乳酸菌的分離培養(yǎng)0001

1、乳酸菌的別離培養(yǎng)保加利亞乳桿菌組長(zhǎng)：組員：實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?.學(xué)習(xí)并掌握普通光學(xué)顯微鏡油鏡的使用技術(shù)及微生物形態(tài)觀察；2 .學(xué)習(xí)微生物制片、染色的根本技術(shù)，掌握乳酸菌的簡(jiǎn)單染色法及無(wú)菌操作接種技術(shù)；3 .通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基的配制， 了解配制培養(yǎng)基的一般步驟和方法，掌握微生物實(shí)驗(yàn)常用的器皿的清洗與包扎、培養(yǎng)基的制備、消毒火菌。4 .了解各種滅菌的根本原理和應(yīng)用范圍，以及實(shí)驗(yàn)室中常用的滅菌方法。5 .了解酸奶中乳酸菌別離原理，觀察乳酸菌的根本形態(tài)，掌握用顯微鏡測(cè)微尺測(cè)量微生物細(xì)胞大小、數(shù)目 的測(cè)定的方法。6 .了解稀釋平板計(jì)數(shù)的原理，熟練掌握混合平板培養(yǎng)法。明確顯微鏡計(jì)數(shù)的原理并學(xué)習(xí)使用血球計(jì)數(shù)板 進(jìn)行微生物

2、計(jì)數(shù)的方法。7 .初步學(xué)會(huì)乳酸菌培養(yǎng)的根本技術(shù)，了解并掌握細(xì)菌鑒定中常用生理生化反響的原理和方法，掌握進(jìn) 行微生物大分子水解試驗(yàn)的原理和方法。8 .了解并掌握微生物菌種保藏的常用方法及其優(yōu)缺點(diǎn)，并了解不同微生物對(duì)不同的生物大分子的分解利 用情況，認(rèn)識(shí)微生物代謝類型的多樣性。實(shí)驗(yàn)原理：乳酸菌指發(fā)酵糖類主要產(chǎn)物為乳酸的一類無(wú)芽抱、革蘭氏染色陽(yáng)性細(xì)菌的總稱，本實(shí)驗(yàn)中用革蘭氏染色法進(jìn)行染色，革蘭氏染色法是根據(jù)細(xì)菌細(xì)胞壁成分不同，脫色效果不同從而可以將細(xì)菌區(qū)分為G+和G-菌。通過(guò)革蘭氏染色以及形態(tài)學(xué)觀察，乳酸菌呈紫色，為革蘭氏陽(yáng)性菌；乳酸菌應(yīng)為乳桿菌 和乳球菌的混合體。酸奶中含有乳酸菌，而且目前市場(chǎng)上銷

3、售的酸奶中通常含有雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、 嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌四種菌。細(xì)菌及其它一些微生物的大小，通常用測(cè)微計(jì)來(lái)測(cè)量，測(cè)微計(jì)分 接目測(cè)微計(jì)與鏡臺(tái)測(cè)微計(jì)；培養(yǎng)基是按照微生物生長(zhǎng)發(fā)育的需要，用不同組份的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)調(diào)制而成的營(yíng) 養(yǎng)基質(zhì)；滅菌是用物理或化學(xué)的方法來(lái)殺死或除去物品上或環(huán)境中的所有微生物，包括芽抱；自然條件 下，微生物常以群落狀態(tài)存在，這種群落往往是不同種類微生物的混合體，為了研究某種微生物的特性 或者要大量培養(yǎng)或者使用某種微生物，必須從這些混雜的微生物群落中獲得純培養(yǎng)，這些獲得純培養(yǎng)的 方法稱為微生物的別離和純化。用生化試驗(yàn)的方法檢測(cè)細(xì)菌對(duì)各種基質(zhì)的代謝作用及其代謝產(chǎn)物，從而 鑒別細(xì)

