PCR檢測常見問題與解決途徑資料

1、PCR 檢測常見問題與解決途徑利用 PCR 方法檢測轉(zhuǎn)基因成分時 ，經(jīng)常出現(xiàn)假陽性 、假陰性 、非特異性擴增和涂抹帶。 尤其是假陽性和假陰性可使檢測結(jié)果得出錯誤結(jié)論 ，有時可造成嚴重后果。為了提高轉(zhuǎn)基因 檢測的準(zhǔn)確性和可靠性， PCR 檢測應(yīng)盡量減少假陽性、假陰性、非特異性擴增和涂抹帶現(xiàn) 象的發(fā)生。一個好的 PCR 方法不但要求特異性好、靈敏度高、還要求具有高的可重復(fù)性、 重現(xiàn)性、魯棒性，盡量減少假陽性、假陰性和非特異性擴增。本文對 PCR 檢測中出現(xiàn)的假陽性、假陰性、非特異性擴增和涂抹帶的原因及其解決方 法予以綜述。一、假陽性：（一）假陽性現(xiàn)象假陽性是指檢測陰性材料得到陽性結(jié)果。如果一次實驗

2、中的幾個陰性對照中出現(xiàn)一個 或幾個陽性結(jié)果 ，提示本次實驗中其它標(biāo)本的檢測結(jié)果可能有假陽性。 實驗中設(shè)立的陰性對 照可提示有無假陽性結(jié)果出現(xiàn)。（二）造成假陽性的原因1. 樣品間交叉污染：樣本污染主要有收集樣本的容器被污染，或樣本放置時，由于密 封不嚴溢于容器外，或容器外粘有樣本而造成相互間交叉污染；樣本核酸模板在提取過程 中，由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染；2. PCR 試劑的污染：主要是由于在 PCR 試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸 水及其它溶液被 PCR 核酸模板污染。3. PCR 擴增產(chǎn)物污染：這是 PCR 反應(yīng)中最主要最常見的污染問題。因為 PCR 產(chǎn)物拷 貝量大（一般為1013

3、拷貝/ml），遠遠高于PCR檢測數(shù)個拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可形成假陽性。4. 氣溶膠污染：在空氣與液體面摩 擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動 反應(yīng)管，開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計算一個氣溶 膠顆?？珊?48000 拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題。5. 實驗室中克隆質(zhì)粒的污染：由于克隆質(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高，另外在純化過 程中需用較多的用具及試劑，而且在活細胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具 有很強的生命力 ，其污染可能性也很大。 在分子生物學(xué)實驗室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對照 的檢驗室，這個問題比較常

4、見。（三）假陽性問題的試驗控制在每次 PCR 檢測時，一定設(shè)立陰性對照樣品和陽性對照樣品。陰性對照樣品檢測為陰 性時，表明試驗全部過程的試劑沒有受到污染；陽性對照樣品檢測為陽性時，表明DNA 提取（RNA提取、RNA反轉(zhuǎn)錄）、DNA擴增和電泳鑒定工作體系正常。在陰性對照樣品和 陽性對照樣品檢測結(jié)果成立的前提下，才能對檢測樣品進行判定。只有設(shè)立試驗全程的對 照，才能證明試驗結(jié)果成立。造成假陰性的原因可以通過設(shè)置試驗對照來查找。試驗對照包括：1、DNA 陽性對照：以含有目的片段的 DNA（ 或質(zhì)粒）作為模板進行擴增，證明 PCR 試劑是否有效、擴增過程是否正確及待測樣品中是否含有目的片段。 （注意

5、：陽性樣品擴增 效率高，應(yīng)嚴格控制，避免其成為潛在的污染源）。2、DNA 陰性對照：以不含有目的片段的陰性樣品作為模板進行擴增，用于證明擴增 過程中無假陽性現(xiàn)象。3、空白對照：以純水作為模板進行擴增，用于證明擴增過程中無假陽性現(xiàn)象。4、PCR 抑制物對照：在與陽性對照相同的反應(yīng)體系中，加入相同數(shù)量的待測樣品 DNA ，如果未擴增出目的片段，證明此待測樣品 DNA 中存在 PCR 抑制物。5、空白提取對照 ：空白提取對照擴增結(jié)果為陽性， 說明 DNA 提取試劑可能受到污染。6、陽性提取對照：陽性提取對照擴增結(jié)果為陰性，說明提取過程可能有誤。如果 DNA 陽性對照擴增結(jié)果為陰性 ，或者 DNA 陰

