限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基

1、寡核甘酸近末端位點(diǎn)的幅切(Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides)為什么要添加保護(hù)堿基？在分子克隆實(shí)驗(yàn)中，有時(shí)我們會(huì)在待擴(kuò)增的目的基因片段兩端加上特定 的酶切位點(diǎn)，用于后續(xù)的酶切和連接反應(yīng)。由于直接暴露在末端的酶切位 點(diǎn)不容易直接被限制性核酸內(nèi)切酶切開(kāi)，因此在設(shè)計(jì) PCR引物時(shí)，人為的 在酶切位點(diǎn)序列的 5端外側(cè)添加額外的堿基序列，即保護(hù)堿基，用來(lái)提高 將來(lái)酶切時(shí)的活性。其次，在分子克隆實(shí)驗(yàn)中選擇載體的酶切位點(diǎn)時(shí)，相臨的兩個(gè)酶切位點(diǎn) 往往不能同時(shí)使用，因?yàn)橐粋€(gè)位點(diǎn)切割后留下的堿基過(guò)少以至于影響旁邊 的酶切位點(diǎn)切割

2、。該如何添加保護(hù)堿基？添加保護(hù)堿基時(shí)， 最關(guān)心的應(yīng)該是保護(hù)堿基的數(shù)目，而不是種類。什么樣的酶切位點(diǎn)，添加幾個(gè)保護(hù)堿基，是有數(shù)據(jù)可以參考的。添加什么保護(hù)堿基，如果嚴(yán)格點(diǎn)， 是根據(jù)兩條引物的 Tm值和各引物的 堿基分布及GC含量。如果某條引物 Tm值偏小，GC%較低，添加時(shí)多加 G或C,反之亦反。為了解不同內(nèi)切酶對(duì)識(shí)別位點(diǎn)以外最少保護(hù)堿基數(shù)目的要求，NEB 采用了一系列含識(shí)別序列的短雙鏈寡核甘酸作為酶切底物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)于確定雙酶切 順序?qū)?huì)有幫助(比如在多接頭上切割位點(diǎn)很接近時(shí))，或者當(dāng)切割位點(diǎn)靠近 DNAC端時(shí)也很有用。在本表中沒(méi)有列出的酶，則通常需在識(shí)別位點(diǎn)兩端至少加 上6個(gè)保護(hù)堿基，

3、以確保酶切反應(yīng)的進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)方法：用丫- 32PATP在T4多聚核甘酸激酶的作用下標(biāo)記 0.1A260單位的寡 核甘酸。取1 pg已標(biāo)記了的寡核甘酸與20單位的內(nèi)切酶，在20。C條件下分別 反應(yīng)2小時(shí)和20小時(shí)。反應(yīng)緩沖液含 70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl 2 , 5 mMDTT及適量的NaCl或KCl (視酶的具體要求而定)。20%勺PAGE(7 M尿素) 凝膠電泳分析，經(jīng)放射自顯影確定酶切百分率。本實(shí)驗(yàn)采用自連接的寡核甘酸作為對(duì)照。若底物有較長(zhǎng)的回文結(jié)構(gòu)，切割效率則可能因?yàn)槌霈F(xiàn)發(fā)火結(jié)構(gòu)而降低。切割率%酶寡核甘酸序列鏈長(zhǎng)2 hr 20 hrAcc IGG

4、TCGAC C800CGGTCGAC CG1000CCG GTCGAC CGG1200Afl IIICACATGT G800CCACATGT GG10>90>90CCC ACATGT GGG12>90>90Asc IGGCGCGCC8>90>90AGGCGCGCC T10>90>90TTGGCGCGCC AA12>90>90fAva ICCCCGGG G850>90CCCCCGGG GG10>90>90TCC CCCGGG GGA12>90>90BamH ICGGATCC G81025CG GGATCC

5、CG10>90>90CGC GGATCC GCG12>90>90Bgl IICAGATCT G800GAAGATCT TC1075>90GGA AGATCT TCC1225>90BssH IIGGCGCGC C800AG GCGCGC CT1000TTG GCGCGC CAA1250>90BstE IIGGGT(A/T)ACC C9010rBstX IAACTGCAGAA CCAATGCATTGG2200AAAACTGCAG CCAATGCATTGG AA242550CTGCAGAA CCAATGCATTGG ATGCAT2725>90Cla I

6、CATCGAT G800GATCGAT C800CCATCGAT GG10>90>90CCC ATCGAT GGG125050EcoR IG GAATTC C8>90>90CG GAATTC CG10>90>90CCG GAATTC CGG12>90>90Hae IIIGG GGCC CC8>90>90AGC GGCC GCT10>90>90TTGC GGCC GCAA12>90>90IHind IIICAAGCTT GCCAAGCTT GG CCC AAGCTT GGG8101200100075Kpn IGG

7、GTACC C800GG GGTACC CC10>90>90CGG GGTACC CCG12>90>90Mlu IGACGCGT C800CG ACGCGT CG102550Nco ICCCATGG G800CATG CCATGG CATG145075Nde ICCATATG G800CC CATATG GG1000CGC CATATG GCG1200GGGIII CAIAIG AAACCC1800GGAATTC CAIAIG GAAIICC2075>90GGGAAIIC CAIAIG GAAIICCC2275>90Nhe IGGCIAGC C800CG G

8、CIAGC CG101025CIA GCIAGC IAG121050Not IIIGCGGCCGC AA1200AIII GCGGCCGC IIIA161010AAAIAI GCGGCCGC IAIAAA201010AIAAGAAI GCGGCCGC IAAACIAI242590AAGGAAAAAA GCGGCCGC AAAAGGAAAA2825>90LNsi IIGC AIGCAI GCA1210>90CCA AIGCAI IGGIICIGCAGII22>90>90Pac IIIAAIIAA800GIIAAIIAA C10025CC IIAAIIAA GG120>

9、;90Pme IGIIIAAAC800GGIIIAAAC C10025GGGIIIAAAC CC12050AGCIII GIIIAAAC GGCGCGCCGG2475>90Pst IGCIGCAG C800IGCA CIGCAG IGCA141010AACIGCAG AACCAAIGCAIIGG22>90>90AAAA CIGCAG CCAAIGCAIIGGAA24>90>90CIGCAG AACCAAIGCAIIGGAIGCAI2600rPvu ICCGATCG GATCGATCG AT TCG CGATCG CGA81012010002510Sac ICGAG

10、CTC G81010Sac IIGCCGCGG C800TCC CCGCGG GGA1250>90,Sal IGTCGAC GTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC2800GC GTCGAC GTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG301050ACGC GTCGAC GTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA321075Sca IGAGTACT C81025AAAAGIACI III127575Sma ICCCGGG6010CCCCGGG G8010CCCCCGGG GG101050TCC CCCGGG GGA12>90>90rSpe IGACTAGT C810>90GG ACTAGT CC1010>90CGG ACTAGT CCG12050CTAG ACTAGT CTAG14050LSph IGGCATGC C800CAT GCATGC ATG12025ACAT GCATGC ATGT141050Stu IAAGGCCT T8>90>90GAAGGCCT TC10>90>90AAAAGGCCI III12>90>90Xba ICTCTAGA G800GC TCTAGA GC10>90>90TGC TCTAGA GCA1275>