4、菌的種屬，稱之為細(xì)菌的生化反響。實(shí)驗(yàn)器材：樣品：含乳酸菌的酸奶 培養(yǎng)基： 改進(jìn)MRS固體培養(yǎng)基蛋白月東 5g 牛肉膏 5g乙酸鈉 K2HPO4 1g瓊脂 MgSO 4 7H2O儀器用品：500ml燒杯一個(gè)250ml容量三角瓶2個(gè)酵母提取物MnSO 4 - 4H2OCaCO3 5g100ml量筒一個(gè)5ml無(wú)菌移液管檸檬酸二鏤1g 水500mL吐溫80葡萄糖10g。無(wú)菌培養(yǎng)皿12個(gè)1ml無(wú)菌移液管6只15ml試管7只高壓滅菌鍋天平水浴鍋一個(gè)玻根旋渦均勻器f鏡臺(tái)測(cè)微尺電磁爐一個(gè)棉花紗布目鏡測(cè)微尺牛皮紙麻繩接種環(huán)一個(gè)蓋玻片酒精燈一盞牛角匙pH試紙血球計(jì)數(shù)板載玻片假設(shè)干恒溫培養(yǎng)箱酸度計(jì)擦鏡紙、吸水紙液體

5、石蠟顯微鏡載玻片玻片架、洗瓶、酒精燈火柴、滴管藥品：結(jié)晶紫，乙醇，草酸鏤，碘，碘化鉀，番紅，KOH , NaCl ,10% NaOH , 2% 氯化鐵。藥品配制結(jié)晶紫：結(jié)晶紫乙醇飽和液結(jié)晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中20ml , 1g草酸鏤于蒸儲(chǔ)水100ml。將兩液混勻即成。盧戈氏碘液：碘1g,碘化鉀2g,蒸儲(chǔ)水300ml。先將碘化鉀溶于少量蒸儲(chǔ)水中，然后參加碘使之完全溶解，再參加蒸儲(chǔ)水 300ml即成。蕃紅溶液：番紅，95%乙醇100ml ,溶解后存于密閉的棕色瓶中。用時(shí)取 10ml與80ml蒸儲(chǔ)水混勻即可。0.1%的呂氏美藍(lán)染液：A液：美藍(lán)，95%乙醇300ml; B液：0.01% K

6、OH 100ml 。混合A和B液即成， 按1: 100稀釋即可。生理鹽水：稱取氯化鈉，溶解在少量蒸儲(chǔ)水中，稀釋到 100毫升。實(shí)驗(yàn)步驟:一、 培養(yǎng)基的培養(yǎng)1 .稱量 用天平稱取蛋白月東 1g,牛肉膏1g，酵母提取物 0.5g，檸檬酸二鏤 g,乙酸鈉0.5g K2HPO4 g, MnSO 4 - 4H2O 0.025g, MgSO 4 - 7H2O 0.06g , 葡萄糖 2g , 吐溫 80 0.1mL , CaCO3 1g放入燒杯。2 .溶解 向上述燒杯中參加蒸儲(chǔ)水 50 mL無(wú)菌水，用玻璃棒攪勻后，放到酒精燈上加熱 ，在石棉網(wǎng)上加 熱溶解后，參加瓊脂，并繼續(xù)用微火加熱。在瓊脂溶化的過(guò)程中，

7、要控制火力的大小，并且不斷攪拌，以免培養(yǎng)基溢出或燒焦。待瓊脂完全溶化后，補(bǔ)加蒸儲(chǔ)水至100mL。3 .調(diào)節(jié)pH 用滴管逐滴滴入1mol/L的NaOH溶液，邊滴邊攪拌，并隨時(shí)用精密的pH試紙測(cè)pH,直到左右O4 .過(guò)濾 要趁熱用四層紗布過(guò)濾5 .培養(yǎng)基的分裝將培養(yǎng)基趁熱分裝到 2個(gè)三角瓶里（一半為宜）。注意：分裝時(shí)不要將培養(yǎng)基沾在管口和試管上段，以免引起污染。6 .加棉塞 培養(yǎng)基分裝完畢以后，在管口上加一個(gè)棉塞。棉塞能防止雜菌污染，保證通氣良好。加棉塞 時(shí)，應(yīng)使棉塞長(zhǎng)度的 2/3在試管口內(nèi)。7 .包扎 在管口外面包上一層牛皮紙，然后，用線繩扎好。在每捆試管外掛上標(biāo)簽，注明培養(yǎng)基名稱、 配制日期和