6、性對照和空白對照擴增結(jié)果為陽性 ， 則說明 PCR 試劑或擴增過程存在問題。（四）假陽性解決途徑由于 PCR 的敏感性和效率特別高，所以少量的擴增產(chǎn)物污染標(biāo)本或反應(yīng)管即可出現(xiàn) 假陽性 。尤其是 PCR 擴增產(chǎn)物和質(zhì)粒分子很容易造成實驗室的污染 ，導(dǎo)致假陽性現(xiàn)象發(fā)生。1、規(guī)范實驗室設(shè)計實驗室設(shè)置上分配液區(qū)、 DNA 提取區(qū)、擴增區(qū)、電泳區(qū)。物流應(yīng)按分配液區(qū)、模板提 取區(qū)、擴增區(qū)、電泳區(qū)順序，嚴禁倒流。在連續(xù)而獨立的空間中完成不同實驗步驟。不同工 作區(qū)域相互隔離，通過傳遞倉傳遞。PCR 前處理區(qū)（樣品制備室、 DNA 提取室）和 PCR 準(zhǔn)備室設(shè)置正壓通風(fēng)系統(tǒng)，并設(shè) 置通風(fēng)柜或生物反應(yīng)柜造成局部負

7、壓；后 PCR 室（ PCR 室及電泳室為高度污染區(qū)） 設(shè)置負 壓通風(fēng)系統(tǒng)，防止大量游離分子及氣溶膠，對其它區(qū)域造成環(huán)境污染。配制 PCR 反應(yīng)體系（配備冰箱及生物安全柜，此實驗室要求無模板 DNA 存在）和向 PCR 反應(yīng)體系中加入模板 DNA （配備生物安全柜及冰箱）要求在不同區(qū)域進行。2、規(guī)范試劑耗材管理1）驗證：新購買的試劑需進行實驗前驗證；2）分裝：雙蒸水、引物和 dNTP 均應(yīng)分裝儲存，并標(biāo)明日期，以防污染；試劑的分裝 應(yīng)在裝有紫外燈的超凈工作臺上進行；試劑分裝成小份一次使用后棄去。3）消毒：除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。必要時，在加 樣本前，反應(yīng)管和試劑用

8、紫外線照射，以破壞存在的核酸。3、規(guī)范實驗室操作1）控制污染源： PCR 產(chǎn)物和質(zhì)粒操作空間是最大的污染源，應(yīng)嚴格防止將這個空間 的物品帶出；2）一次性用具：使用實驗服和一次性手套，使用帶有濾膜的移液器槍頭，一次性反應(yīng) 管和離心管；3）定期消毒：定期對實驗室進行紫外照射，用10% 漂白劑、 3雙氧水或?qū)Ｓ蒙虡I(yè)產(chǎn)品清理實驗室臺面及死角。4）定期通風(fēng)：對實驗室定期進行正壓、負壓通風(fēng)處理；5）小心操作：操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外；加樣 時，最后加陽性對照。4、技術(shù)處理1 ）在 DNA 模板和多聚酶加入前，紫外線照射反應(yīng)管內(nèi)容物以破壞污染的 PCR 產(chǎn) 物。一般選用波長

9、254nm 照射 30min （ Nature ， 1990 ， 34:27 ）；2）PCR 實驗中使用 dUTP ，而不用 dTTP 。在擴增前使用 UraciI N 一 g1ycosylase （尿嘧啶糖基化酶）處理可降解交叉污染的 PCR 產(chǎn)物，而不降解基困組 DNA 模板，然 后熱滅活此酶，再進行擴增反應(yīng)（Gene ，1990 ，93：125）。美國 PE 公司提供此類試劑盒；3）在 PCR 反應(yīng)前加入一種光化學(xué)試劑，反應(yīng)完成后激活該試劑，光化學(xué)試劑可交聯(lián) DNA 鏈，使之不能再擴增（ Nucleic Acids Res ，1991 ，19 ：99）。二、假陰性（一）假陰性現(xiàn)象與判斷方

