實驗二 特殊顯微鏡

1、實驗二 特殊顯微鏡一 實驗目的二 實驗原理三 實驗儀器、材料和試劑四 實驗內容與方法五 實驗報告實驗目的 1.了解和掌握相差顯微鏡、熒光顯微鏡、暗視野顯鏡的構造原理和使用方法 2.學習制造暗視野擋板實驗原理 1. 暗視野顯微鏡在構造上應用了光學上的丁達爾現(xiàn)象。和普通光學顯微鏡相比，它在聚光鏡中央有擋光片，使照明光線不直接進人物鏡，只允許被標本反射和衍射的光線進入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。利用這種顯微鏡能見到小至4-200nm的微粒子，分辨率可比普通顯微鏡高50倍，但是只能看到物體的存在和運動，不能辨清其結構。主要用來觀察活細胞中微粒的運動，觀察單細胞、硅藻、放線菌、細菌的線

2、狀結構如鞭毛和纖維等。 實驗原理 2. 光線通過比較透明的標本時，光的波長(顏色)和振幅(亮度)都沒有明顯的變化。因此用普通光學顯微鏡觀察未經染色的標本(如活的細胞)時，其形態(tài)和內部結構往往難以分辨。然而由于細胞各部分的折射率和厚度的不同，光線通過標本時，直射光和衍射光的光程就會有差別。隨著光程的增加或減少，加快或落后的光波的相位會產生相位差。光的相位差人的肉眼感覺不到，但相差顯微鏡能通過其特殊裝置安裝在聚光器中的環(huán)狀光闌和物鏡中的相板，利用光的干涉現(xiàn)象，將光線通過透明標本細節(jié)時所產生的光程差(即相位差)轉變?yōu)槿搜劭梢圆煊X的振幅差(明暗差)，從而使原來透明的物體表現(xiàn)出明顯的明暗差異，對比度增強

3、，能比較清楚的觀察到普通光學顯微鏡和暗視野顯微鏡下看不清的活細胞及細胞內的某些細微結構。 實驗原理 3.熒光顯微鏡是利用較短波長的紫外光照射標本，使樣品受到激發(fā)，產生較長波長的熒光，可以用來觀察和分析樣品中產生熒光的成分和結構、位置。細胞中有些物質，如葉綠素等，受紫外線照射后可自發(fā)熒光；另有一些物質本身雖不能發(fā)熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經紫外線照射亦可發(fā)熒光。 實驗儀器、材料和試劑 普通光學顯微鏡、相差顯微鏡、多功能顯微鏡、黑卡紙、圓規(guī)、剪刀、直尺、草履蟲、載玻片、蓋玻片、擦鏡紙、吸水紙、棉花等實驗內容與方法(一)暗視野顯微鏡1.構造原理實驗內容與方法2.使用注意事項(1)聚光器

4、與物鏡的數(shù)值孔徑應合理匹配，物鏡的數(shù)值孔徑必須小于聚光器的數(shù)值孔徑。(2)載玻片的適宜厚度應該在0.8-1.2mm。(3)載玻片和蓋玻片應清潔無傷痕，否則照明光線會在其處發(fā)生漫射而影響暗視野的照明。(4)照明光源的照明強度要高。若照明強度不夠，樣品的反射光強度不夠，會響觀察。實驗內容與方法3.暗視野擋板的制作(1)選擇要觀察的物鏡(2)轉動聚光器孔徑光闌調節(jié)環(huán)，使與相應倍數(shù)的物鏡相對應，對標本準焦。(3)從顯微鏡上卸下聚光器，用圓規(guī)量出孔徑光闌開孔的直徑，以上測直徑在相紙上繪一圓。 (4)再測量聚光器下方濾片支架的直徑。以上測直徑在相紙上作另一同心圓。 (5)在兩圓之間繪出三條連接的支架 ，用

5、剪刀剪下兩圓，放入濾片支架中。 (6)將聚光器安裝回顯微鏡，即得該物鏡的暗視野擋板 實驗內容與方法(二)相差顯微鏡1.構造原理(1)環(huán)狀光闌(2)相板a共軛面和補償面b吸收膜和相位膜C正（暗）反差和負（明）反差(3)合軸調節(jié)望遠鏡(4)綠色濾光片實驗內容與方法2.使用方法（1）根據(jù)觀察標本的性質及要求，挑選適合的相差物鏡。 （2）將標本片放到載物臺上。 （3）進行光軸中心的調整。 （4）取下一側目鏡，換上合軸調節(jié)望遠鏡，調整環(huán)狀光闌與相板上的共軛面圓環(huán)完全重疊吻合，然后取下合軸調節(jié)望遠鏡，換回目鏡。在使用中，如需要更換物鏡倍數(shù)時，必須重新進行環(huán)狀光闌與相板共軛面圓環(huán)吻合的調整。 （5）放上綠色

6、濾光片，即可進行鏡檢，鏡檢操作與普通光學顯微鏡方法相同。 實驗內容與方法3.使用注意事項（1）視場光闌與聚光器的孔徑光闌必須全部開大，而且光源要強。因環(huán)狀光闌遮掉大部分光，物鏡相板上共軛面又吸收大部分光。（2）環(huán)狀光闌要與相板相匹配（3）不同型號的光學部件不能互換使用。 （4）載玻片、蓋玻片的厚度應遵循標準，不能過薄或過厚。 （5）切片不能太厚，一般以510m為宜，否則會引起其他光學現(xiàn)象，影響成像質量。明視明視場場暗視暗視場場相差相差實驗內容與方法(三)熒光顯微鏡1.構造原理(1)光源：高壓汞燈(2)濾色鏡系統(tǒng)A激發(fā)濾色鏡B阻斷濾色鏡(3)分色鏡系統(tǒng) 二向色鏡實驗內容與方法2.使用注意事項(1)適應于不同的染色方法，要選擇相應的濾色鏡和分