8、制作者姓名二、滅菌1 .翻開(kāi)高壓蒸汽滅菌鍋，將里面的滅菌桶取出，向鍋內(nèi)加水（最好用開(kāi)水）,水面與底架平齊為宜直至高水位燈亮起。2 .將扎好的試管管口向上豎放在滅菌桶內(nèi)，再將滅菌桶放回滅菌鍋。注意：滅菌桶內(nèi)的物品不能放得太擠，否那么會(huì)影響滅菌效果。3 .加蓋，并將排氣軟管插入滅菌桶的排氣槽內(nèi)。以兩兩對(duì)稱的方式，同時(shí)旋緊相對(duì)的兩個(gè)緊固螺栓，以防漏氣同時(shí)關(guān)閉滅菌鍋上方的平安閥，翻開(kāi)排氣閥，使水沸騰時(shí)得以排除鍋內(nèi)的冷空氣。4 .設(shè)置滅菌溫度和時(shí)間。溫度為 121c,20分鐘滅菌5 .排出鍋內(nèi)的冷空氣，關(guān)上排氣閥，讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升，當(dāng)鍋內(nèi)的壓力上升到 98kPa時(shí)，控制火力大小，使壓

9、力維持在98kPa左右20min。6 .滅菌所需時(shí)間到后，切斷電源，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當(dāng)壓力表的壓力將至0時(shí)，翻開(kāi)排氣閥，旋開(kāi)蓋子，取出滅菌物品。三、無(wú)菌檢查將取出的滅菌培養(yǎng)基放入 37 C溫箱保溫培養(yǎng)24小時(shí)，經(jīng)檢查假設(shè)無(wú)雜菌生長(zhǎng)，即可待用。四、菌懸液的配制先將酸奶樣品攪拌均勻，用無(wú)菌移液管吸取樣品10ml參加盛有90ml無(wú)菌水的三角瓶中，在旋渦均勻器上充分振搖20分鐘，使樣品均勻分散。用一支 1ml無(wú)菌吸管從中吸取1ml酸奶懸液注入9ml無(wú)菌水的 試管中，吹息三次，使充分混勻。然后再用一支1ml無(wú)菌吸管從此試管中吸取1ml注入另一盛有9ml無(wú)菌水的試管中，以此類推制成10-1、10-

10、2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7各種稀釋度的菌懸液要取 7只15ml試管。五、倒平板取無(wú)菌平板12個(gè)，編號(hào)標(biāo)明10-1、10-5、10-6、10-7各三套；將經(jīng)高溫消毒的培養(yǎng)基冷卻到50c左右，按無(wú)菌操作法倒12只平板，每皿約15ml;平置使培養(yǎng)基均勻分布在皿底，待凝固。六、別離方法A.涂布平板法用三支1ml無(wú)菌吸管分別吸取 10-5、10-6和10-7的稀釋菌懸液各1ml,對(duì)號(hào)接種于與之對(duì)應(yīng)的 3個(gè)無(wú) 菌平板中，每個(gè)平皿放 0.2ml ;盡快用無(wú)菌玻璃涂棒將菌液在平板上涂布均勻，平放與試驗(yàn)臺(tái)上20 Min；然后倒置于40 c恒溫箱中培養(yǎng) 48小時(shí)。B.平板劃線1、劃線在近

