免疫逃避型人胰島類器官改善糖尿病

1、免疫逃避型人胰島類器官改善糖尿病導(dǎo)讀干細(xì)胞來源的胰島有望成為治療胰島素依賴型糖尿病的有效策略，但仍面臨挑戰(zhàn)。本研究誘導(dǎo)多能干細(xì)胞產(chǎn)生人胰島類器官（HILO），驅(qū)動非經(jīng)典的WNT4信號促進(jìn)其代謝成熟。這些功能成熟的HILO包含內(nèi)分泌類細(xì)胞，且移植后可在糖尿病NOD / SCID小鼠中快速重建葡萄糖穩(wěn)態(tài)。PD-L1的過表達(dá)保護(hù)HILO異種移植，使它們能夠在具有免疫活性的糖尿病小鼠中復(fù)原葡萄糖穩(wěn)態(tài)達(dá)50天。此外，IFN-離體刺激可誘導(dǎo)內(nèi)源性PD-L1表達(dá)，并抑制T細(xì)胞活化和移植排斥。這類能夠逃避免疫檢測的葡萄糖反應(yīng)性胰島類器官的產(chǎn)生，為尸體和設(shè)備依賴的糖尿病治療提供了極具前景的替代方案。結(jié)果1

2、60;WNT4誘導(dǎo)HILOs的功能成熟胰島移植可為1型和2型晚期糖尿病患者提供長期有效的血糖，但尸體來源的胰島因質(zhì)量和可利用性而限制了其實用價值。盡管誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPS細(xì)胞）向胰島樣細(xì)胞的分化取得重大進(jìn)展，但產(chǎn)生適合于人類治療的功能性樣細(xì)胞仍待探究。研究者先前證明核雌激素相關(guān)受體（ERR）能夠驅(qū)動葡萄糖刺激下細(xì)胞胰島素分泌（GSIS）所必需的產(chǎn)后代謝成熟。ERR在iPS來源的樣細(xì)胞中的過表達(dá)足以實現(xiàn)體內(nèi)/外功能。為了產(chǎn)生適合移植的功能性細(xì)胞，研究者探索能夠復(fù)制細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及胰島細(xì)胞類型多樣性的培養(yǎng)條件。最初利用人類脂肪干細(xì)胞（hADSCs）和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）（分別模擬胰腺成

3、纖維細(xì)胞和胰腺內(nèi)皮細(xì)胞）在三維（3D）培養(yǎng)和多糖懸浮凝膠培養(yǎng)中形成器官和血管結(jié)構(gòu)的固有能力。在人類iPS細(xì)胞（hiPS細(xì)胞）衍生的內(nèi)分泌祖細(xì)胞分化過程中摻入hADSCs和HUVECs，可形成與人類胰島大小相當(dāng)?shù)亩嗉?xì)胞球體（MCSs）。與不存在hADSCs和HUVECs的情況相比，MCSs中ESRRG（編碼ERR）和線粒體基因NDUFA1和COX7A2的表達(dá)增加，這也與體外葡萄糖刺激后胰島素分泌升高有關(guān)。在鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病NOD / SCID小鼠中，移植到腎囊中的MCSs能夠維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)約40天，顯示出與人胰島移植相似的效果，且移植的MCSs仍對葡萄糖具有反應(yīng)性。這些結(jié)果均表明

4、3D多細(xì)胞相互作用在器官發(fā)生中具有重要作用。在hADSC自組裝過程中發(fā)生的轉(zhuǎn)錄變化基因本體（GO）分析顯示富集的代謝和細(xì)胞因子信號以及WNT信號途徑。在小鼠胰島的產(chǎn)后功能成熟過程中WNT4的表達(dá)增強，并且非經(jīng)典的WNT途徑可誘導(dǎo)人胰島的細(xì)胞成熟并增加GSIS，此外，WNT4在人類胰島中高度表達(dá)。人類胰島的單細(xì)胞測序表明WNT4在和細(xì)胞中的廣泛表達(dá)?；诖?，研究者認(rèn)為WNT信號傳導(dǎo)足以支持iPS細(xì)胞衍生的離體樣細(xì)胞的功能成熟。為此，利用CRISPRCas9生成顯示內(nèi)源胰島素啟動子活性的報告基因。在3D培養(yǎng)系統(tǒng)中對這些改造的hiPS細(xì)胞進(jìn)行分化，并在最后的成熟步驟中摻入WNT4，可誘導(dǎo)表達(dá)胰島素的