10、法如果實驗中設(shè)置的陽性對照未能擴增成陽性結(jié)果，提示本次實驗中可能有假陰性結(jié) 果。但這里應(yīng)注意，許多國產(chǎn) PCR 試劑盒中陽性對照采用質(zhì)粒 DNA ，和標(biāo)本相比來說，不 需純化提取核酸的步驟，因此，如果在標(biāo)本核酸純化提取步驟有問題，即使陽性對照均呈陽 性，標(biāo)本檢測中還可能有假陰性。設(shè)置內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因?qū)φ帐桥袛嗉訇幮暂^好的指示系統(tǒng)。在每一反應(yīng)管中同時對內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基 因?qū)φ者M行擴增，若內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因?qū)φ瘴茨軘U增出來，說明該反應(yīng)管的結(jié)果可能有問題。（二）造成假陰性的原因1 儀器因素PCR 實驗對儀器的依賴性是很高的，離心機、擴增儀都是造成 PCR 假陰性的因素。 擴增儀的主要問題是孔間差，引起擴增失敗或擴增效率降

11、低。 而離心機的影響則更容易被忽 視。國內(nèi)使用離心機很少使用離心加速度（ XXXg ）作為參數(shù)指標(biāo)，而常使用轉(zhuǎn)數(shù)作為參數(shù) 指標(biāo)，這里就存在著一個問題，由于離心機的大小不同，有效跳心半徑也不相同，因此同樣 的轉(zhuǎn)速所產(chǎn)生的離心力相差很大 （有的在數(shù)倍以上 ），所以在相同的離心時間下，有可能模板 并沒有離心下來，造成 PCR 假陰性。這個問題在其他實驗也有，但因其他實驗都是測定大 分子蛋白沉淀， 對離心的速度要求較低所以不太明顯。建議使用小型臺式離心機的實驗要注 意一下這個問題。2 試劑質(zhì)量問題PCR 實驗的成功與否試劑的質(zhì)量至關(guān)重要，試劑的質(zhì)量問題涉及多個方面：細胞的裂 解；模板的抽提；引物位點的

12、選擇； Taq 酶的活性等等。其中任一環(huán)節(jié)出了問題都會引起結(jié) 果的假陰性。這些都是試劑質(zhì)量的問題，因此選用高質(zhì)量的 PCR 試劑非常重要。酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時忘加 Taq 酶或溴乙錠。引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是 PCR 失敗或擴增條 帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高， 一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：選定一個好的引物合成單位。引物的濃度不僅要看 OD 值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)， 而且兩引物帶的亮

13、度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR 有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要 平衡其濃度。 引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致 引物變質(zhì)降解失效。3 核酸模板問題1）模板中含有雜蛋白質(zhì)；2）模板中含有 Taq 酶抑制劑；3）模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白；4）在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚；5）模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過 程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。4、物理原因：

14、 PCR 儀控溫不準(zhǔn)，也是 PCR 失敗的原因之一。有時還有必要用標(biāo) 準(zhǔn)的溫度計，檢測一下擴增儀內(nèi)的變性、退火和延伸溫度。5、靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列 某段缺失使引物與模板失去互補序列，其 PCR 擴增是不會成功的。6 操作人員素質(zhì)問題PCR 實驗的環(huán)節(jié)很多，而且對每一環(huán)節(jié)的質(zhì)量要求都很高，例如少加、漏加試劑、離 心不充分、循環(huán)參數(shù)設(shè)計錯誤等等都能造成結(jié)果的假陰性。（三）假陰性問題的試驗控制在每次 PCR 檢測時，一定設(shè)立陰性對照樣品和陽性對照樣品。陰性對照樣品檢測為陰 性時，表明試驗全部過程的試劑沒有受到污染；陽性對照樣品檢測為陽性時，表明DN

15、A 提?。≧NA提取、RNA反轉(zhuǎn)錄）、DNA擴增和電泳鑒定工作體系正常。在陰性對照樣品和 陽性對照樣品檢測結(jié)果成立的前提下，才能對檢測樣品進行判定。造成假陰性的原因可以通過設(shè)置試驗對照來查找。試驗對照包括：1、DNA 陽性對照：以含有目的片段的 DNA（ 或質(zhì)粒）作為模板進行擴增，證明 PCR試劑是否有效、擴增過程是否正確及待測樣品中是否含有目的片段。（注意：陽性樣品擴增效率高，應(yīng)嚴格控制，避免其成為潛在的污染源）。2、DNA 陰性對照：以不含有目的片段的陰性樣品作為模板進行擴增，用于證明擴增 過程中無假陽性現(xiàn)象。3、空白對照：以純水作為模板進行擴增，用于證明擴增過程中無假陽性現(xiàn)象。4、PCR

