細(xì)胞培養(yǎng)體外培養(yǎng)的基本方法和過程

1、2021/3/231實(shí)驗(yàn)課時(shí)間實(shí)驗(yàn)課時(shí)間:第第7 9周周實(shí)驗(yàn)課地點(diǎn)實(shí)驗(yàn)課地點(diǎn):104館四樓館四樓注意事項(xiàng)注意事項(xiàng): :1.1.網(wǎng)上沒有名字的網(wǎng)上沒有名字的 同學(xué)同學(xué)請(qǐng)不要填報(bào)實(shí)請(qǐng)不要填報(bào)實(shí) 驗(yàn)課名單。驗(yàn)課名單。2.2.現(xiàn)在不能確定現(xiàn)在不能確定 自己時(shí)間的同學(xué)自己時(shí)間的同學(xué) 不要填報(bào)不要填報(bào), ,可以可以 下次上課時(shí)再報(bào)。下次上課時(shí)再報(bào)。3.3.一旦填報(bào)就不能一旦填報(bào)就不能 再更改時(shí)間。再更改時(shí)間。2021/3/232體外培養(yǎng)的基本原理與技術(shù)體外培養(yǎng)的基本原理與技術(shù)一、從體內(nèi)生存環(huán)境到體外生長(zhǎng)條件一、從體內(nèi)生存環(huán)境到體外生長(zhǎng)條件二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程三、體外培養(yǎng)

2、物的生長(zhǎng)生物學(xué)三、體外培養(yǎng)物的生長(zhǎng)生物學(xué)四、細(xì)胞分離與純化四、細(xì)胞分離與純化五、細(xì)胞系（株）、細(xì)胞克隆五、細(xì)胞系（株）、細(xì)胞克隆六、培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法六、培養(yǎng)物的觀察檢測(cè)方法2021/3/233二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程植塊植塊（explantexplant） : :從動(dòng)物體內(nèi)取出從動(dòng)物體內(nèi)取出, ,用于培養(yǎng)的小塊組織一般稱為用于培養(yǎng)的小塊組織一般稱為外植塊外植塊或或簡(jiǎn)稱簡(jiǎn)稱植塊植塊。分離（散）細(xì)胞分離（散）細(xì)胞isolatedisolated（dissociateddissociated）cellcell: :由組織塊分散后制成的單個(gè)細(xì)胞一般稱之。由組織塊分散后

3、制成的單個(gè)細(xì)胞一般稱之。細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液（cell suspensioncell suspension）: :單個(gè)細(xì)胞分散存在于培養(yǎng)液或者其它平衡鹽溶液、緩沖溶單個(gè)細(xì)胞分散存在于培養(yǎng)液或者其它平衡鹽溶液、緩沖溶液中液中, ,就稱之就稱之 。幾個(gè)名詞和概念幾個(gè)名詞和概念:2021/3/234當(dāng)培養(yǎng)物的總體積不斷擴(kuò)大當(dāng)培養(yǎng)物的總體積不斷擴(kuò)大, ,培養(yǎng)過程持續(xù)到一定的時(shí)候培養(yǎng)過程持續(xù)到一定的時(shí)候, ,原先的培養(yǎng)器皿已不能滿足培養(yǎng)物的空間要求原先的培養(yǎng)器皿已不能滿足培養(yǎng)物的空間要求, ,這時(shí)就需要將這時(shí)就需要將培養(yǎng)物分成若干小的部分培養(yǎng)物分成若干小的部分, ,繼續(xù)培養(yǎng)。繼續(xù)培養(yǎng)。因此因此, ,按照培養(yǎng)

4、過程中培養(yǎng)物是否需要被分割后再培養(yǎng)按照培養(yǎng)過程中培養(yǎng)物是否需要被分割后再培養(yǎng), ,而將體外培養(yǎng)分為而將體外培養(yǎng)分為原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)或稱或稱初代培養(yǎng)初代培養(yǎng)（primary cultureprimary culture）和和繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)（secondary culture)secondary culture)或稱或稱再培養(yǎng)再培養(yǎng)（subculturesubculture）兩大類。兩大類。二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程幾個(gè)名詞和概念幾個(gè)名詞和概念:2021/3/235（二）繼代培養(yǎng)（二）繼代培養(yǎng)（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù)（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù)（四）培養(yǎng)物的凍

