慢性粒單核細胞白血病干細胞轉錄本預測疾病形態(tài)和預后

1、慢性粒單核細胞白血病干細胞轉錄本預測疾病形態(tài)和預后導讀慢性粒單核細胞白血?。–MML）是一種具有骨髓增生異常和骨髓增生重疊特征的臨床異質(zhì)性干細胞惡性腫瘤，超過90%的患者攜帶表觀遺傳和/或剪接基因突變，通?？稍诎籽∑鹗技毎诘腖in-CD34+CD38-免疫表型干細胞間檢測到。干細胞水平的轉錄失調(diào)可能是疾病發(fā)生和發(fā)展的基礎。本研究使用基于液滴的超高通量10x平臺對來自7例初治CMML患者和3例健康對照者的6826株分選的Lin-CD34+CD38-進行單細胞測序分析。鑒定了獨特的CMML干細胞特征，發(fā)現(xiàn)患者間和患者內(nèi)轉錄組異質(zhì)性程度顯著，轉錄因子網(wǎng)絡失調(diào)模式不同，即使在原始干細胞水平上CM

2、ML-1和CMML-2之間的顯著差異也很明顯。實驗設計結果1 CMML干細胞表現(xiàn)出髓系偏向、增殖的轉錄特征基于526個高度可變基因的t-SNE二維可視化，揭示CMML和對照組Lin-CD34+CD38-之間存在實質(zhì)性的分離，此外，不同CMML患者之間具有轉錄組異質(zhì)性的細胞（圖1B）。通過分析差異表達基因，初步關注CMML和對照干細胞之間的差異。將對照組和CMML組Lin-CD34+CD38-進行了差異基因表達分析，發(fā)現(xiàn)CMML中943個基因上調(diào)，296個基因下調(diào)。對上調(diào)基因進行KEGG和GO分析，突出了與細胞周期相關通路的富集，也突出了髓系細胞的那些特征（圖1C，1D）。 

3、接下來計算分選的單個Lin-CD34+CD38-細胞群體中每個基因的平均標準化表達值，并使用信噪比排序度量進行基因集富集分析（GSEA）。最顯著的富集是分化骨髓細胞特征的基因集，如“炎癥反應”和“IL6-JAK-STAT信號轉導”和細胞周期基因集“E2F靶標”和“G2M檢查點”,與Lin-CD34+CD38-中相比，在CMML中強烈富集（圖1E）。 由于干細胞的分裂和分化緊密相關，對Lin-CD34+CD38- HSC中上調(diào)的基因集進行了額外的GSEA分析。與正常Lin-CD34+CD38-HSC相比，觀察到，CMML中正常的Lin-CD34+CD38-HSC基因集顯著下調(diào)

4、（圖2A），而在Lin-CD34+CD38-HSC中性粒細胞或單核/樹突狀細胞啟動的祖細胞中選擇性表達的基因則顯著上調(diào)（圖2B）。相比之下，B細胞、MegE或EBM祖細胞基因集的表達富集極少或不富集。這些發(fā)現(xiàn)得到了所示小提琴圖的進一步支持（圖2C）。用于與HSC自我更新相關的轉錄因子基因的單細胞表達，包括MEIS1、HLF、KLF4和EGR1（在CMML與正常干細胞中均下調(diào)）；以及轉錄因子和其他與骨髓承諾和分化相關的基因，如RUNX1、CEBPD、LGALS1和AZU（在CMML與正常HSC中均上調(diào)）（圖2C）。這些數(shù)據(jù)表明，與正常Lin-CD34+CD38-HSC相比，CMML干細胞表現(xiàn)出轉

5、錄組的特征為髓系和細胞周期基因表達增加，正常HSC選擇性表達的基因表達較低。圖1 CMML干細胞表現(xiàn)出不同的轉錄特征圖2 CMML干細胞失去了干細胞靜止的特征，并表現(xiàn)出髓樣偏向2 CMML患者正常Lin-CD34+CD38-單細胞轉錄信號的檢測接下來，進行了無監(jiān)督的迭代聚類，并在所有測序細胞中確定了17個轉錄上可分離的亞群（圖3A）。對于每個亞群體與所有剩余群體的比較，確定了20個上調(diào)程度最高的基因。圖3B顯示了17個簇中每個簇的這些標記基因的表達，以及在每個簇中顯示顯著富集的前三個KEGG項（圖3B）。正常Lin-CD34+CD38-造血干細胞幾乎完全聚集在第1

6、5簇中（圖3C）。值得注意的是，大多數(shù)CMML樣本包含不同比例的細胞也被歸入第15簇。再次觀察到，與正常人相比，從CMML患者BC786和BC746中回收的Cluster15干細胞中正常的HSC基因相對下調(diào)；在從患者BC746中提取的Cluster15干細胞中，中性粒細胞和單核/樹突狀祖細胞中選擇性表達的基因顯著增加。說明這些患者的轉錄組已經(jīng)被疾病相關的骨髓微環(huán)境所改變。 圖3 CMML干細胞的可變部分與正常干細胞有一個共同的轉錄特征 3 CMML-1和CMML-2患者的干細胞具有不同的轉錄程序 骨髓原始細胞百分比的增加與CMML的不良結局密切相關。為了確定這種臨