16、 抑制物對照：在與陽性對照相同的反應(yīng)體系中，加入相同數(shù)量的待測樣品 DNA ，如果未擴增出目的片段，證明此待測樣品DNA 中存在 PCR 抑制物。5、空白提取對照 ：空白提取對照擴增結(jié)果為陽性， 說明 DNA 提取試劑可能受到污染。6、陽性提取對照：陽性提取對照擴增結(jié)果為陰性，說明提取過程可能有誤。如果 DNA 陽性對照擴增結(jié)果為陰性 ，或者 DNA 陰性對照和空白對照擴增結(jié)果為陽性 ， 則說明 PCR 試劑或擴增過程存在問題。（四）假陰性解決方案1反應(yīng)體系不靈敏： 1 ）檢查 PCR 試劑是否失效； 2 ）檢驗引物是否降解： 3）優(yōu)化 PCR 擴增體系與程序。2、PCR 反應(yīng)存在抑制物： （

17、1）稀釋模板 DNA ，進行擴增分析； （2）純化模板 DNA ， 除去蛋白質(zhì)、多酚、多糖等抑制物；（3）檢測 PCR 體系中是否含有擴增抑制物。3、DNA 提取失?。?1）選擇與優(yōu)化樣品 DNA 提取方法； 2）驗證 DNA 提取試劑是否 失效。三非特異擴增（一）現(xiàn)象PCR 擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，（二）原因：1. 引物設(shè)計與濃度問題引物設(shè)計：引物堿基的 G+C 含量以 40-60% 為宜， G+C 太少擴增效果不佳， G+C 過 多易出現(xiàn)非特異條帶。 ATGC 最好隨機分布，避免 5 個以上的嘌呤或嘧啶核

18、苷酸的成串排 列。避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補，特別是 3'端的互補，否則會形成引 物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。引物 3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴 格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致 PCR 失敗。引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它 序列無明顯同源性。引物濃度：每條引物的濃度 0.1lumol或10100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要 的結(jié)果為好 ，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增， 且可增加引物之間形成二聚體的機 會。2. Mg2+ 離子濃度過高：在一般的 PCR 反應(yīng)中，各種 dNTP 濃度為 200umol/L 時，Mg2+濃度

19、為1.52.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增， 濃度過低會降低 Taq DNA 聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。3. 退火溫度過低：變性后溫度快速冷卻至40 C60 C,可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板 DNA 比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機會遠遠高于模板互補鏈之間 的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55 C為選擇最適退火溫度的起點較為理想。 引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：Tm 值 （解鏈溫度 ）=4（G+C） 2（A+T）復(fù)性溫度=Tm值-

20、（510 C）在 Tm 值允許范圍內(nèi)， 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時間一般為3060sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。4. PCR 循環(huán)次數(shù)過多： 當(dāng)其它參數(shù)確定之后，循環(huán)次數(shù)主要取決于 DNA 濃度。一 般而言 25-30 輪循環(huán)已經(jīng)足夠。循環(huán)次數(shù)過多，會使 PCR 產(chǎn)物中非特異性產(chǎn)物大量增加。 通常經(jīng) 25-30 輪循環(huán)擴增后 ，反應(yīng)中 Taq DNA 聚合酶已經(jīng)不足 ， 如果此時產(chǎn)物量仍不夠 ， 需要進一步擴增，可將擴增的 DNA 樣品稀釋 103-105倍作為模板，重新加入各種反應(yīng)底物 進行擴增 ，這樣經(jīng) 60 輪循環(huán)后 ，

21、擴增水平可達 109-1010。擴增產(chǎn)物的量還與擴增效率有關(guān)， 擴增產(chǎn)物的量可用下列公式表示:C = Co（1+P） n。其中：C為擴增產(chǎn)物量,C0為起始DNA量, P 為增效率 , n 為循環(huán)次數(shù)。在擴增后期，由于產(chǎn)物積累，使原來呈指數(shù)擴增的反應(yīng)變 成平坦的曲線，產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升，這稱為平臺效應(yīng)。平臺期會使原先由于錯配 而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴增，達到較高水平。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)， 在平臺期前結(jié)束反應(yīng)，減少非特異性產(chǎn)物。5. 酶的質(zhì)和量，催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量 2.5U（指總反應(yīng)體積為100ul時）,濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。往

22、往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。四 PCR 擴增出現(xiàn)涂抹帶1、 原因：往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP 濃度過高， Mg2+ 濃度過高，退火 溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。2、對策：1）減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶；2）減少 dNTP 的濃度；3）適當(dāng)降低 Mg2+ 濃度；4）增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。五、標(biāo)準(zhǔn)問題轉(zhuǎn)基因成分檢測一般按照標(biāo)準(zhǔn)方法進行 ，引物和 PCR 反應(yīng)體系一般都經(jīng)過了嚴格的循 環(huán)驗證。有時標(biāo)準(zhǔn)方法可能存在問題 ，導(dǎo)致假陽性 、假陰性、非特異性擴增和涂抹帶的產(chǎn)生。 標(biāo)準(zhǔn)方法可能存在的問題有：1. 引物設(shè)計不合適 ：選

