RT-PCR計算侯靜

1、摘要:現(xiàn)在最常用的兩種分析實時定量PCR 實驗數(shù)據(jù)的方法是絕對定量和相對定量。絕對定量通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算起始模板的拷貝數(shù)；相對定量方法則是 比較經(jīng)過處理的樣品和未經(jīng)處理的樣品目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本之間的表達(dá)差異。Z*方法是實時定量 PCR 實驗中分析基因表達(dá)相對變化的一種簡便方法，即相對定量的一種簡便方法。本文介紹了該方法的推導(dǎo)，假設(shè)及其應(yīng)用。另外，在本文中我們還介紹了兩種2 ACT衍生方法的推導(dǎo)和應(yīng)用，它們在實時定量PCR 數(shù)據(jù)分析中可能會被用到。關(guān)鍵詞：反轉(zhuǎn)錄 PCR 定量 PCR 相對定量 實時 PCR Taqman反轉(zhuǎn)錄 PCR （RT-PCR ）是基因表達(dá)定量非常有用的一種方法（1 - 3 ）。實

2、時 PCR 技術(shù)和 RT-PCR 的結(jié)合產(chǎn)生了反轉(zhuǎn)錄定量 PCR 技術(shù)（4 ,5 ）。實時定量 PCR 的數(shù)據(jù)分析方法有兩種：絕對定量和相對定量。絕對定量一般通過定量標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定我們所 感興趣的轉(zhuǎn)錄本的拷貝數(shù)；相對定量方法則是用來確定經(jīng)過不同處理的樣品目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本之間的表達(dá)差異或是目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本在不同時相的表達(dá) 差異。絕對定量通常在需要確定轉(zhuǎn)錄本絕對拷貝數(shù)的條件下使用。通過實時PCR 進(jìn)行絕對定量已有多篇報道（6 - 9 ）,包括已發(fā)表的兩篇研究論文（10,11 ）。在有些情況下，并不需要對轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行絕對定量，只需要給出相對基因表達(dá)差異即可。顯然，我們說X 基因在經(jīng)過某種處理彳灸表達(dá)量增加2.5

3、倍比說該基因的表達(dá)從 1000 拷貝/細(xì)胞增加到 2500 拷貝/細(xì)胞更加直觀。用實時 PCR 對基因表達(dá)進(jìn)行相對定量分析需要特殊的公式、假設(shè)以及對這些假設(shè)的驗證。2乂CT方法可用于定量 PCR 實驗來計算基因表達(dá)的相對變化：nCT公式的推導(dǎo)，以及實驗設(shè)計，有效性評估在Applied Biosystems User Bulletin No.2 （P/N4303859 ）中有介紹。用LCT方法分析基因表達(dá)數(shù)據(jù)在文獻(xiàn)中也有報道（5,6）。本文介紹了該方法的推導(dǎo)、假設(shè)以及應(yīng)用。另外，本文還介紹了 2乂 兩種衍生方法的推導(dǎo)和應(yīng)用，它們在實時定量PCR 數(shù)據(jù)分析中都可能被用到。1.MCT方法1.1. 2

4、 字CT方法的推導(dǎo)PCR 指數(shù)擴(kuò)增的公式是:|6|XN代表經(jīng)過均一化處理過的初始目標(biāo)分子量；CT表示目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因CT值的差異(CT,XCT,R)整理上式得:X= & X (1 + x)nill這里，Xn是第 n 個循環(huán)彳灸目標(biāo)分子數(shù)，X0是初始目標(biāo)分子數(shù)，Ex是目標(biāo)分子擴(kuò)增效率,n 是循環(huán)數(shù)，CT代表目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。因此：AV = Ao x (1 + Ex)CTX=Kx12XT是目標(biāo)分子達(dá)到設(shè)定的閾值時的分子數(shù)。CT，X是目標(biāo)分子擴(kuò)增達(dá)到閾值時的循環(huán)數(shù)。Kx是一個常數(shù)。對于內(nèi)參反應(yīng)而言，也有同樣的公式：七=凡x (I+成戶=地=爪用XT除以RT得到：RT凡