5、人胰島類器官（HILO）的形成（圖1a，b）。此外 HILOs高表達(dá)尿皮質(zhì)激素-3（UCN3）和胰島素。電子顯微鏡顯示HILO與人類胰島結(jié)構(gòu)相似，最重要的是胰島素和胰高血糖素顆粒的存在（圖1c）。比較轉(zhuǎn)錄分析顯示W(wǎng)NT4處理的HILO（wHILO）和人類胰島中多個關(guān)鍵胰島細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)相似，如細(xì)胞特異性（NKX6-1，NEUROD1，RFX6，GCK，ISL1，SYT4和PDX1）和-細(xì)胞特異性（ARX）基因，而INS，MAFA，MAFB，UCN3和NKX2-2表達(dá)較低（圖1d）。加入WNT4不會改變細(xì)胞譜系特異性標(biāo)志物的表達(dá)（如INS，NKX6-1，UCN3，MAFB和SYT4），這表明W

6、NT信號傳導(dǎo)不會影響細(xì)胞命運的確定。但WNT4以劑量依賴方式增加了HILO中ESRRG以及線粒體呼吸鏈NDUFA7和COX7A2的表達(dá)（圖1e），與基因表達(dá)的變化一致。在WNT4存在條件下衍生的 HILO其氧化代謝增加，這也與健康人類胰島的代謝特征一致（圖1f）。WNT4處理的HILOs表現(xiàn)出改善的體外GSIS，且不能被-連環(huán)素抑制劑（XAV939）所阻斷，暗示非經(jīng)典的WNT信號是誘導(dǎo)細(xì)胞成熟的驅(qū)動力（圖1g）。在多能HuES8和H1ES細(xì)胞的分化和成熟過程中觀察到類似的轉(zhuǎn)錄和功能變化，表明此方案的穩(wěn)定性。在含有WNT4的3D分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)商業(yè)化的hiPS衍生的樣細(xì)胞，也可促進(jìn)偽胰島的形成和

7、GSIS功能。在STZ誘導(dǎo)的NOD / SCID糖尿病小鼠中移植wHILOs恢復(fù)了其血糖控制，并維持了葡萄糖穩(wěn)態(tài)超過六周?？傊@些結(jié)果表明非經(jīng)典的WNT信號足以誘導(dǎo)HILOSs代謝成熟，這也是GSIS所必需的。為明確驅(qū)動HILOs成熟的分子機制，研究者鑒定在WNT4處理所誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄變化。WNT4處理增加了1,581個基因的表達(dá)，并減少了1,354個基因的表達(dá)?；虮倔w（GO）分析明確了代謝途徑，最為顯著的是氧化磷酸化，在上調(diào)的基因組中富集（圖1h），與對細(xì)胞代謝的影響一致。WNT4處理可將HILOs中OxPhos基因的表達(dá)完全提高至與人類胰島相似的水平，并增加線粒體含量（圖1i）。為了檢測樣

8、細(xì)胞群體中的特定影響，在有/無 WNT4或WNT5a處理HILOs時，基于HILOs 的GFP表達(dá)，對分泌胰島素的細(xì)胞進(jìn)行分類。胰島素分泌細(xì)胞比例不受WNT處理的影響，與HILOs成熟期恒定的細(xì)胞譜系標(biāo)志物的表達(dá)一致。但WNT4和WNT5a處理增加了胰島素分泌細(xì)胞中的線粒體質(zhì)量，這也支持線粒體支撐樣細(xì)胞代謝成熟的觀點。為了鑒定該成熟步驟的遺傳效應(yīng)，利用 ATAC-seq在分選的GFP +細(xì)胞中WNT4誘導(dǎo)的染色質(zhì)可及性變化進(jìn)行分析，可觀察到廣泛的染色質(zhì)可及性的微小變化。利用GO對WNT4處理后表達(dá)量和染色質(zhì)可及性增加的123個基因進(jìn)行分析，明確了代謝途徑（包括氧化磷酸化），而對該基因子集的基序

9、分析確定了包括FOXA2和ERRs在內(nèi)的細(xì)胞成熟因子。此外WNT4可誘導(dǎo)從野生型而非ERR 細(xì)胞特異性基因敲除小鼠（ERRKO小鼠）中分離的新生兒胰島中，線粒體代謝基因的表達(dá)并改善GSIS功能?？傊?，這些結(jié)果表明非經(jīng)典的WNT4信號傳導(dǎo)可增強線粒體功能，且很大程度上是通過誘導(dǎo)ERR基因網(wǎng)絡(luò)（驅(qū)動樣細(xì)胞的代謝成熟）來實現(xiàn)（圖1）。圖1. WNT4誘導(dǎo)HILOs功能成熟。a，產(chǎn)生HILOs的示意圖，圖中顯示了每個發(fā)育過程中需添加到培養(yǎng)基中的關(guān)鍵因素，上下箭頭分別表示激動劑和抑制劑。DE，定形內(nèi)胚層；EP，內(nèi)分泌祖細(xì)胞；FG，后前腸；PP，胰腺祖細(xì)胞。Act, 激活素A；RA，視黃酸；VitC，維生

