的生物體內(nèi)進(jìn)行的各種生物化學(xué)反應(yīng)都是在一定的pH下進(jìn)行的，為了能夠在實(shí)驗(yàn)室條件下準(zhǔn)確模擬生物體內(nèi)的下進(jìn)行的，為了能夠在實(shí)驗(yàn)室條件下準(zhǔn)確模擬生物體內(nèi)的過(guò)程，就必須保持體外的過(guò)程，就必須保持體外的pH與體內(nèi)的基本一致。因此，與體內(nèi)的基本一致。因此，緩沖溶液的正確配制和緩沖溶液的正確配制和pH的準(zhǔn)確測(cè)定，在生物化學(xué)的研的準(zhǔn)確測(cè)定，在生物化學(xué)的研究工作中有著極其重要的意義。究工作中有著極其重要的意義。問(wèn)：在生物化學(xué)的研究工作，為什么要正確配制緩沖溶液?jiǎn)枺涸谏锘瘜W(xué)的研究工作，為什么要正確配制緩沖溶液和準(zhǔn)確測(cè)定

11、緩沖溶液的和準(zhǔn)確測(cè)定緩沖溶液的pH？閱讀第閱讀第65頁(yè)的相關(guān)內(nèi)容，回答以下問(wèn)題：頁(yè)的相關(guān)內(nèi)容，回答以下問(wèn)題： 1、電泳的概念；、電泳的概念； 2、電泳的原理；、電泳的原理； 3、電泳的種類；、電泳的種類； 4、SDS的作用。的作用?；A(chǔ)知識(shí)（三電泳基礎(chǔ)知識(shí)（三電泳1 1、概念、概念帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。2 2、原理、原理 許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的離的基團(tuán)，在一定的PHPH下，這些基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電。下，這些基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電?；A(chǔ)知識(shí)（三電泳基礎(chǔ)知識(shí)（三電

12、泳 在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。相反的電極移動(dòng)。 電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀的不同使帶電分子產(chǎn)生不同的遷及分子本身的大小，形狀的不同使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。3 3、電泳的類型、電泳的類型瓊脂糖凝膠電泳、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳。基礎(chǔ)知識(shí)（三電泳基礎(chǔ)知識(shí)（三電泳 原理：許多重要的生物大分子，如原理：許多重要的生物大分子，如（ ）

13、等都具有）等都具有( ) 在在( )下，這些基團(tuán)會(huì)帶上下，這些基團(tuán)會(huì)帶上（ ） 。在電場(chǎng)的作用下，這些。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其（帶電分子會(huì)向著與其（ ） 挪動(dòng)。電泳利用了待分離樣品中各種分子挪動(dòng)。電泳利用了待分離樣品中各種分子（ ）以及分子本身）以及分子本身（ ）、（）、（ ）的不同使帶電分）的不同使帶電分子產(chǎn)生不同的（子產(chǎn)生不同的（ ），從而實(shí)現(xiàn)），從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。樣品中各種分子的分離。多肽、核酸多肽、核酸可解離的基團(tuán)可解離的基團(tuán)正電或負(fù)電正電或負(fù)電所帶電荷相反的電極所帶電荷相反的電極帶電性質(zhì)的差異帶電性質(zhì)的差異大小大小形狀的形狀的遷移速度遷移速度一定的一定的P

14、H基礎(chǔ)知識(shí)（三電泳基礎(chǔ)知識(shí)（三電泳 十二烷基磺酸鈉十二烷基磺酸鈉SDSSDS）聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N-N,N-甲叉雙丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。結(jié)構(gòu)的凝膠。測(cè)定蛋白質(zhì)分子量。測(cè)定蛋白質(zhì)分子量。蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶靜電荷的多少以及分子的大小等因素。它所帶靜電荷的多少以及分子的大小等因素。原理原理基礎(chǔ)知識(shí)（三電泳基礎(chǔ)知識(shí)（三電泳4 4、實(shí)例、實(shí)例 SDS SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。