11、火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環(huán)，按無(wú)菌操作對(duì)標(biāo)有1。的3個(gè)平板進(jìn)行劃操作。常用的劃線方法有；(a)用接種環(huán)以無(wú)菌操作挑取菌液一環(huán)，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第一次平行劃線3-4條，再轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約 70。角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過(guò)第一次劃線局部做第二次平行劃 線，再用同法通過(guò)第二次平行劃線局部做第三次平行劃線和通過(guò)第三次平行劃線局部作第四次平行劃線。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置于放在40 c恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48小時(shí)。b將挑取有樣品的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基上作連續(xù)劃線。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置于放在40 c恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48小時(shí)。C.稀釋混合平板法先分別吸取1ml的10-5、10-6

12、、10-7稀釋度的菌懸液對(duì)號(hào)放入平板中，然后再倒入經(jīng)高溫消毒的并冷卻到50 c左右培養(yǎng)基中，邊倒入邊搖勻，使樣品中的微生物與培養(yǎng)基混合均勻，到冷凝成平板后，倒置于40 C恒溫箱中培養(yǎng)48小時(shí)。七、菌落特征的觀察恒溫培養(yǎng)48小時(shí)過(guò)后，取出培養(yǎng)平板；選擇菌落分布較好的平板，先對(duì)其菌落形態(tài)如菌落的大小、外 表狀況、透明度、色澤、邊緣、隆起度、透光性、是否分泌色素等特點(diǎn)進(jìn)行觀察，初步找出乳酸菌菌 落。乳酸菌的菌落很小，大約 13 mm ,園形隆起，外表光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黃色；在 產(chǎn)酸菌落周圍還能產(chǎn)生 CaCO 3的溶解圈。八、乳酸菌的形態(tài)觀察及保加利亞乳桿菌的形態(tài)觀察一普通光學(xué)顯微鏡的

13、使用1 .取鏡 從顯微鏡箱中取出顯微鏡時(shí)，用一手握鏡臂，一手托鏡座，直立移動(dòng)，輕放在平穩(wěn)的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上， 使用前首先要熟悉顯微鏡的結(jié)構(gòu)和性能，檢查各部零件是否齊全，鏡頭是否清潔，做好必要地清潔和調(diào) 整工作。2 .調(diào)節(jié)光照1）用粗調(diào)節(jié)器提升鏡筒，將低倍物鏡旋到鏡筒下方，使鏡頭和載物臺(tái)距離約為5mm左右。2）上升聚光器，使之與載物臺(tái)外表相距1毫米左右。3）插上電源，開(kāi)開(kāi)電源開(kāi)關(guān)。左眼看目鏡調(diào)節(jié)反光鏡鏡面角度在天然的光線下觀察，一般用平面反 鏡；假設(shè)以燈光為光源，那么一般多用凹面反光鏡。4） 開(kāi)閉光圈，調(diào)節(jié)光線強(qiáng)弱，直至視野內(nèi)得到最均勻最適宜的光度為止。3 .低倍鏡觀察1）將載片標(biāo)本涂面朝上置于載物臺(tái)的

14、標(biāo)本夾上，并將標(biāo)本部位處于物鏡的正下方，轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)器， 使鏡頭下降至鏡面距離檢視物大約5mm處。2）然后以左眼看目鏡，另一眼睜開(kāi)，一邊觀察視野，一邊扭動(dòng)粗調(diào)節(jié)器使鏡頭緩慢地升高，至視野內(nèi) 出現(xiàn)物像后，改用細(xì)調(diào)節(jié)器上下微微轉(zhuǎn)動(dòng)，仔細(xì)調(diào)節(jié)焦距和照明，直至視野內(nèi)獲得清晰的物像，選 擇適宜部位，移到視野中心。3）移動(dòng)推動(dòng)器，換高倍鏡觀察。4 .高倍鏡觀察 將高倍物鏡轉(zhuǎn)至鏡筒下方，調(diào)節(jié)光圈和聚光鏡， 使光線亮度適中，再仔細(xì)反復(fù)轉(zhuǎn)動(dòng)微調(diào)螺旋，調(diào)節(jié)焦距，獲得清晰物象，再移動(dòng)推動(dòng)器選擇最滿意的鏡檢部位將染色標(biāo)本移至視野中央，待油鏡 觀察。5 .油鏡觀察1）先用粗調(diào)節(jié)旋鈕將鏡筒提升或?qū)⑤d物臺(tái)下降約 2cm ,轉(zhuǎn)