5、存與復(fù)蘇（四）培養(yǎng)物的凍存與復(fù)蘇（五）培養(yǎng)物的污染（五）培養(yǎng)物的污染（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程2021/3/236（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)（primary culture）二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程原代培養(yǎng)原代培養(yǎng),通俗地講通俗地講,就是第一次培養(yǎng)。它是指將培養(yǎng)物放就是第一次培養(yǎng)。它是指將培養(yǎng)物放置在體外生長(zhǎng)環(huán)境中持續(xù)培養(yǎng)置在體外生長(zhǎng)環(huán)境中持續(xù)培養(yǎng),中途不分割培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程。中途不分割培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程。原代培養(yǎng)的概念包含以下幾方面含義原代培養(yǎng)的概念包含以下幾方面含義:原代培養(yǎng)的實(shí)質(zhì)就是初次培養(yǎng)原代培養(yǎng)的實(shí)

6、質(zhì)就是初次培養(yǎng),即培養(yǎng)物一經(jīng)接種到培即培養(yǎng)物一經(jīng)接種到培養(yǎng)器皿中就不再分割養(yǎng)器皿中就不再分割,任其生長(zhǎng)繁殖而不更換培養(yǎng)物的生長(zhǎng)器任其生長(zhǎng)繁殖而不更換培養(yǎng)物的生長(zhǎng)器皿皿;原代培養(yǎng)中的原代培養(yǎng)中的“代代”并不是指細(xì)胞的并不是指細(xì)胞的“代代”數(shù)數(shù),原代培原代培養(yǎng)物中的細(xì)胞在接種之后并不一定沒有分裂增殖。相反養(yǎng)物中的細(xì)胞在接種之后并不一定沒有分裂增殖。相反,在原在原代培養(yǎng)過程中代培養(yǎng)過程中,培養(yǎng)物中的細(xì)胞也可能經(jīng)歷多次的細(xì)胞分裂活培養(yǎng)物中的細(xì)胞也可能經(jīng)歷多次的細(xì)胞分裂活動(dòng)而產(chǎn)生多個(gè)子代細(xì)胞動(dòng)而產(chǎn)生多個(gè)子代細(xì)胞;2021/3/237原代培養(yǎng)過程中不分割培養(yǎng)物不等于不更換培養(yǎng)液原代培養(yǎng)過程中不分割培養(yǎng)物不

7、等于不更換培養(yǎng)液, ,也不等于不更換培養(yǎng)器皿也不等于不更換培養(yǎng)器皿, ,像蓋玻片培養(yǎng)法和懸滴培養(yǎng)法像蓋玻片培養(yǎng)法和懸滴培養(yǎng)法, ,即即便在換液過程中更換培養(yǎng)器皿便在換液過程中更換培養(yǎng)器皿, ,但不更換培養(yǎng)組織細(xì)胞所附但不更換培養(yǎng)組織細(xì)胞所附著的生長(zhǎng)基質(zhì)蓋片著的生長(zhǎng)基質(zhì)蓋片, ,仍屬于原代培養(yǎng)仍屬于原代培養(yǎng); ;植塊培養(yǎng)不一定都是原代培養(yǎng)植塊培養(yǎng)不一定都是原代培養(yǎng), ,植塊培養(yǎng)有時(shí)候在培植塊培養(yǎng)有時(shí)候在培養(yǎng)物增長(zhǎng)到一定程度后養(yǎng)物增長(zhǎng)到一定程度后, ,也需要分割培養(yǎng)物為較小的部分再也需要分割培養(yǎng)物為較小的部分再培養(yǎng)。培養(yǎng)。二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程（一）原代培養(yǎng)（一）原