10、素C；VitE，維生素E; ALK5也稱為TGFBR1。b，3D培養(yǎng)中HILOs圖像（左）和人胰島素啟動子驅(qū)動的胰島素表達(dá)（右，由GFP指示）。c，wHILOs和人胰島的電子顯微鏡圖，顯示了胰島素和胰高血糖素顆粒。d，在hiPS細(xì)胞，經(jīng)PBS（-）或rhWNT4（+）處理的HILOs和人胰島中關(guān)鍵胰島基因相對表達(dá)的熱圖。e，用梯度濃度的WNT4處理后，HILOs中ESRRG，NDUFA7和COX7A2基因的相對表達(dá)。f，測量在hiPS細(xì)胞球狀體（0天，紫色），PBS處理的HILOs（綠色），WNT4處理的HILOs（紅色）和人胰島（藍(lán)色）中的耗氧率（OCR）。g，體外HILOs在不同刺激條件下

11、人C肽分泌的情況，如體外人C肽分泌對（G3）或20 mM葡萄糖（G20）或20 mM KCl（K20）刺激。h，HILOs中WNT4調(diào)控基因的GO分析。富集途徑中的上調(diào)和下調(diào)基因分別以紅色和藍(lán)色圓點顯示。i，3D培養(yǎng)的hiPS細(xì)胞，HILOs，wHILOs和人胰島中氧化磷酸化基因相對表達(dá)的熱圖。 2 成熟HILOs 的細(xì)胞復(fù)雜性免疫組織化學(xué)和流式細(xì)胞儀分析顯示5060的wHILO細(xì)胞共表達(dá)胰島素和細(xì)胞標(biāo)志物，并鑒定出少數(shù)表達(dá)其他內(nèi)分泌細(xì)胞標(biāo)志物（如胰高血糖素，生長抑素，胰腺多肽）的細(xì)胞群（圖2a）。WNT4處理并不會改變HILO的細(xì)胞組成，這與轉(zhuǎn)錄分析一致。為了表征代謝成熟

12、HILOs的細(xì)胞復(fù)雜性并了解其體外成熟程序，研究者比較了HILOs（PBS處理）和wHILOs（WNT4處理）單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組。wHILOs聚類分析發(fā)現(xiàn)了一類富含細(xì)胞標(biāo)記物和SOX9 + HES1 +的胰腺祖細(xì)胞簇。特征基因表達(dá)分析進(jìn)一步區(qū)分了非復(fù)制和復(fù)制性導(dǎo)管內(nèi)分泌雙能細(xì)胞（TOP2A±），內(nèi)分泌素富集的細(xì)胞（GCG +或SST +），導(dǎo)管樣細(xì)胞（KRT19 +）和少量功能未知的細(xì)胞。綜合的HILO和wHILO單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)聚類表明在樣細(xì)胞簇其譜系標(biāo)記INS，NEUROD1，NKX6-1和PDX-1的表達(dá)非常相似。相比之下， WNT4處理INS + ESRR

13、G +細(xì)胞，其ESRRG及其靶線粒體基因NDUFV3的表達(dá)增加，而糖酵解基因LDHA減少。對wHILOs和人胰島單細(xì)胞數(shù)據(jù)集的類似綜合分析證實了多種內(nèi)分泌樣細(xì)胞類型的存在（圖2b）。盡管差異顯著，wHILOs能與胰島內(nèi)分泌細(xì)胞（-，-，-和-細(xì)胞）聚類，暗示其轉(zhuǎn)錄相似性（圖2b）。值得注意的是，與胰島細(xì)胞共聚類的功能分類顯示wHILOs中主要存在樣和樣細(xì)胞（圖2b）。圖2. 外源性PD-L1表達(dá)在免疫能力強的小鼠中擴展了wHILO功能。a.胰高血糖素的代表性免疫熒光染色(GCG；細(xì)胞標(biāo)志物)、生長抑素(SST細(xì)胞標(biāo)志物)和胰腺多肽(PP；細(xì)胞標(biāo)記)。細(xì)胞由胰島素啟動子的綠色熒光蛋白表達(dá)來指示。