15、由幾條肽鏈組能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體在成的蛋白質(zhì)復(fù)合體在SDSSDS的作用下會(huì)解聚成單條肽的作用下會(huì)解聚成單條肽鏈，因此測(cè)定的結(jié)果只是單條肽鏈的分子量。鏈，因此測(cè)定的結(jié)果只是單條肽鏈的分子量。SDSSDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)SDSSDS復(fù)合物，復(fù)合物，SDSSDS所所帶負(fù)電荷的量大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有電荷量。帶負(fù)電荷的量大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有電荷量。因而掩蓋了不同種電荷間的電荷差別，使電泳遷因而掩蓋了不同種電荷間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。移率完全取決于分子的大小。 SDS SDS作用機(jī)理作用機(jī)理為了消除靜電荷對(duì)遷移

16、率的影響可以在凝膠中加入為了消除靜電荷對(duì)遷移率的影響可以在凝膠中加入SDSSDS。基礎(chǔ)知識(shí)（三電泳基礎(chǔ)知識(shí)（三電泳為了消除靜電荷對(duì)遷移率的影響可以在凝膠為了消除靜電荷對(duì)遷移率的影響可以在凝膠中加入中加入( )。SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體在由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體在SDS的作用的作用下會(huì)解聚成單條肽鏈，因此測(cè)定的結(jié)果只是下會(huì)解聚成單條肽鏈，因此測(cè)定的結(jié)果只是( )。SDS能與各種蛋白質(zhì)能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物，復(fù)合物，SDS所帶負(fù)電荷的所帶負(fù)電荷的量大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有電荷量。因而量大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有電荷

17、量。因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于遷移率完全取決于( )。 蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶靜電荷的多少以及分子的大小等因素。它所帶靜電荷的多少以及分子的大小等因素。SDS單條肽鏈的分子量單條肽鏈的分子量分子的大小分子的大小實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作閱讀課本相關(guān)內(nèi)容，思考以下問(wèn)題：閱讀課本相關(guān)內(nèi)容，思考以下問(wèn)題： 1、蛋白質(zhì)的提取和分離一般分成幾步？、蛋白質(zhì)的提取和分離一般分成幾步？ 2、樣品怎樣處理？、樣品怎樣處理？ 3、蛋白質(zhì)怎樣分離？、蛋白質(zhì)怎樣分離？實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作（一樣品處理（一

18、樣品處理樣品處理樣品處理粗分離粗分離純化純化純度鑒定純度鑒定問(wèn)：蛋白質(zhì)提取和分離步驟？問(wèn)：蛋白質(zhì)提取和分離步驟？實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 （一樣品處理（一樣品處理 血液由血漿和各種血細(xì)胞組成，其中紅細(xì)胞最多。在紅細(xì)胞的血液由血漿和各種血細(xì)胞組成，其中紅細(xì)胞最多。在紅細(xì)胞的組成中，約組成中，約9090是血紅蛋白。血紅蛋白由四個(gè)肽鏈組成是血紅蛋白。血紅蛋白由四個(gè)肽鏈組成( (如圖如圖) )，包，包括兩個(gè)括兩個(gè)-肽鏈和兩個(gè)肽鏈和兩個(gè)-肽鏈。其中每條肽鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵血紅素肽鏈。其中每條肽鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)，此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分了二氧化碳。血紅蛋白因含有基團(tuán)，此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分了二氧化碳。血

19、紅蛋白因含有血紅素而呈現(xiàn)紅色。血紅素而呈現(xiàn)紅色。實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 （一樣品處理（一樣品處理 每個(gè)肽鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)，此基團(tuán)每個(gè)肽鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)，此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色含有血紅素而呈紅色血紅蛋白組成及作用血紅蛋白組成及作用選材選材 本課題可選用豬、牛、羊或其他脊椎動(dòng)物的本課題可選用豬、牛、羊或其他脊椎動(dòng)物的血液來(lái)分離血紅蛋白。血液來(lái)分離血紅蛋白。實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 （一樣品處理（一樣品處理1 1、紅細(xì)胞的洗滌、紅細(xì)胞的洗滌 閱讀課本內(nèi)容，回答以下問(wèn)題：閱讀課本內(nèi)容，回答以下問(wèn)題： 1、洗滌的目的