5、X (1 + ER)CTR KR對于使用 Taqman 探針的實時擴(kuò)增而言，XT和RT的值由一系列因素決定：包括探針?biāo)鶐У臒晒鈭髮?dǎo)基團(tuán)、探針序列對探針熒光特性的影響、探針的水解效率和純度以及熒光閾值的設(shè)定。因此常數(shù)K 并不一定等于 1。假設(shè)目標(biāo)序列與內(nèi)參序列擴(kuò)增效率相同:咎X (1 += K15|外=KX (I +目 767|最后用任一樣本 q 的XN除以參照因子(calibrator, cb)的XN得到：國=KX (1 + E)匚勇=Ak.cbKX (I + EL%在這里二一 =心6勺ACTxb)對于一個少于 150bp 的擴(kuò)增片斷而言，如果 Mg2+濃度、引物都進(jìn)行了適當(dāng)?shù)膬?yōu)化，擴(kuò)增效率接

6、近于1。因此目標(biāo)序列的量通過內(nèi)均一化處理之后相對于參照因子而言就是1.2.2皿CT方法的假設(shè)和應(yīng)用要使 CT 計算方法有效，目標(biāo)序列和內(nèi)參序列的擴(kuò)增效率必須相等?？磧蓚€反應(yīng)是否具有相同的擴(kuò)增效率的方法是看他們模板濃度梯度稀釋彳灸擴(kuò)增產(chǎn)物 CT 如何變化。W i.k.tiont. !i|i tiir n. hl irr(1IIiJ-| NA, svnrhcsiZE1*! from d life rentamounts of RNA. The effidcncy of amplifiof thetarget Reiw* andIRCCIruil controlIC.API Hi w ，cxamin

7、odusinrcal tijncPlR andIutqMandoifcuonti anwriplase, cDNA yntlu.Lsi2*?d From I鼻軋ml ci I RNA isoiatedmI Ji i HjiiiR：I)E H il，St nd Jih r i r； - I 3 iM x.-fp -Hi | itj- d hriil-time PCR usng gerw-spec ifi 1I 1 1 1S )圖 1 顯示的是 cDNA 樣品在 100 倍稀釋范圍內(nèi)的實驗結(jié)果。對于每一個稀釋樣本，都用GAPDH 和 c-myc 特異的熒光探針及引 物進(jìn)行擴(kuò)增。計算出 c-myc

8、和 GAPDH 的平均CT值以及CT值，通過 cDNA 濃度梯度的 log 值對CT值作圖，如果所得直線斜率絕對成立， CT 方法可以用來分析數(shù)據(jù)。如果兩個擴(kuò)增反應(yīng)效率不同，則需要通過定量標(biāo)準(zhǔn)曲線和絕對定量的方法來進(jìn)行相對定量；或者 也可以重新設(shè)計引物，優(yōu)化反應(yīng)條件使得目標(biāo)序列和內(nèi)參序列具有相同的擴(kuò)增效率。1.3. 2乂 內(nèi)標(biāo)和參照因子的選擇使用內(nèi)標(biāo)基因的目的是為了對加入到反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的RNA 進(jìn)行均一化處理。標(biāo)準(zhǔn)的看家基因一般都可被用作內(nèi)標(biāo)基因。適合于實時 PCR 反應(yīng)內(nèi)標(biāo)基因包括 GAPDH , 6 -actin , fe-microglobulin 以及 rRNA。當(dāng)然，其它的看家基因也

9、同樣能被用作內(nèi)標(biāo)。我們推薦在應(yīng)用某一基因作為內(nèi)標(biāo)之前首先確證 該基因的表達(dá)不會受實驗處理的影響。驗證實驗處理是否對內(nèi)標(biāo)基因表達(dá)產(chǎn)生影響的方法在2.2 部分有描述。MCT方法中參照因子的選擇決定于基因表達(dá)定量實驗的類型。最簡單的設(shè)計就是把未經(jīng)處理的樣品作為參照因子(calibrator )。經(jīng)內(nèi)標(biāo)基因均一化處理后，通過方法計算，目標(biāo)基因表達(dá)差異通過經(jīng)過處理的樣本相對于未經(jīng)處理的樣本的倍數(shù)來表示。對于未經(jīng)處理的 參照樣， CT=0，而 20=1。所以根據(jù)定義，未處理樣本的倍數(shù)變化為1。而對于那些經(jīng)過處理的樣本，相對于參考因子基因表達(dá)的倍數(shù)為CT。同樣的分析也可用于不同時相的基因表達(dá)差異，在這種情況