14、（比例尺，75m。右側(cè)，方框區(qū)域的擴展。）b，T-分布式隨機鄰居嵌入(t-SNE)聚類組合wHILO(藍(lán)點，n = 4，840)和人胰島(紅點，n = 3，245)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組(左)和由該聚類分析定義的細(xì)胞類型(左)。c，實驗方案示意圖。高劑量STZ (HD-STZ，180mg·kg-1)誘導(dǎo)的糖尿病C57BL6J小鼠接受有或無PD-L1過度表達(dá)(n = 500)的wHILOs或小鼠胰島移植。d，移植有或無PD-L1表達(dá)的wHILOs(分別為11和9)和C57BL6J胰島(7)后隨機喂養(yǎng)的血糖水平。e，流式細(xì)胞術(shù)分析在移植有或沒有PD-L1表達(dá)的wHILOs后27天從腎被膜移植物中回

15、收的胰島素表達(dá)和小鼠免疫(CD45+)細(xì)胞(n = 6)。顯示每個區(qū)域中的細(xì)胞百分比。數(shù)據(jù)為平均標(biāo)準(zhǔn)差*P<0.05，P < 0.01，*P<0.001單尾配對學(xué)生測驗。圖像是三個獨立實驗的代表。數(shù)據(jù)具有代表性(e)，或由三個獨立樣本(b)或?qū)嶒?d，f)匯編而成。 3  wHILOs具有免疫耐受性 PD-L1為 wHILOs提供免疫保護(hù)。移植胰島的臨床實用性受限于同種異體和自身免疫反應(yīng)。正常胰島中的細(xì)胞子集包括少量表達(dá)PD-L1的細(xì)胞，PD-L1是細(xì)胞免疫耐受的決定因素，暗示外源性PD-L1表達(dá)可保護(hù)wHILOs免受免疫排斥。為此，利

16、用慢病毒系統(tǒng)生成表達(dá)PD-L1的hiPS細(xì)胞克隆，隨后分化為代謝成熟的wHILOs，但PD-L1過表達(dá)不影響胰島素分泌。將具有/不具有PD-L1表達(dá)的wHILOs移植到具有免疫活性的糖尿病小鼠中，在移植后的幾天內(nèi)恢復(fù)了血糖控制，且與STZ處理的C57BL6J小鼠相似（圖2c，d）。然而，PD-L1缺乏的wHILOs功能逐漸消失，因其血糖水平逐漸升高，而PD-L1 + wHILOs能夠維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)超過50天（圖2d）。此外，增加PD-L1 + wHILOs數(shù)量可使血糖水平正?；^50天。對移植27天后恢復(fù)的移植物進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，結(jié)果顯示PD-L1 +移植物中CD45 +免疫細(xì)胞（包括T細(xì)

17、胞和自然殺傷細(xì)胞）的數(shù)量減少，而胰島素表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量微乎其微（圖2e，f）。PD-L1 + wHILOs作為異種移植物的持久性促使研究者在包含重組人T細(xì)胞庫的模型中探索其功能。在人類T細(xì)胞存在條件下，多次低劑量STZ處理（MLD-STZ）使HuPBMS-NSG-SGM3小鼠患上糖尿病，隨后將wHILOs移植至小鼠內(nèi)（圖3a，b）。與缺乏PD-L1表達(dá)的人相比，移植的PD-L1 + wHILOs提供了持續(xù)的血糖控制和人C肽水平（人C肽水平與血糖控制程度相關(guān)）（圖3c，d）。外科手術(shù)摘除移植腎后高血糖癥迅速發(fā)展，表明移植物衍生的胰島素是主要的作用因子（圖3c）。對恢復(fù)后移植物的后續(xù)分析顯示，非免疫

18、隔離的wHILOs中表達(dá)胰島素的細(xì)胞數(shù)量顯著減少，而人淋巴細(xì)胞相應(yīng)增加（圖3e，f）。圖3. wHILO（PD-L1）有助于人源化小鼠的葡萄糖控制。a，實驗流程圖，顯示將有和沒有PD-L1過表達(dá)的wHILOs移植到多個低劑量STZ誘導(dǎo)的糖尿病人源化小鼠（Hu-PBMC-NSG）中。 b，流式細(xì)胞儀分析Hu-PBMC-NSG小鼠(人PBMC移植后3周)的外周血單核細(xì)胞（PBMC）中的人T細(xì)胞占比。c，移植有或沒有PD-L1表達(dá)的wHILOs后，MLD-STZ誘導(dǎo)的糖尿病Hu-PBMC-NSG小鼠de 血糖水平。 d，c,小鼠血清中人C肽水平。 e，在移植有或沒有PD-L1表達(dá)的wHILOs后27