8、代培養(yǎng)（primary culture）2021/3/238、取材及培養(yǎng)材料的制備、取材及培養(yǎng)材料的制備、分離（散）細(xì)胞的方法、分離（散）細(xì)胞的方法、接種與培養(yǎng)過程、接種與培養(yǎng)過程、更換培養(yǎng)液、更換培養(yǎng)液二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)（primary culture）2021/3/239（1 1）準(zhǔn)備工作）準(zhǔn)備工作: :（2 2）制備基本步驟（技術(shù)路線）制備基本步驟（技術(shù)路線）: :主要是主要是取材器具取材器具、用品用品的的滅菌滅菌以及以及實(shí)驗(yàn)者實(shí)驗(yàn)者、實(shí)驗(yàn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物物的的清潔與消毒清潔與消毒。、取材及培養(yǎng)材料的制備、取材及培養(yǎng)材料的制備:二

9、二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)（primary culture）2021/3/2310大塊組織大塊組織洗去血污洗去血污 剔除多余成分剔除多余成分切成約切成約1mm3大小的植塊大小的植塊植塊培養(yǎng)植塊培養(yǎng) 將所取組織剪碎將所取組織剪碎 蛋白酶溶液消化蛋白酶溶液消化 機(jī)械方法吹打組織塊機(jī)械方法吹打組織塊 不銹鋼網(wǎng)篩過濾不銹鋼網(wǎng)篩過濾 過濾液離心過濾液離心 用培養(yǎng)液懸浮成細(xì)胞懸液用培養(yǎng)液懸浮成細(xì)胞懸液 計(jì)數(shù)并調(diào)節(jié)細(xì)胞密度計(jì)數(shù)并調(diào)節(jié)細(xì)胞密度 培養(yǎng)分離的細(xì)胞培養(yǎng)分離的細(xì)胞二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程（2 2）基本步驟（技術(shù)路線）基

10、本步驟（技術(shù)路線）: :（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)（primary culture）2021/3/2311、取材及培養(yǎng)材料的制備、取材及培養(yǎng)材料的制備:二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程關(guān)于取材關(guān)于取材: :（1)1)取材要準(zhǔn)確取材要準(zhǔn)確: :取材是體外培養(yǎng)工作的開端。如果在取材是體外培養(yǎng)工作的開端。如果在這最初的實(shí)驗(yàn)過程中沒有取到合格、理想的實(shí)驗(yàn)材料這最初的實(shí)驗(yàn)過程中沒有取到合格、理想的實(shí)驗(yàn)材料, ,整個(gè)整個(gè)體外培養(yǎng)過程就很難達(dá)到預(yù)期的目的。體外培養(yǎng)過程就很難達(dá)到預(yù)期的目的。(2)(2)關(guān)于取材及制備培養(yǎng)材料的步驟關(guān)于取材及制備培養(yǎng)材料的步驟: :就動(dòng)物不同組織的就動(dòng)物

11、不同組織的取材而言取材而言, ,取材的步驟大同小異。但在具體操作過程中取材的步驟大同小異。但在具體操作過程中, ,還需還需要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)情況做一些調(diào)整。要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)情況做一些調(diào)整。（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)（primary culture）2021/3/2312、取材及培養(yǎng)材料的制備、取材及培養(yǎng)材料的制備、分離（散）細(xì)胞的方法、分離（散）細(xì)胞的方法、接種與培養(yǎng)過程、接種與培養(yǎng)過程、更換培養(yǎng)液、更換培養(yǎng)液二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)（primary culture）2021/3/2313（1 1）機(jī)械解離細(xì)胞法）機(jī)械解離細(xì)胞法: :

12、1 1）吸管吹打法）吸管吹打法- 2 2）過篩法）過篩法-（2 2）酶學(xué)解離細(xì)胞法）酶學(xué)解離細(xì)胞法: : 1 1）胰蛋白酶離解細(xì)胞法）胰蛋白酶離解細(xì)胞法- 2 2）膠原酶離解細(xì)胞法）膠原酶離解細(xì)胞法-（3 3）螯合劑解離細(xì)胞法）螯合劑解離細(xì)胞法: : 常用螯合劑常用螯合劑: :乙二胺四乙酸鈉（乙二胺四乙酸鈉（EDTA-NaEDTA-Na）、）、 檸檬酸鈉、檸檬酸鈉、 枸櫞酸鈉。枸櫞酸鈉。二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程、分離（散）細(xì)胞的方法、分離（散）細(xì)胞的方法:（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)（primary culture）2021/3/2314、取材及培養(yǎng)材料的制備、取