10、下，一般選 0 時刻的樣本作為參照因子。有些情況下，并不是比較不同處理樣本基因表達(dá)差異。例如，有的是想看某一器官中特定mRNA 的表達(dá)。在這種情況下，參照因子可能是另一器官中該 mRNA 的表達(dá)。表 1 顯示了大腦和腎臟總 RNA 中 c-myc 和 GAPDH 轉(zhuǎn)錄本的 CT 值。在這一個例子中，大腦 被人為的選擇為參照因子，通過計算得到腎臟c-myc 表達(dá)量經(jīng) GAPDH 校正彳灸相對于大腦的表達(dá)量的結(jié)果。盡管相對定量方法可用于這種組織之間的比較，但結(jié)果的生物學(xué)解釋是相當(dāng)復(fù)雜的。不同種類細(xì)胞中目標(biāo)和參照轉(zhuǎn)錄本單一的相對量變化可能在任何特定的組織中都 存在。值接近于 0,說明目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基

11、因的擴(kuò)增效率相同，就可以通過CT 方法進(jìn)行相對定量。在圖 1 中，直線斜率是 0.047 ,因而假設(shè)MW ACB*1Q9- Fijj B泓LWO46v*t Ac*n0PFSEJC*LMWBW fcnnmiH aai,DILMKRtaut tetn1& PWfl 23 J9gUUNWMM ASIAE11 FEftIMGM*PR?fl F袒,?oa&M1 AdA1pnCHgf 1t框UMHBvtaAcftn1PRJ21，BlMLiknBHKIJWfki|w114ELSt lr. fpTMH擊Mi r chM”心IvtH n蛔幅 少用 廠* mmiS Thn kM rhjnpv* m

12、心網(wǎng) g 電加口dvi tur小仆-“昂昂偵由rfljrKiIDIlia inlrnai rointmlFTW審審A-|LIIl Jt% 可心廈，Limn |Mjril%握!1 Lliopi, _TIHIMMI Q at iksto Ufu Mv slsmiii Irolorfd buftmlat ia，“jnipliT cakuLifi tan lor Ui# Baldi rhs叩n*頃p* jtAi* khLuk baKi1.4. M 方法的數(shù)據(jù)分析實時定量 PCR 所得到 CT 值可以很容易的輸出到表格程序如Microsoft Excel 中去。為了顯示數(shù)據(jù)分析過程，我們在這里給出了一個

13、基因表達(dá)定量的實驗數(shù)據(jù)和樣本列表。通過6-actin 均一化處理，我們對目標(biāo)基因fos-glo-myc 的表達(dá)變化進(jìn)行了監(jiān)測。在 8h 的時間范圍內(nèi)，在每一時間點(diǎn)都取3 個重復(fù)樣本，每一樣本在 cDNA 合成之彳灸都做定量 PCR，數(shù)據(jù)分析用到了公式9,即：IABLE】TreauntM M RplkotrTarg瀏射Rckrtiwr Ar* Amplkhed ui Separace wlh*Thw*hC nir CfGAP Ml GVirnull iITmi nivminind-.ilco bfm如HMMHMM葡aaJOnWMaaJOnWMILWJi口cm3 SBJi* 49 2 U 15ZJ

14、 b.1*IMF*KJdrwy7 i*i27 03Mif u i331w*7 10TbM-Mi時MM暮Z7 03 *MI062?fi* (HIMDUO * U 1,747k*Bl JHUL tain Jmmam bfJdnMK| mutwv vwamtitiMc) |(m t tamarh. LiiJnf tvwrw trains rptwrdJNA w %ymiFmd Imm I xR f-NA Ah |nDtL44 rlJNAWTIhnvd如TInnpMr 1 rml ru. it K r* urcnfAinirf rTn f prtnvri *rrt prolK Mr c-nrir w

15、prinititAIK| prelw kr (WPH P-v hE*HMnnuinM| cPMAdftmvl MNNIV ngM| RNAimrilon w ptrfoniwLtaffiM WWI Trt*Qwvfit闕A1LM444MFn-fPvtftwUNHM*T5LMffi.5 伊k.T04LMdflLMCH- iMrgrC4n!tSlNfihi?GtLMMN|MlLIHMltMHMM ，AFfn陽，lU1 C394ji i。?*割&Al t1 IJMPH1tailti tmin?! prtino1 1gtt tW 9RR1，E 1n *rw Owft橋fftfWi-D* IJM