20、？、洗滌的目的？ 2、怎樣洗滌？、怎樣洗滌？ 3、洗滌干凈的標(biāo)志是什么？、洗滌干凈的標(biāo)志是什么？1 1 除去其中的雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化。除去其中的雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化。 2 2 采樣分離吸漿倒紅加液攪拌重洗三次采樣分離吸漿倒紅加液攪拌重洗三次3 直至上清液中沒有黃色，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。直至上清液中沒有黃色，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 （一樣品處理（一樣品處理1 1、速度越高和時(shí)間越長(zhǎng)會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等一同沉、速度越高和時(shí)間越長(zhǎng)會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等一同沉淀達(dá)不到分離的效果。淀達(dá)不到分離的效果。問(wèn)：?jiǎn)枺? 1、洗滌操作過(guò)程中，為什么要低速短時(shí)間

21、離心？、洗滌操作過(guò)程中，為什么要低速短時(shí)間離心？2 2、為了使紅細(xì)胞洗滌干凈，需如何處理？、為了使紅細(xì)胞洗滌干凈，需如何處理？3 3、用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為、用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.90.9的氯化鈉溶液洗滌，的氯化鈉溶液洗滌，能否用蒸餾水或濃度高的氯化鈉溶液？為什么？能否用蒸餾水或濃度高的氯化鈉溶液？為什么？1 1、紅細(xì)胞的洗滌、紅細(xì)胞的洗滌2 2、重復(fù)洗滌三次，直至上清液中沒有黃色，表明紅細(xì)胞、重復(fù)洗滌三次，直至上清液中沒有黃色，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。已洗滌干凈。 實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 （一樣品處理（一樣品處理 紅細(xì)胞的洗滌紅細(xì)胞的洗滌 洗滌紅細(xì)胞的目的是去除雜洗滌紅細(xì)胞的目的是去除雜蛋白，以利于后續(xù)步驟的分離純

22、化。采集的血樣要蛋白，以利于后續(xù)步驟的分離純化。采集的血樣要及時(shí)分離紅細(xì)胞，分離時(shí)采用低速短時(shí)間離心，如及時(shí)分離紅細(xì)胞，分離時(shí)采用低速短時(shí)間離心，如500 rrain離心離心2min，然后用膠頭吸管吸出上層，然后用膠頭吸管吸出上層透明的黃色血漿，將下層暗紅色的紅細(xì)胞液體倒入透明的黃色血漿，將下層暗紅色的紅細(xì)胞液體倒入燒杯，再加入五倍體積的生理鹽水燒杯，再加入五倍體積的生理鹽水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9的的NaCl溶液溶液)，緩慢攪拌，緩慢攪拌10min，低速短時(shí)間離，低速短時(shí)間離心，如此重復(fù)洗滌三次，直至上清液中沒有黃色，心，如此重復(fù)洗滌三次，直至上清液中沒有黃色，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。表明

23、紅細(xì)胞已洗滌干凈。 1.1.紅細(xì)胞的洗滌紅細(xì)胞的洗滌實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 （一樣品處理（一樣品處理2.2.血紅蛋白的釋放血紅蛋白的釋放 血紅蛋白的釋放血紅蛋白的釋放 將洗滌好的紅細(xì)胞倒入燒杯中，將洗滌好的紅細(xì)胞倒入燒杯中，加蒸餾水到原血液的體積，再加加蒸餾水到原血液的體積，再加40體積的甲苯，置于磁體積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢枇嚢杵魃铣浞謹(jǐn)嚢?0 min。在蒸餾水和甲苯的作用下，。在蒸餾水和甲苯的作用下，紅細(xì)胞破裂，釋放出血紅蛋白。紅細(xì)胞破裂，釋放出血紅蛋白。 說(shuō)出：蒸餾水和甲苯的作用。說(shuō)出：蒸餾水和甲苯的作用。實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 （一樣品處理（一樣品處理3.3.分離血紅蛋白溶液分離血紅蛋

24、白溶液 分離血紅蛋白溶液分離血紅蛋白溶液 將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到離心將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到離心管中，以管中，以2000 rmin的速度離心的速度離心10min后，可以明顯看后，可以明顯看到試管中的溶液分為到試管中的溶液分為4層。從上往下數(shù)，第層。從上往下數(shù)，第1層為無(wú)色透明層為無(wú)色透明的甲苯層，第的甲苯層，第2層為白色薄層固體，是脂溶性物質(zhì)的沉淀層為白色薄層固體，是脂溶性物質(zhì)的沉淀層，第層，第3層是紅色透明液體，這是血紅蛋白的水溶液，第層是紅色透明液體，這是血紅蛋白的水溶液，第4層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。將試管中的液體用濾紙過(guò)層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。將試管中的液體用濾紙過(guò)濾，除去脂溶性沉