13、材及培養(yǎng)材料的制備、分離（散）細(xì)胞的方法、分離（散）細(xì)胞的方法、接種與培養(yǎng)過程、接種與培養(yǎng)過程、更換培養(yǎng)液、更換培養(yǎng)液二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)（primary culture）2021/3/2315、接種與培養(yǎng)過程、接種與培養(yǎng)過程二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程接種接種（seedingseeding）也稱）也稱種植種植(plating)(plating)或或體外移植體外移植(explantation),(explantation),實(shí)際上就是將取材并切割好的組織塊（植實(shí)際上就是將取材并切割好的組織塊（植塊）或者分離

14、好的細(xì)胞懸液加到培養(yǎng)器皿內(nèi)的過程。塊）或者分離好的細(xì)胞懸液加到培養(yǎng)器皿內(nèi)的過程。如果將準(zhǔn)備好的植塊（包括器官型植塊）接種并進(jìn)行培如果將準(zhǔn)備好的植塊（包括器官型植塊）接種并進(jìn)行培養(yǎng)養(yǎng), ,就稱為就稱為植塊培養(yǎng)植塊培養(yǎng)。體外移植體外移植的稱謂較多用于植塊培養(yǎng)的的稱謂較多用于植塊培養(yǎng)的情況。情況。如果將所制備的細(xì)胞懸液用于種植和培養(yǎng)如果將所制備的細(xì)胞懸液用于種植和培養(yǎng), ,就稱為就稱為分離分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)（散）細(xì)胞培養(yǎng)。（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)（primary culture）2021/3/2316、接種與培養(yǎng)過程、接種與培養(yǎng)過程二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程分離（散）

15、細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞如果屬于分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞如果屬于貼壁依賴型細(xì)胞貼壁依賴型細(xì)胞, ,在培養(yǎng)瓶皿中必須黏附于一定的生長(zhǎng)基質(zhì)表面才能生長(zhǎng)在培養(yǎng)瓶皿中必須黏附于一定的生長(zhǎng)基質(zhì)表面才能生長(zhǎng), ,這這樣的細(xì)胞一般只能在培養(yǎng)瓶皿表面長(zhǎng)滿一層樣的細(xì)胞一般只能在培養(yǎng)瓶皿表面長(zhǎng)滿一層, ,當(dāng)培養(yǎng)物長(zhǎng)滿當(dāng)培養(yǎng)物長(zhǎng)滿培養(yǎng)器皿的表面時(shí)即會(huì)因?yàn)榻佑|抑制而停止生長(zhǎng)培養(yǎng)器皿的表面時(shí)即會(huì)因?yàn)榻佑|抑制而停止生長(zhǎng), ,這種培養(yǎng)這種培養(yǎng)方式就稱為方式就稱為單層細(xì)胞培養(yǎng)（單層細(xì)胞培養(yǎng)（single-layer cell culture)single-layer cell culture)。如果所培養(yǎng)的細(xì)胞沒有貼壁依賴性如果所培養(yǎng)

16、的細(xì)胞沒有貼壁依賴性, ,在懸浮狀態(tài)下即可在懸浮狀態(tài)下即可以生長(zhǎng)和繁殖以生長(zhǎng)和繁殖, ,這樣的培養(yǎng)方式就稱為這樣的培養(yǎng)方式就稱為懸?。?xì)胞）培養(yǎng)懸?。?xì)胞）培養(yǎng)（suspension culturesuspension culture）。）。（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)（primary culture）2021/3/2317、接種與培養(yǎng)過程、接種與培養(yǎng)過程二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程（1 1）植塊培養(yǎng)）植塊培養(yǎng): :植塊培養(yǎng)是比較簡(jiǎn)單的培養(yǎng)方法植塊培養(yǎng)是比較簡(jiǎn)單的培養(yǎng)方法, ,其技術(shù)要點(diǎn)就是將從其技術(shù)要點(diǎn)就是將從動(dòng)物體內(nèi)所取得的組織切割成一定大小的植塊動(dòng)物體內(nèi)所取得的