15、動(dòng)轉(zhuǎn)換器將油鏡轉(zhuǎn)至鏡筒正下方。在玻片標(biāo)本的鏡檢部位滴上一滴香柏油。從側(cè)面注視，用粗調(diào)節(jié)旋鈕將載物臺(tái)緩緩地上升，使油浸物鏡浸入香柏油中，使鏡頭幾乎與標(biāo)本接觸。2）左眼看目鏡，右手反時(shí)針?lè)较蛭⑽⑥D(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)螺旋，下將載物臺(tái)，當(dāng)視野中有模糊地標(biāo)本物象時(shí)，改 用細(xì)調(diào)螺旋，并移動(dòng)標(biāo)本直至標(biāo)本物象清晰為止。3）觀察完畢，下降載物臺(tái)，將油鏡頭轉(zhuǎn)出，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，再用擦擦鏡紙蘸少許二甲苯 或乙醛酒精混合液乙醛 2份，純酒精3份，擦去鏡頭上殘留油跡，最后再用擦鏡紙擦拭23下即可，注意向一個(gè)方向擦拭。4）將各局部復(fù)原：下降載物臺(tái)最低處；轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器，使物鏡鏡頭轉(zhuǎn)成八字形，再向下旋轉(zhuǎn)至最低 處；將調(diào)節(jié)光源

16、亮度的旋鈕最小化；關(guān)掉電源；用柔軟紗布清潔載物臺(tái)等機(jī)械局部，放好顯微鏡， 蓋上罩。如果是自然采光顯微鏡，降下聚光器，反光鏡與聚光器垂直。6 .換片另?yè)Q新的標(biāo)本片，必須從第三條開(kāi)始操作。7 .用后必須清潔、復(fù)原觀察完畢，上旋鏡筒，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，然后再用擦鏡紙沾取少許二甲苯香柏油溶于二甲苯擦去鏡頭上的殘留油跡，最后再用擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。機(jī)械部件用 細(xì)軟布擦去灰塵和冷凝水，下降鏡筒，將接物鏡轉(zhuǎn)成八字形置于載物臺(tái)上。下降聚光鏡，切勿使接物 鏡與聚光鏡相碰受損，反光鏡垂直于鏡座。放進(jìn)顯微鏡箱中鎖好，并放入指定的面微鏡柜中。二鏡檢革蘭氏染色方法1 .涂片 取干凈載玻片一塊， 在載玻片中央

17、加一滴蒸儲(chǔ)水，將培養(yǎng)的乳酸菌作涂片 注意涂片切不可過(guò)于濃厚，枯燥、固定。固定時(shí)通過(guò)火焰12次即可，不可過(guò)熱，以載玻片不燙手為宜。2 .染色（1）初染 加草酸俊結(jié)晶紫染色液一滴，約 1 2分鐘，傾去染色液，用自來(lái)水小心地沖洗。（2）媒染滴加盧哥氏碘液沖去殘水，并覆蓋約1 一 2分鐘，水洗。（3）脫色 將載玻片上面的水甩凈，并襯以白背景，用95 %酒精滴洗至流出酒精剛剛不出現(xiàn)紫色時(shí)為止，約20 30秒鐘，立即用水沖凈酒精，以終止脫色。(4)復(fù)染 滴加番紅液，染色 2 3分鐘，水洗。最后用吸水紙輕輕吸干。(5)鏡檢枯燥后，置油鏡觀察。革蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色。以分散開(kāi)的乳酸菌的革蘭 氏

