熒光定量PCR儀選擇要點(diǎn)

1、熒光定量PCR儀選擇要點(diǎn)熒光定量PCR因操作方便、運(yùn)行速度快、實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確，受到越來 越多的分子生物學(xué)研究者青睞。在實(shí)驗(yàn)技術(shù)成熟的今天，也許對(duì)你來 說，最難得不是實(shí)驗(yàn)技術(shù)上的問題 一一而是選擇哪一種熒光定量PCR儀一一你要征詢實(shí)驗(yàn)室成員的意見、分析實(shí)驗(yàn)室目前乃至將來 的需求、平衡實(shí)驗(yàn)室的預(yù)算，更要詳細(xì)研究各種極富誘惑力的宣傳資 料。面對(duì)各種不同性能的產(chǎn)品，您又該如何選擇呢？首先建議大家走出認(rèn)識(shí)熒光定量PCR的兩個(gè)誤區(qū)：誤區(qū)一：儀器通道越多越好隨著PCR技術(shù)的成熟運(yùn)用，多重?cái)U(kuò)增越來越熱鬧，熒光定量PCR儀也不能幸免。從最初ABI公司推出的單通道熒光定量PCR儀開展 到如今各個(gè)廠家都推出4通道、5

2、通道甚至6通道熒光定量PCR儀, 眼花繚亂的選擇讓人無(wú)所適從，就有人一不小心走進(jìn)了通道越多越好的誤區(qū)。在使用有些廠家5通道的熒光定量?jī)x時(shí)，為了確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精 確性和準(zhǔn)確性都要在實(shí)驗(yàn)中使用ROX一種熒光染料或?qū)Ｓ玫腞eferencedye,這些熒光染料都必須單獨(dú)使用一個(gè)檢測(cè)通道。這樣 以來，真正能檢測(cè)多重PCR熒光信號(hào)的有效通道只有4個(gè)，而且使 用校正染料可能會(huì)增加后期的使用本錢。有的熒光定量PCR的檢測(cè)通道是只為白已廠家的專用的熒光染料或試劑開放的， 有效檢測(cè)通道 也絕非像宣傳資料中宣稱的那么多。在購(gòu)置前確認(rèn)熒光定量PCR儀器的有效檢測(cè)通道尤為重要，不能單單只聽宣傳?？紤]多重?zé)晒舛縋CR的

3、通道數(shù)的時(shí)候也應(yīng)該從實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情 況出發(fā)，多重PCR并非人人適用、人人可用，因?yàn)樗箤?shí)驗(yàn)復(fù)雜化 了。誤區(qū)二：real-time PCR儀無(wú)需梯度功能對(duì)于使用染料法的定量PCR反響，雖然有各種各樣的PCR引物設(shè) 計(jì)軟件或者經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算熔解溫度Tm值，但運(yùn)用的公式不同、 引物序列不同，Tm值的差異會(huì)很大。引物的熔解溫度決定了退火溫 度。而且模版中堿基的組合千變?nèi)f化，對(duì)于特殊片斷，經(jīng)驗(yàn)公式得到 的數(shù)據(jù)不一定能得出準(zhǔn)確的結(jié)果， 退火溫度細(xì)微的差異對(duì)結(jié)果都可能 產(chǎn)生決定性的影響， 因而 摸條件一度是讓人很頭疼的問題。梯度PCR的出現(xiàn)局部解決了一些問題 一一在反響過程中每個(gè)孔的溫度控 制條件可以在指定范圍

4、內(nèi)按照梯度變化，根據(jù)結(jié)果，一步就可以摸索出最適合的反響條件。不單退火溫度，連變性溫度和延伸溫度都可以優(yōu)化 一一對(duì)于多種 聚合酶混合酶擴(kuò)增如Invitrogen、Clontech、Promega的多數(shù)高保真Taq酶來說這個(gè)非常重要，因?yàn)門aq和校正酶的最正確反響溫度可能 有顯著差異，優(yōu)化延伸溫度就顯得很重要。使用有梯度功能的熒光定量PCR可以一次完成以往屢次實(shí)驗(yàn)才 能完成的優(yōu)化過程，簡(jiǎn)化了摸索PCR反響條件的繁瑣實(shí)驗(yàn)，既節(jié)省 實(shí)驗(yàn)時(shí)間提高效率，又節(jié)省實(shí)驗(yàn)本錢。當(dāng)我們走出誤區(qū)，想要選擇一款最適合白己需求的熒光定量PCR儀時(shí)我們又該關(guān)注些什么呢？1、 儀器的檢測(cè)通量在購(gòu)置定量PCR儀的時(shí)候要根據(jù)實(shí)驗(yàn)

5、實(shí)的需要來選擇不同通量的儀 器。目前市面上的熒光定量PCR的檢測(cè)通量小到16個(gè)多到384個(gè)。如果進(jìn)行一般的基因表達(dá)研究或病原體檢測(cè)，實(shí)在不必購(gòu)置昂貴的儀 器，96孔的通量足夠用；需要尋找要新藥靶點(diǎn)和疾病標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)室 可以考慮購(gòu)置384孔板的儀器。假設(shè)經(jīng)費(fèi)有限無(wú)法購(gòu)置384孔板儀 器的實(shí)驗(yàn)室，可以考慮購(gòu)置運(yùn)行速度快帶有FAST模塊的96孔 板熒光定量PCR儀。有了高通量的儀器，你會(huì)發(fā)現(xiàn)樣品的制備和小 體系、多樣本的PCR體系構(gòu)建成為限制實(shí)驗(yàn)速度和結(jié)果的頸瓶。Roche公司推出的MagnaPure核算純化系統(tǒng)可配合Roche的Lightcycyler熒光定量PCR儀使用。Eppendorf的ep