16、,由2a1ua，qi，頃EL*ami *14jia打漏漏a vu2MH Cr TIM X MH* Cr Ufflf 9atnoimt of target = 2一心。丁Time x 表示任意時間點(diǎn)，Time 0 表示經(jīng) 6 -actin 校正后 1 倍量的目標(biāo)基因表達(dá)。0 時刻目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因的平均CT（見圖 2 第 8 欄）被用于公式 9 中。通過公式 9 計算出每一個樣本目標(biāo)基因表達(dá)通過6 -actin 均一化處理彳灸相對于 0 時刻的倍數(shù)（見圖 2 第 9 欄）。平均 SD , CV 由每一個時間點(diǎn)所取的三個重復(fù)樣求得。用這種分析方法，在0 時刻的平均倍數(shù)變化接近于1。我們發(fā)現(xiàn)通過檢測

17、在0 時刻平均倍數(shù)變化是否為 1 可以很方便的驗證三個重復(fù)樣品之間是否有錯誤或者誤差。如果得到的結(jié)果與 1 偏差很大，則表明存在計算錯誤或者是很高的實驗誤差。在前面的例子中，在每一時間點(diǎn)上分別取了三個獨(dú)立的RNA 樣本進(jìn)行了分析。因此對每一個樣本分別處理，通過計算彳灸取結(jié)果的平均值就非常重要。如果是同一樣本進(jìn)行PCR 擴(kuò)增的重復(fù)，這就需要首先求出平均CT,然彳菱再進(jìn)行 計算。怎么樣計算平均值就要看目標(biāo)基因和內(nèi)參基因是在同一個管子中擴(kuò)增還是在不同的管子中擴(kuò)增。表1 給出了目標(biāo)基因（c- myc ）和內(nèi)參基因（GAPDH ）在不同管中擴(kuò)增的實驗數(shù)據(jù)。在這里不應(yīng)該把任一單個的c-myc 管子和 GA

18、PDH 管子作比較，而應(yīng)該分別計算出 c-myc 和 GAPDH 的平均CT來計算CT。重復(fù)實驗中CT值的估計偏差通過標(biāo)準(zhǔn)的指數(shù)計算轉(zhuǎn)化成最彳受結(jié)果中相對量的變化。但其中的一個難點(diǎn)是CT值與相應(yīng)的拷貝數(shù)成指數(shù)關(guān)系（見第 4 部分），因此，在最彳灸的計算中，的誤差通過CT加上標(biāo)準(zhǔn)偏差和CT減去標(biāo)準(zhǔn)偏差來評估，這就使得求得的數(shù)值相對于平均值呈不對稱分布。不對稱分布是因為結(jié)果經(jīng)指數(shù)處理彳受轉(zhuǎn)化成量的線性比較造成的。通過不同熒光染料標(biāo)記的探針，我們可以在同一管中同時擴(kuò)增目標(biāo)序列和內(nèi)標(biāo)序列。表 2 給出了目標(biāo)基因（c-myc ）和內(nèi)標(biāo)基因（GAPDH ）在同一管中擴(kuò)增的實驗數(shù)據(jù)。對于任意一個管子，目標(biāo)基

19、因（ c- myc）和內(nèi)參基因（GAPDH ）擴(kuò)增時加入的 cDNA 量都是一樣 多的，所以可以分別對每個管子計算CT值，這些值取平均后再進(jìn)行計算。在這里估計誤差值也是一個不對稱的范圍，反映了誤差經(jīng)指數(shù)處理轉(zhuǎn)化為線性差異。在表 1 和表 2 中，估計誤差在從CT到八CT的計算中未見有增加，這是因為我們把參照基因和檢測基因的誤差都顯示出來了。我們把 ACT, cb 當(dāng)作一個人為設(shè)定的常數(shù)來減去，得到 ACT。這樣得到的結(jié)果就與圖 2 所顯示的在求平均之前對不同重復(fù)樣本分別通過各自的 CT 值求實 所得結(jié)果 相當(dāng)。另一種方法是將參照基因當(dāng)作沒有任何誤差的1 倍的量，在這種情況下，平均 CT,cb的