23、擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性 ，因而在進行 PCR 擴 增時，擴增出的 PCR 產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。2. Mg2+ 濃度不合理： Mg2+ 離子濃度對 PCR 擴增效率影響很大，濃度過高可降 低 PCR 擴增的特異性，濃度過低則影響 PCR 擴增產(chǎn)量甚至使 PCR 擴增失敗而不出擴 增條帶。3. 反應(yīng)體積的改變：通常進行 PCR 擴增采用的體積為 20ul 、 30ul 、 50ul ?；?100ul ，應(yīng)用多大體積進行 PCR 擴增，是根據(jù)檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如 20ul 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。4. PCR

24、溫度設(shè)置不合理：變性對 PCR 擴增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時間 短，極有可能出現(xiàn)假陰性；退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫 度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低 PCR 擴增效率。六、檢測極限問題當(dāng)樣品中轉(zhuǎn)基因成分很低時，反應(yīng)體系內(nèi)可能不含有擴增模版，因而容易造成假陰性結(jié)果。PCR理論檢測極限是在反應(yīng)體系中存在一個拷貝的目標(biāo)DNA分子，由于人的判讀能力限制和 PCR 效率等原因，定性檢測實際極限值一般是理論檢測極限值的 10-30 倍。也就 是說，如果轉(zhuǎn)基因成分低到檢測極限時，檢測不到轉(zhuǎn)基因成分的可能性會很大，或者說出現(xiàn) 假陰性的概率很大。 出現(xiàn)假陰性的原因是由于抽

25、樣誤差， 反應(yīng)體系中不存在有效擴增的模版 分子。此時是不適合做 PCR 檢測的。根據(jù)作物基因組的大小，可以計算出不同作物的理論檢測極限并估計出實際檢測極 限。例如在 100 微升的反應(yīng)體系中，小麥基因組有 0.58 萬個拷貝，一個轉(zhuǎn)基因拷貝的重量 比（理論檢測極限）是 0.0174% ，玉米的理論檢測極限是 0.003 ，其他作物的理論檢測極限 一般在 0.001%-0.01% 。如果反應(yīng)體系是 20 微升，理論檢測極限值將提高 5 倍，小麥為 0.085% ，玉米為 0.015% ， 其他作物將在 0.005-0.05% 之間。反應(yīng)體系是 20 微升的定性 檢測實際極限值一般是在 0.05-

26、0.5% 。低于這個含量時，反應(yīng)體系中有時不含擴增模版 DNA，因此很難得到正確的檢測結(jié)果。七 怎樣查找污染源如果不慎發(fā)生污染情況，應(yīng)從下面幾條出發(fā)，逐一分析，排除污染。（一）設(shè)立陰陽性對照：有利于監(jiān)測反應(yīng)體系各成分的污染情況。選擇陽性對照時，應(yīng)選擇擴增弱，且重復(fù)性好的樣品，因強陽性對照可產(chǎn)生大量不必要的擴增序列，反而可能 成為潛在的污染源。如果以含靶序列的重組質(zhì)粒為對照，100 個拷貝之內(nèi)的靶序列就足以產(chǎn)生陽性擴增。陰性對照的選擇亦要慎重，因為PCR 敏感性極高，可以從其它方法（Sourthern 印跡或點雜交等） 檢測陰性的標(biāo)本中檢測出極微量的靶分子。此外，每次擴增 均應(yīng)包括 PCR 體系

27、中各試劑的時機對照，即包括 PCR 反應(yīng)所需的全部成分，而不加模板 DNA，這對監(jiān)測試劑中 PCR產(chǎn)物殘留污染是非常有益的。如果擴增結(jié)果中試劑對照為陽性 結(jié)果，就是某一種或數(shù)種試劑被污染了。此時，要全部更換一批新的試劑進行擴增，擴增時 設(shè)立不同的反應(yīng)管，每一管含有一種被檢測試劑，在檢出污染試劑后，應(yīng)馬上處理。（二）環(huán)境污染：在排除試劑污染的可能性外，更換試劑后，若不久又發(fā)現(xiàn)試劑被污 染了，如果預(yù)防措施比較嚴密，則考慮可能為環(huán)境污染。環(huán)境污染中常見的污染源主要有：1. 模板提取時真空抽干裝置；2.凝膠電泳加樣器；3.電泳裝置；4.紫外分析儀；5.切膠用刀或手術(shù)刀片；6.離心機；7.冰箱門把手，冷