6、Motion5070、5075全白開工作站，即可解決核酸純化問題，又可進(jìn)行96孔板、384孔板的PCR反響體系構(gòu)建，不用加樣加到眼發(fā)黑、手抽筋。2、硬件設(shè)計(jì)特點(diǎn)熒光定量PCR儀主要有傳統(tǒng)的96孔板式、創(chuàng)新的離心式等，每種 設(shè)計(jì)都有它的獨(dú)到之處但也都有無(wú)法防止的缺憾。傳統(tǒng)的96孔板的熒光定量PCR可以容納的樣本量大，而且無(wú)需特 殊的耗材。有些傳統(tǒng)的96孔板的儀器采用鹵鴇燈激發(fā)、CCD檢測(cè)，這些光學(xué)結(jié)構(gòu)在96孔板的頂部，每個(gè)樣品孔距光源和檢測(cè)器的光程 各不相同一一邊緣效應(yīng)，對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。為了保證精確、準(zhǔn)確的實(shí) 驗(yàn)結(jié)果，這類儀器在實(shí)驗(yàn)過程中通常會(huì)使用ROX一種熒光染料或?qū)Ｓ玫腞eference d

7、ye作為參照校正實(shí)驗(yàn)結(jié)果。鹵鴇燈的使用壽命 短、更換本錢較高已經(jīng)成為很多用戶頭痛的問題。在實(shí)驗(yàn)過程中鹵鴇 燈作為一種熱光源，產(chǎn)生較多熱能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定的影響。CCD最大的優(yōu)點(diǎn)就是可以同時(shí)掃描所有樣品中的熒光信號(hào)，但是靈敏度較 低，而且同時(shí)檢測(cè)樣品間的熒光信號(hào)存在干擾。像ABI、Bio-rad公 司生產(chǎn)的熒光定量PCR就屬于這一種。但Bio-rad的IQ系列熒光定 量PCR帶有梯度功能。創(chuàng)新的離心式的儀器通常選用LED激發(fā)、PMT檢測(cè)，離心式的 設(shè)計(jì)上防止了邊緣效應(yīng)。LED光源是冷光源對(duì)實(shí)驗(yàn)沒有影響，因此 無(wú)需采用其他熒光染料校正儀器，而且使用壽命長(zhǎng)無(wú)需經(jīng)常更換。PMT每次只能收集單個(gè)熒光信號(hào)

8、，但是檢測(cè)靈敏度高。但這類儀器 運(yùn)行速度非?？欤泊嬖跇颖玖啃?、耗材昂貴、沒有梯度功能、存 在時(shí)間積分等缺點(diǎn)。Corbett的Rotor-gene系列和Roche的Lightcycler系列均為這一類儀器。隨著熒光定量PCR技術(shù)的使用，聰明的儀器生產(chǎn)商紛紛在傳統(tǒng) 的96孔板儀器上大作改良。首先是Stratagene的Mx3000p在檢測(cè) 上突破了使用CCD改用PMT檢測(cè)熒光信號(hào)，大大提高了實(shí)驗(yàn)的靈 敏度，但激發(fā)光源仍然沿用傳統(tǒng)的鹵鴇燈并且沒有梯度功能。Eppendorf公司推出的Mastercycler ep realplex是- -款帶有梯度功 能的熒光定量PCR儀，使用了96個(gè)LED為激

9、發(fā)光源，采用先進(jìn)的CPM第二代PMT及96合一光纖為檢測(cè)系統(tǒng)，不但防止了邊緣 效應(yīng)還保證所有樣品間的熒光信號(hào)沒有干擾。3、運(yùn)行速度在熒光定量PCR儀的眾多技術(shù)參數(shù)中，升降溫速度也是廠家喜 歡大力宣傳的指標(biāo)。更快的升降溫，可以縮短反響進(jìn)行的時(shí)間，而且 縮短了可能的非特異性結(jié)合、反響的時(shí)間，提高PCR的特異性。為 了更好的完成實(shí)驗(yàn)，各個(gè)廠家紛紛推出能快速運(yùn)行的熒光定量PCR儀。例如ROCHE推出的Lightcycler2.0利用空氣動(dòng)力學(xué)原理，可在 半小時(shí)左右完成30-40個(gè)循環(huán)。ABI的7500可以選配FAST模塊擁 有5 C/秒的升降溫速度，可在40分鐘左右完成30-40個(gè)循環(huán)。最近eppen

10、dorf新推出的Mastercycler ep realplex4S和2S的銀質(zhì)模塊 熒光定量PCR儀，升降溫的速度可到達(dá)6C/秒和4.5/秒，是目前同 類產(chǎn)品中升降溫速度最快的熒光定量PCR儀。一個(gè)在其他儀器上原 本需要40 60分鐘的PCR反響，eppendorfMastercycler ep realplex4S和2S銀質(zhì)模塊只需運(yùn)彳f 28分鐘別小看這節(jié)約下來的幾十分鐘，一天下來就可以多運(yùn)行好幾輪了。4、靈活性大規(guī)模繁忙的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備固然讓人羨慕，但是常規(guī)實(shí)驗(yàn)室同樣可 以有精彩的選擇?，F(xiàn)在的儀器供給商擁有眾多技術(shù)專家，有的還能提供整個(gè)分子生物學(xué)的根底研究平臺(tái)，不但了解、滿足您現(xiàn)在的需求， 而且還考慮到了你可能變化的需求 一一升級(jí)和更換模塊。Bio-rad的Mycycler就可以選擇模塊升級(jí)為定量PCR儀。ABI的7900可以選 擇將96孔槽變?yōu)?84孔槽。像離心式的雙通道的Rotor-gene3000A就可以根據(jù)您研究的需要升級(jí)成四通道的熒光定量PCR儀。Eppendorf公司在這方面考慮的