18、染色反響為準(zhǔn)，過(guò)于密集的細(xì)菌，常常呈假陽(yáng)性。其中保加利亞乳桿菌呈桿狀，成單桿、或雙桿菌或 長(zhǎng)絲狀；嗜熱鏈球菌，呈球狀，成對(duì)、或短鏈、或長(zhǎng)鏈狀。十、保加利亞乳桿菌的細(xì)胞大小測(cè)定1、目鏡測(cè)微尺的校正把目鏡的上透鏡旋下，將目鏡測(cè)微尺的刻度朝下輕輕地裝入目鏡的隔板上，把鏡臺(tái)測(cè)微尺置于載物臺(tái)上，刻度朝上。先用低倍鏡觀察，對(duì)準(zhǔn)焦距，視野中看清鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度后， 轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡，使目鏡測(cè)微尺與鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度平行，移動(dòng)推動(dòng)器，使兩尺重疊，再使兩尺的“(MU度完全重合，定位后，仔細(xì)尋找兩尺第二個(gè)完全重合的刻度，計(jì)數(shù)兩重合刻度之間目鏡測(cè)微尺的格數(shù)和鏡臺(tái)測(cè) 微尺的格數(shù)。因?yàn)殓R臺(tái)測(cè)微尺的刻度每格長(zhǎng)10 pm,所以由以下

19、公式可以算出目鏡測(cè)微尺每格所代表的長(zhǎng)度。例如目鏡測(cè)微尺5小格正好與鏡臺(tái)測(cè)微尺 5小格重疊，鏡臺(tái)測(cè)微尺每小格為10 mi,那么目鏡測(cè)微尺上每小格長(zhǎng)度為=5X 10 dm/5= 10 dm鏡臺(tái)蒯微尺格數(shù)x 10目鏡泅微尺的每格長(zhǎng)度(卬)目鏡測(cè)微尺格數(shù)2、菌體大小的測(cè)定取下鏡臺(tái)測(cè)微尺，將保加利亞乳桿菌染色標(biāo)本片置于載物臺(tái)上，先在低倍鏡和高倍鏡下找到目的物。然后在高倍鏡下轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡測(cè)微尺，測(cè)出保加利亞乳桿菌的長(zhǎng)和寬各占幾格缺乏一 格的局部估計(jì)到小數(shù)點(diǎn)后一位，測(cè)出的格數(shù)乘上目鏡測(cè)微尺每格的長(zhǎng)度，即等于該菌的大小。同法在 油鏡下轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡測(cè)微尺測(cè)出保加利亞乳桿菌的長(zhǎng)和寬各占幾格缺乏一格的局部估計(jì)到小數(shù)點(diǎn)后一位

20、， 測(cè)出的格數(shù)乘上目鏡測(cè)微尺每格的長(zhǎng)度，即等于該菌的大小。例如目鏡測(cè)微尺在顯微鏡下經(jīng)過(guò)校正，當(dāng)使用油鏡時(shí)，每格相當(dāng)于1.3 pm。如果測(cè)量菌體的長(zhǎng)度相當(dāng)于目鏡測(cè)微尺的兩格，那么菌體長(zhǎng)度應(yīng)為1.3 mx 2 = 2.6一般測(cè)定微生物細(xì)胞大小時(shí)，通常測(cè)量10 20個(gè)菌體左右，求出平均值，才能代表該菌的大小。用最大和最小的數(shù)值來(lái)表示菌體大小的范圍。例如長(zhǎng)為35(im ,寬為12dm ,那么其大小為l2X35(im。3、取出目鏡測(cè)微尺，將接目鏡放回鏡筒，再將目鏡測(cè)微尺和鏡臺(tái)測(cè)微尺分別再用擦鏡紙擦拭后，放回 盒內(nèi)保存。二血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)保加利亞乳桿菌的數(shù)量如圖-血球計(jì)數(shù)板構(gòu)造上：俯視圖中間平