28、凍架，門把手或?qū)嶒炁_面等；此時可用擦拭實驗來查找可疑污染源：1）用無菌水浸泡過的滅菌棉簽擦拭可疑污染源；2）0.1ml去離子水浸泡；3）取5ml做PCR實驗；4 ）電泳檢測結(jié)果。8.氣溶膠。如果經(jīng)過上述追蹤實驗，仍不能查找到確切污染源，則污染可能是由空氣 中PCR產(chǎn)物的氣溶膠造成的，此時就應(yīng)該更換實驗場所，若條件不允許，則重新設(shè)計新的 引物（與原引物無相關(guān)性）。八.污染處理（一）環(huán)境污染1. 稀酸處理法：對可疑器具用 1mol/L鹽酸擦拭或浸泡，使殘余 DNA脫嘌呤；2. 紫外照射（UV）法：紫外波長（nm） 般選擇 254/300nm，照射30min即可。需要注意的是，選擇 UV作為消除殘留

29、PCR產(chǎn)物污染時，要考慮 PCR產(chǎn)物的長度與產(chǎn)物 序列中堿基的分布，UV照射僅對500bp以上長片段有效，對短片段效果不大。UV照射時，PCR產(chǎn)物中嘧啶堿基會形成二聚體，這些二聚體可使延伸終止，但并不是DNA鏈中所有嘧啶均能形成二聚體，且UV照射還可使二聚體斷裂。形成二聚體的程度取決于UV波長，嘧啶二聚體的類型及與二聚體位點相鄰核苷酸的序列。在受照射的長DNA鏈上，形成二聚體缺陷的數(shù)量少于 0.065/堿基，其他非二聚體的光照損傷（如環(huán)丁烷型嘧啶復(fù)合體，胸腺嘧啶乙二醇，DNA鏈間與鏈內(nèi)的交聯(lián)和 DNA斷裂等）均可終止 Taq DNA聚合酶的延 伸。這些位點的數(shù)量與二聚體位點相當(dāng)。如果這些位點（

30、0.13/堿基）在DNA分子上隨機分布，一個500bp片段的DNA分子鏈上將有32處損傷位點，那么，105個這樣的分子中 每個分子中會至少有一處損傷。相反，如果100bp的片段，每條鏈上僅有 6處損傷，105個拷貝分子中將有許多分子沒有任何損傷。這就是UV照射有一定的片段長度限制的原因 。（二）反應(yīng)液污染可采用下列方法之一處理：1. DNase I法：PCR混合液（未加模板和 Taq聚合酶）加入 0.5U DNase I，室溫反應(yīng)30min后加熱滅活，然后加入模板和Taq聚合酶進行正常 PCR擴增。該方法的優(yōu)點是不需要知道污染 DNA的序列；2. 內(nèi)切酶法：選擇識別 4個堿基的內(nèi)切酶（如 Ms

31、p I和Taq I等），可同時選擇幾種，以克服用一種酶只能識別特定序列的缺陷，室溫作用1h后加熱滅活進行 PCR ；3. 紫外照射法：未加模板和 Taq聚合酶的PCR混合液進行紫外照射，注意事項與方 法同上述UV照射法；4. g射線輻射法：1.5kGy的輻射可完全破壞 0.1 ng基因組DNA, 2.0 kGy可破壞104拷貝的質(zhì)粒分子，4.0 kGy仍不影響PCR，但高于此限度會使 PCR擴增效率下降。引物 可受照射而不影響 PCR , g射線是通過水的離子化產(chǎn)生自由基來破壞DNA的。（三）尿嘧啶糖苷酶（UNG ）法由于UV照射的去污染作用對 500bp以下的片段效果不好，而臨床用于檢測的PCR擴增片段通常為 300bp左右，因此UNG的預(yù)防作用日益受到重視和肯定。1.原理：在PCR產(chǎn)物或引物中用 dU代替dT。這種dU化的PCR產(chǎn)物與UNG 起孵育，因 UDG可裂解尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架間的N-糖基鍵，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，從而失去被再擴增的能力。UNG對不含dU的模板無任何影響。UNG可從單或雙鏈 DNA中消除尿嘧啶，而對 RNA中的尿嘧啶和單一尿嘧啶分