19、天，從腎囊移植物中回收的表達(dá)胰島素和人CD45 +免疫細(xì)胞的流式細(xì)胞儀分析。 f，e, 流式數(shù)據(jù)的相對定量分析。 表觀遺傳記憶驅(qū)動wHILOs免疫耐受。干擾素-（IFN-）刺激可以誘導(dǎo)多種細(xì)胞、癌癥和胰島中PDL1的表達(dá)；然而長期暴露的細(xì)胞因子（包括IFN-）會誘導(dǎo)細(xì)胞死亡和/或去分化。為了確定該途徑是否可以使宿主的免疫反應(yīng)最小化，研究者首先將人胰島暴露于IFN-。IFN-處理12小時后，PDL1（也稱CD274）表達(dá)增加了約20倍。wHILOs實驗看到了類似的誘導(dǎo)作用，即IFN-誘導(dǎo)胰島素表達(dá)細(xì)胞/非表達(dá)細(xì)胞（分別為GFP +/GFP-細(xì)胞）中PDL1的表達(dá)（圖4a）。wHILOs

20、的劑量遞增研究表明暴露于10 ng ml-1IFN-，12 h后 PDL1產(chǎn)生量最高。即使在此濃度下暴露2 小時也足以誘導(dǎo)PDL1，但該表達(dá)是瞬時的（圖4b）。鑒于對炎性刺激（如LPS）的耐受性與表觀遺傳學(xué)變化相關(guān)聯(lián)，就進(jìn)一步探究連續(xù)IFN-刺激是否可以誘導(dǎo)持續(xù)的PDL1表達(dá)。其后反復(fù)的短時間暴露于IFN-（多次脈沖式刺激（MPS）也導(dǎo)致PDL1持續(xù)表達(dá)并伴隨蛋白水平的增加（圖4c-e）。值得注意的是，MPS IFN-處理不會損害GSIS功能（圖4f）。此外，MPS IFN-處理的wHILOs免受 IL-1誘導(dǎo)的細(xì)胞去分化，由細(xì)胞標(biāo)志INS和UCN3的高表達(dá)所示（圖4g，h）。

21、60;  為了進(jìn)一步對IFN-驅(qū)動wHILOs的變化的機制探討發(fā)現(xiàn)，ATAC-seq分析顯示急性（12小時）暴露IFN-和MPS IFN-處理誘導(dǎo)的全基因組轉(zhuǎn)錄變化與染色質(zhì)可及性的改變有關(guān)。兩種IFN-處理方法誘導(dǎo)的上調(diào)基因組中，大部分相互重疊，而下調(diào)的基因有一半受它們的共同影響。對共同上調(diào)基因組的GO分析明確了IFN-信號通路。在僅MPS組上調(diào)的基因組中發(fā)現(xiàn)了反映細(xì)胞炎癥狀態(tài)的通路，包括對IL-1的負(fù)調(diào)控和炎癥通路，而在MPS下調(diào)的基因組中發(fā)現(xiàn)了正向調(diào)控NF-B信號傳導(dǎo)和凋亡的基因。染色質(zhì)可及性的重疊區(qū)的變化揭示了MPS IFN-處理后基因位點（包括PDL1，IRF9，J

22、UNB和JUND）的持續(xù)增加，這與基因轉(zhuǎn)錄水平的持續(xù)增加相一致。盡管急性處理后， IFN-反應(yīng)性基因可及性增加（如IRF1和STAT1），但MPS處理時并未觀察到上述現(xiàn)象。 研究者進(jìn)一步研究MPS IFN-處理，在（具有免疫活性的）STZ誘導(dǎo)的糖尿?。–57BL6J）小鼠中產(chǎn)生免疫逃逸wHILOs（wHILOie）的能力。wHILOie移植能夠降低葡萄糖水平長達(dá)40天，而原始的wHILOs（未暴露于IFN-）的降糖能力逐漸降低，這與血清中人類C肽水平的降低相一致（圖4i-k ）。移植到人源化糖尿病小鼠中觀察到相似的結(jié)果，且手術(shù)切除受體腎臟可導(dǎo)致血糖控制能力的突然喪失。若恢復(fù)wHILOie移植物，可觀察到表達(dá)胰島素的細(xì)胞數(shù)顯著增加，伴隨淋巴細(xì)胞浸潤的減少和活化的Th細(xì)胞相對數(shù)量的減少（圖4）。圖4. 內(nèi)源性