25、淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。下層的紅色透明液體。問(wèn)：?jiǎn)枺? 1、采用什么方法分離血紅蛋白？、采用什么方法分離血紅蛋白？2 2、離心分層后，各層的成分各是什么？、離心分層后，各層的成分各是什么？3 3、用濾紙過(guò)濾，去掉什么成分？、用濾紙過(guò)濾，去掉什么成分？實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 （一樣品處理（一樣品處理 取取1mL1mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有盛有300mL300mL的物質(zhì)的量濃度為的物質(zhì)的量濃度為20mmol/L20mmol/L的磷酸緩沖液的磷酸緩沖液中中pHpH為

26、為7.07.0），透析），透析12h12h。4.4.透析透析問(wèn)：透析過(guò)程及透析目的？問(wèn)：透析過(guò)程及透析目的？透析目的是：除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)。透析目的是：除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)。闡明：透析袋是一種半透膜，能使小分子自由進(jìn)出，而大闡明：透析袋是一種半透膜，能使小分子自由進(jìn)出，而大分分 子不能通過(guò)。子不能通過(guò)。思索：根據(jù)材料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：現(xiàn)有燒杯一只、透析袋一思索：根據(jù)材料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：現(xiàn)有燒杯一只、透析袋一個(gè)、碘液、淀粉溶液、鐵架臺(tái)一個(gè)、棉線若干。探究碘液、個(gè)、碘液、淀粉溶液、鐵架臺(tái)一個(gè)、棉線若干。探究碘液、淀粉是否能通過(guò)透析袋。寫出實(shí)驗(yàn)步驟和結(jié)果預(yù)測(cè)。淀粉是否能通過(guò)透析袋。寫出實(shí)驗(yàn)步

27、驟和結(jié)果預(yù)測(cè)。實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 （一樣品處理（一樣品處理4.4.透析透析實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 （一樣品處理（一樣品處理 閱讀課本相關(guān)內(nèi)容，了解凝膠色譜的操作過(guò)程。閱讀課本相關(guān)內(nèi)容，了解凝膠色譜的操作過(guò)程。實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 （二凝膠色譜操作（二凝膠色譜操作實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 （二凝膠色譜操作（二凝膠色譜操作本卷須知：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的本卷須知：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會(huì)導(dǎo)致液體殘留，蛋凹穴底面，否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會(huì)導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。白質(zhì)分離不徹底。2凝膠色譜柱的裝填凝膠色譜柱的裝填 裝柱前要將色譜柱垂直固定在支裝柱

28、前要將色譜柱垂直固定在支架上。因?yàn)楦傻哪z和用緩沖液平衡好的凝膠的體積差別架上。因?yàn)楦傻哪z和用緩沖液平衡好的凝膠的體積差別很大，因此裝柱前需要根據(jù)色譜柱的內(nèi)體積計(jì)算所需要的很大，因此裝柱前需要根據(jù)色譜柱的內(nèi)體積計(jì)算所需要的凝膠量。本實(shí)驗(yàn)使用的是交聯(lián)葡聚糖凝膠。凝膠量。本實(shí)驗(yàn)使用的是交聯(lián)葡聚糖凝膠?！癎表示凝表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍，膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍，75表示凝膠得水值，表示凝膠得水值，即每克凝膠膨脹時(shí)吸水即每克凝膠膨脹時(shí)吸水7.59。凝膠用蒸餾水充分溶脹后，。凝膠用蒸餾水充分溶脹后，配成凝膠懸浮液，在與色譜柱下端連接的尼龍管打開的情配成凝膠懸浮液，在與色譜柱下端

29、連接的尼龍管打開的情況下，況下， 一次性緩慢倒入色譜柱內(nèi)，裝填時(shí)可輕輕敲動(dòng)色一次性緩慢倒入色譜柱內(nèi)，裝填時(shí)可輕輕敲動(dòng)色譜柱，使凝膠裝填均勻。注意色譜柱內(nèi)不能有氣泡存在，譜柱，使凝膠裝填均勻。注意色譜柱內(nèi)不能有氣泡存在，一旦發(fā)現(xiàn)有氣泡，必須重裝。裝填完后，立即連接緩沖液一旦發(fā)現(xiàn)有氣泡，必須重裝。裝填完后，立即連接緩沖液洗脫瓶，在約洗脫瓶，在約50 cm高的操作壓下，用高的操作壓下，用300 mL的物質(zhì)的的物質(zhì)的量濃度為量濃度為20 mmolL的磷酸緩沖液的磷酸緩沖液(pH為為7.0)充分洗滌平充分洗滌平衡凝膠衡凝膠12 h，使凝膠裝填緊密。，使凝膠裝填緊密。 實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 （二凝膠色譜操作（