17、組織切割成一定大小的植塊, ,再將植塊接再將植塊接種到培養(yǎng)瓶皿內(nèi)種到培養(yǎng)瓶皿內(nèi), ,加入培養(yǎng)液加入培養(yǎng)液, ,然后將培養(yǎng)瓶皿送入培養(yǎng)箱中然后將培養(yǎng)瓶皿送入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。進(jìn)行培養(yǎng)。植塊培養(yǎng)的目的主要有兩個(gè)植塊培養(yǎng)的目的主要有兩個(gè), ,其一其一是觀察植塊的組織學(xué)是觀察植塊的組織學(xué)生長(zhǎng)行為生長(zhǎng)行為, ,其二其二是通過植塊培養(yǎng)是通過植塊培養(yǎng), ,讓構(gòu)成植塊的細(xì)胞從植塊內(nèi)讓構(gòu)成植塊的細(xì)胞從植塊內(nèi)遷移出來并在植塊外分裂增殖遷移出來并在植塊外分裂增殖, ,然后將植塊去除然后將植塊去除, ,從而得到細(xì)從而得到細(xì)胞培養(yǎng)物。胞培養(yǎng)物。（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)（primary culture）2021/3/

18、2318、接種與培養(yǎng)過程、接種與培養(yǎng)過程二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程（2 2）分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)）分離（散）細(xì)胞培養(yǎng): :相對(duì)于植塊培養(yǎng)法相對(duì)于植塊培養(yǎng)法, ,分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)的最大優(yōu)點(diǎn)是分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)的最大優(yōu)點(diǎn)是: :解除了植塊內(nèi)細(xì)胞之間的解除了植塊內(nèi)細(xì)胞之間的“組織關(guān)系組織關(guān)系”, ,從而可以反映出單個(gè)從而可以反映出單個(gè)細(xì)胞的生物學(xué)特征。細(xì)胞的生物學(xué)特征。借助分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)法借助分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)法, ,還可以分離還可以分離(isolate)(isolate)或純或純化某一類型的細(xì)胞化某一類型的細(xì)胞, ,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)單一細(xì)胞類型（單一細(xì)胞類型（m

19、onotypic monotypic cell culturecell culture）進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)研究。進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)研究。動(dòng)物組織的大多數(shù)細(xì)胞類型都屬于動(dòng)物組織的大多數(shù)細(xì)胞類型都屬于貼壁（錨定）依賴型貼壁（錨定）依賴型細(xì)胞（細(xì)胞（anchorage-dependent cell)anchorage-dependent cell)。（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)（primary culture）2021/3/2319、接種與培養(yǎng)過程、接種與培養(yǎng)過程二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程（3 3）生長(zhǎng)基質(zhì)）生長(zhǎng)基質(zhì): :生長(zhǎng)基質(zhì)（生長(zhǎng)基質(zhì)（growth substratumgr

20、owth substratum）泛指泛指培養(yǎng)物附著的各種培養(yǎng)物附著的各種介質(zhì)介質(zhì), ,狹義特指狹義特指在塑料或玻璃培養(yǎng)器皿表面上涂布（包被）的一在塑料或玻璃培養(yǎng)器皿表面上涂布（包被）的一層能夠促進(jìn)培養(yǎng)物黏附、貼壁與鋪展的生物活性物質(zhì)。層能夠促進(jìn)培養(yǎng)物黏附、貼壁與鋪展的生物活性物質(zhì)。一般來說一般來說,國(guó)際上一些著名廠商生產(chǎn)的塑料或玻璃培養(yǎng)器皿國(guó)際上一些著名廠商生產(chǎn)的塑料或玻璃培養(yǎng)器皿,其使用的材質(zhì)能夠適宜大多數(shù)種類的動(dòng)物細(xì)胞體外生長(zhǎng)。只有其使用的材質(zhì)能夠適宜大多數(shù)種類的動(dòng)物細(xì)胞體外生長(zhǎng)。只有少數(shù)黏附和貼壁能力較差的細(xì)胞少數(shù)黏附和貼壁能力較差的細(xì)胞,需給予提供包被有特殊生長(zhǎng)基需給予提供包被有特殊生