7、床病理差異是否反映在CMML干細胞室內(nèi)的轉錄差異上，比較了CMML-0或CMML1患者和“CMML-2”患者的單個干細胞轉錄本。觀察到顯著的差異：在CMML-1和CMML-2干細胞群體中，782個基因上調(diào)，802個基因下調(diào)。KEGG和GO生物學過程分析顯示，CMML-1基因集在CMML-1中有豐富的表達。相比之下，與CMML-1相比，CMML-2干細胞中豐富的基因集包括與炎癥和細胞因子反應、JAK-STAT信號和凋亡相關的基因集。使用替代的可視化方法UMAP，能更好地表示細胞起源和發(fā)育過程中的軌跡，這表明CMML-2干細胞轉錄本與CMML-1和對照干細胞轉錄本顯著分離，但CMML-2患者BC5

8、72的干細胞亞組分除外（圖4A）。 為了進一步研究正常和CMML干細胞群體的相關性，進行了偽時間排序分析。在二維線性表示中，觀察到CMML-1、CMML-2和正常干細胞的明確界限（圖4B）。這種分離通過分支表示進一步強調(diào)，其中偽時間將干細胞排序到不同的分支，而沒有預先假設正常的HSC分化（圖4C和D）。在這個投影控制中，CMML-1干細胞大部分位于分支點2以上，而分支點2之前的干細胞主要是CMML-2干細胞。鑒于CMML-1和CMML-2干細胞的不同轉錄，接下來評估轉錄因子的表達水平，因為這些轉錄因子是細胞狀態(tài)和分化的核心調(diào)節(jié)因子。與更廣泛的單核細胞分化相一致，ELANE、MPO和L

9、YZ在CMML-1干細胞中顯著上調(diào)（圖5C）。綜上所述，以上數(shù)據(jù)顯示CMML-2患者的干細胞轉錄本與CMML-1患者的干細胞轉錄本非常不同，顯然可以預測疾病的形態(tài)和結果。 圖4 CMML-1和CMML-2干細胞表現(xiàn)出不同的發(fā)育軌跡  圖5 來自CMML-1和CMML-2患者的干細胞具有不同的轉錄特征 4 CMML干細胞中涉及的轉錄因子網(wǎng)絡 為了更深入地評價CMML干細胞中轉錄因子的異常調(diào)控，進行了轉錄調(diào)控網(wǎng)絡分析。為此，研究采用了SIENIC，通過整合轉錄因子的共表達和在其順式調(diào)控元件中包含相應轉錄因子結合基序的基

10、因來識別調(diào)節(jié)子模塊?？偣?96個調(diào)節(jié)子的聚類再次表明，正常和CMML Lin-CD34+CD38-干細胞在轉錄空間中可廣泛分離（圖6A）。雖然一些調(diào)節(jié)子在所有細胞中都同樣活躍（例如Elf1、HMGA1、ETS2），但某些轉錄因子網(wǎng)絡在樣本的子集中顯示出獨特的活性（圖6B）。與早先的分析一致，與原癌基因Jun和與HSC自我更新相關的轉錄因子（例如KLF4，HLF）相關的調(diào)控子在CMML中相對不活躍（圖6C）。CMML-1干細胞與已知的髓系轉錄因子CEBPD、CEBPA和MYC相關的調(diào)節(jié)子活性相對增強。與單核細胞分化相關的網(wǎng)絡在CMML-2干細胞中優(yōu)先活躍（圖6C）。因此，根據(jù)CMML-

11、1（MYC）或CMML-2（IRF轉錄因子）患者的不同，CMML干細胞的轉錄組和它們的譜系潛力是通過表達獨特的轉錄圖譜來表征的。 圖6 在CMML-1和CMML-2干細胞中運作的不同轉錄因子網(wǎng)絡 5 CMML HSPC患者間和患者內(nèi)的異質(zhì)性 細胞間轉錄相關分析發(fā)現(xiàn)，樣本之間或CMML和對照之間總體轉錄異質(zhì)性的大小沒有一致的差異，這表明總體上CMML干細胞并不比正常干細胞更具異質(zhì)性。然而，與對照干細胞不同的是，每個患者的干細胞分布在23個不同的簇上（圖7A）。接下來，進行了兩兩通路分析，比較了每個CMML患者特異性簇與簇15的轉錄譜，排除了來自C

12、MML患者的映射到這個簇的細胞（圖7B）。定位于不同KEGG途徑的基因存在高度異質(zhì)性差異表達。有些（例如，“細胞因子-細胞因子受體相互作用”、“趨化因子信號傳遞”）在大多數(shù)疾病群組中一般都是活躍的，而另一些在一些患者的某些群組中只是活躍的。此外，研究在某些CMML患者中觀察到顯著的異質(zhì)性。這些數(shù)據(jù)進一步突出了CMML患者干細胞群體之間以及內(nèi)部的轉錄異質(zhì)性。 圖7 CMML干細胞在患者間和患者內(nèi)部的異質(zhì)性結論本研究發(fā)現(xiàn)慢性粒單核細胞白血病患者間和患者內(nèi)存在顯著的異質(zhì)性，CMML干細胞表現(xiàn)出獨特的轉錄程序。與正常對照組相比，CMML干細胞表現(xiàn)為髓系基因和細胞周期基因表達增加，而正常