20、誤差值被引入到每一樣本的CT中。在表 1 中，腎臟中CT變成-2.50 =0.20 而經(jīng)過校正的 c-myc 量是 5.6 倍，范圍從 4.9 至 V 5.6。而|9|在大腦中的結(jié)果是沒有誤差的1 倍I JLU LLZTn iiUHmi4 Rw-pliB-iiiLmnVklfi，Ri |-f ff-HC iTM/Ampliihrd Hi ihi1SariwrUHT| 麻麻r tpi r口 M|A iNormaUKd c mw amntrnlTim*孑Cl3H 1 t-Mto iTiklfi1iSj?T3I33 3IJS7 0KM6 R4S4Z$ 177 ITSI4sn * o 16d M M

21、H |61*1 1 IIJ 齡4 43A 524 51跆i心14Hma24 254r ttM ftpMW dft JUL，i n I | M + - lirib-t-u = | H 1 I- I 。I I -flit I 1 p . 1. |l FiM ! I I：n1 Wl I 14T I isiJ !*! H I h -”呻i Ir-r! I i l| I I - u,-.JEI tkilJU iLfmLILdM* JlElr rJl.2. 2“Cf方法2.1. 2 Cf方法的推導(dǎo)通過內(nèi)標(biāo) RNA 可以對加入 RNA 的量的差異進(jìn)行校正。2乂CT方法的數(shù)據(jù)分析的一個特點(diǎn)就是能夠利用實時PC

22、R 實驗的一部分?jǐn)?shù)據(jù)來完成這種校正。在其它的方法不能定量初始RNA 量的時候：例如，在能得到的 RNA 量非常有限的時候或者需要處理高通量的樣品的時候，這一方法的優(yōu)勢就格外明顯。當(dāng)然我們也可以利用PCR 實驗以外的方法來完成這種校正。最常用的一種方法就是用紫外吸收來確定用于 cDNA 合成的 RNA 量，然彳灸將相同的 RNA 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的 cDNA 用于 PCR 定量反應(yīng)。這種外標(biāo)法校正的一個應(yīng)用例子就是研究某種實驗處理是否影響內(nèi)標(biāo)基因的表達(dá)。在這里，目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)合二為一。在這個例子中，公式2不被公式3除，公式5 變成:為x】+扃政=板.10整理得：:任一樣品 X0,q除以參照品 X0,c

23、b得：在這里 CT=CT,q-CT,cb。 C T與前面計算中用的CT（用目標(biāo)基因CT值減去參照基因CT值）相互區(qū)別(1 + Ex)*氣1121就象在 1.1 部分所描述的，如果條件優(yōu)化較好，效率接近于 1,內(nèi)標(biāo)相對于參照因子為:2/2.2. 2“Cf方法的應(yīng)用2CT方法的一個應(yīng)用就是確定實驗處理對某一候選內(nèi)標(biāo)基因的影響。為了顯示這一過程，我們做了血清饑餓/誘導(dǎo)實驗（7）。血清饑餓/誘導(dǎo)是研究某些 mRNA 降解的常用方法（8）。然而，血清可能影響一些基因的表達(dá)包括標(biāo)準(zhǔn)的看家基因的表達(dá)。在 24-h 血清饑餓培養(yǎng)之彳灸，在 NIH 3T3 細(xì)胞中加入 15%血清誘導(dǎo)基因表達(dá)。從細(xì)胞中提取Pol

24、y（A）+RNA，并將之反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。利用 SYBR Green 通過實時定量 PCR 檢測 GAPDH , 6 2 -microglobulin cDNA 的量。GAPDH 和 阻-microglobulin 各自的 相對量通過 2A。丁公式求得。細(xì)胞處理對于 GAPDH 的基因表達(dá)有明顯影響，但對 缶-microglobulin 沒有什么影響。因此 位-microglob ulin 很適合做血清刺激定量實驗的內(nèi)標(biāo)，而 GAPDH 并不適合。這一例子向大家展示了在只研究一個基因的時候怎么用2“CT的方法分析基因相 3.實時 PCR 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析實時 PCR 最終分析的是閾值循環(huán)或CT。CT值通過 PCR 信號的對數(shù)值和循環(huán)數(shù)來確定。因