21、臺(tái)分為兩半，各刻有一個(gè)方格網(wǎng)下：側(cè)面圖中間平臺(tái)與蓋玻片之間有高度為的間隙血球計(jì)數(shù)板通常是一塊特制的厚載玻片，載玻片上有四條槽而構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)圖5-2。中間的平臺(tái)較寬，其中間又被一短橫槽而隔成兩半，每個(gè)半邊上面各刻有一個(gè)方格網(wǎng)。每個(gè)方格網(wǎng)共分9大格其中間的1大格又稱為計(jì)數(shù)室，微生物的計(jì)數(shù)就在此大格中進(jìn)行。常用的血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室有兩種規(guī)格的刻度網(wǎng)格。一種是一個(gè)大方格分成 16個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成 25個(gè)小方格，即為16X25。另 種是一個(gè)大方格分成 25個(gè)中方格而每個(gè)中方格又分成 16個(gè)小方格，即25X16。但是不管計(jì)數(shù)室是哪種 規(guī)格，其計(jì)數(shù)室的小格數(shù)總是相同的，即 16X25= 25X1

22、6= 400 小格，見(jiàn)以下圖。圖-計(jì)數(shù)網(wǎng)的區(qū)分與分格每一個(gè)大方格邊長(zhǎng)為lmm、那么每一大方格面積為lmm2。蓋上蓋玻片后，載玻片計(jì)數(shù)室與蓋被片之 間的高度為，所以每個(gè)計(jì)數(shù)室大方格的體積為3。在計(jì)數(shù)時(shí)，通常數(shù) 5個(gè)中方格的總菌數(shù)，求得平均值。再乘上16或25就得一大方格中的總菌數(shù)。然后再換算成1mL菌液中的總菌數(shù)。1mL = 1cm3 = 1 000mm3操作步驟如下：1、取培養(yǎng)后的保加利亞乳桿菌液振蕩混勻，加無(wú)菌水適當(dāng)稀釋斜面一般稀釋到10-2。稀釋度選擇以小方格中的分布的菌體清晰可數(shù)為宜。一般以每小格內(nèi)含45個(gè)菌體的稀釋度為宜。2 .取清潔無(wú)油的血球計(jì)數(shù)板，在計(jì)數(shù)室上面加蓋玻片。3 .將保加

23、利亞乳桿菌液搖勻，用滴管吸取少許，從計(jì)數(shù)板中間平臺(tái)兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣滴入一 小滴不宜過(guò)多，使菌液沿兩玻片間自行滲入計(jì)數(shù)室，勿使產(chǎn)生氣泡，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌液。也可以將菌液直接滴加在計(jì)數(shù)室上，然后加蓋蓋玻片勿使產(chǎn)生氣泡。4 .靜置5min后，將血球計(jì)數(shù)板置于顯微鏡載物臺(tái)上，先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)板的大方格網(wǎng)位置。尋找時(shí)光圈要縮小，光線要偏暗些，并將計(jì)數(shù)室移至視野中央。5 .計(jì)數(shù)時(shí)用由16中格的計(jì)數(shù)板，要按對(duì)角線方位，數(shù)左上、左下、右上、右下的 4個(gè)中格即100小 格的保加利亞乳卞f菌數(shù)。如果是25個(gè)大方格組成的計(jì)數(shù)區(qū)，除數(shù)上述四個(gè)格外，還需數(shù)中央l個(gè)中格的保加利亞乳桿菌菌數(shù)即80個(gè)小格。由于菌體在計(jì)數(shù)室中處于不同的空間位置，要在不同的焦距下才能看到，因而觀察時(shí)必須不斷調(diào)節(jié)微調(diào)如菌體位于大方格的雙線上，計(jì)數(shù)時(shí)那么數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線，以減少誤差。6 .在高倍鏡下計(jì)數(shù)：隨機(jī)地計(jì)數(shù)5個(gè)中格內(nèi)的菌數(shù)，然后求得每個(gè)中格的平均值。乘上16或25就得出1大