30、二凝膠色譜操作2.2.凝膠色譜柱的裝填凝膠色譜柱的裝填問(wèn)問(wèn):1:1、凝膠的選擇材料、凝膠的選擇材料? G? G代表意義代表意義? ? 2 2、簡(jiǎn)單步驟、簡(jiǎn)單步驟? ? 3 3、注意點(diǎn)：、注意點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 （二凝膠色譜操作（二凝膠色譜操作選擇交聯(lián)葡聚糖凝膠選擇交聯(lián)葡聚糖凝膠G-75G-75） “G G表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍, 75, 75表表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時(shí)吸水示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時(shí)吸水7.57.5克?？?。固定色譜柱配凝膠懸液裝填色譜柱洗滌平衡固定色譜柱配凝膠懸液裝填色譜柱洗滌平衡3.3.凝膠裝填時(shí)盡量緊密，

31、以降凝膠裝填時(shí)盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙；低凝膠顆粒之間的空隙； 裝裝填凝膠柱時(shí)不得氣泡存在。填凝膠柱時(shí)不得氣泡存在。（因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋（因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。）果。）2.2.凝膠色譜柱的裝填凝膠色譜柱的裝填實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 （二凝膠色譜操作（二凝膠色譜操作問(wèn)問(wèn):1:1、凝膠的選擇材料、凝膠的選擇材料? G? G代表意義代表意義? ? 2 2、簡(jiǎn)單步驟、簡(jiǎn)單步驟? ? 3 3、注意點(diǎn)：、注意點(diǎn)： 裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm50cm高的操作高的操作壓下，用壓下，用300mL

32、300mL的的20mmol/L20mmol/L的磷酸緩沖液的磷酸緩沖液pHpH為為7.07.0充分充分洗滌平衡洗滌平衡12h12h。問(wèn)：洗滌平衡的溶液？注意什么？問(wèn)：洗滌平衡的溶液？注意什么？1 1、液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響、液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果；液體在柱內(nèi)的流動(dòng)與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果；2 2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 （二凝膠色譜操作（二凝膠色譜操作2.2.凝膠色譜柱的裝填凝膠色譜柱的裝填3.樣品的加入和洗脫樣品的加入

33、和洗脫 加樣前，打開色譜柱下端加樣前，打開色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。用吸管小心地將凝膠面平齊，關(guān)閉出口。用吸管小心地將1mL透透析后的樣品加到色譜柱的頂端析后的樣品加到色譜柱的頂端(圖圖5-22)，注意不要，注意不要破壞凝膠面。加樣后，打開下端出口，使樣品滲入破壞凝膠面。加樣后，打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)。等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出凝膠床內(nèi)。等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。小心加入物質(zhì)的量濃度為口。小心加入物質(zhì)的量濃度為20 mmolL的磷酸的磷酸緩沖液緩沖液(pH為為7.0)到適

34、當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口，進(jìn)行洗脫。待紅色的蛋白質(zhì)接近色打開下端出口，進(jìn)行洗脫。待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每5 mL收集一收集一管，連續(xù)收集管，連續(xù)收集(圖圖521)。實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 （二凝膠色譜操作（二凝膠色譜操作3.3.樣品加入與洗脫樣品加入與洗脫調(diào)節(jié)緩沖液面調(diào)節(jié)緩沖液面滴加透析樣品滴加透析樣品 吸管吸吸管吸1mL1mL樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時(shí)，吸樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣，同時(shí)注意不要破壞凝膠面。管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣，同時(shí)注意不要破壞凝膠面。 加樣前，打開色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面加樣前，打開色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。上的緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 （二凝膠色譜操作（二凝膠色譜操作樣品滲入凝膠床樣品滲入凝膠床 加樣后，打開下端出口，使樣