21、長(zhǎng)基質(zhì)物質(zhì)的生長(zhǎng)表面。質(zhì)物質(zhì)的生長(zhǎng)表面。（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)（primary culture）2021/3/2320、接種與培養(yǎng)過程、接種與培養(yǎng)過程二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程（4 4）懸浮細(xì)胞培養(yǎng)（）懸浮細(xì)胞培養(yǎng)（suspension cell culture）對(duì)于有些細(xì)胞來說對(duì)于有些細(xì)胞來說, ,其生長(zhǎng)不需要黏附在某一固相表面便其生長(zhǎng)不需要黏附在某一固相表面便能分裂增殖。例如能分裂增殖。例如, ,某些白血病細(xì)胞、某些腹水瘤細(xì)胞等。某些白血病細(xì)胞、某些腹水瘤細(xì)胞等。體外培養(yǎng)這種細(xì)胞時(shí)體外培養(yǎng)這種細(xì)胞時(shí),可以通過對(duì)培養(yǎng)液以及其中的細(xì)胞可以通過對(duì)培養(yǎng)液以及其中的

22、細(xì)胞進(jìn)行不斷攪拌進(jìn)行不斷攪拌,或?qū)ε囵B(yǎng)器皿進(jìn)行振蕩、快速旋轉(zhuǎn)而維持細(xì)胞或?qū)ε囵B(yǎng)器皿進(jìn)行振蕩、快速旋轉(zhuǎn)而維持細(xì)胞的懸浮狀態(tài)。也有一些細(xì)胞無須攪拌或用搖床搖動(dòng)的懸浮狀態(tài)。也有一些細(xì)胞無須攪拌或用搖床搖動(dòng),只要在培只要在培養(yǎng)器皿表面涂布一層不利于細(xì)胞粘附的硅脂即可維持懸浮狀態(tài)。養(yǎng)器皿表面涂布一層不利于細(xì)胞粘附的硅脂即可維持懸浮狀態(tài)。這種培養(yǎng)方法就稱為這種培養(yǎng)方法就稱為懸浮細(xì)胞培養(yǎng)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)（primary culture）2021/3/2321、取材及培養(yǎng)材料的制備、取材及培養(yǎng)材料的制備、分離（散）細(xì)胞的方法、分離（散）細(xì)胞的方法、接種與培養(yǎng)過程、接種與培養(yǎng)過程、更換

23、培養(yǎng)液、更換培養(yǎng)液二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)（primary culture）2021/3/2322、更換培養(yǎng)液、更換培養(yǎng)液二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程隨著培養(yǎng)的進(jìn)程隨著培養(yǎng)的進(jìn)程, ,營(yíng)養(yǎng)物被消耗營(yíng)養(yǎng)物被消耗, ,細(xì)胞的代謝產(chǎn)物愈來愈細(xì)胞的代謝產(chǎn)物愈來愈多多, ,尤其是細(xì)胞呼吸反應(yīng)尤其是細(xì)胞呼吸反應(yīng), ,釋放出的釋放出的COCO2 2及其它酸性代謝產(chǎn)物及其它酸性代謝產(chǎn)物（如乳酸和丙酮酸）越來越多（如乳酸和丙酮酸）越來越多, ,培養(yǎng)液的培養(yǎng)液的p pH H值越來越低值越來越低, ,培養(yǎng)培養(yǎng)液的顏色越來越黃。液的顏

24、色越來越黃。根據(jù)培養(yǎng)液的根據(jù)培養(yǎng)液的顏色變化顏色變化確定換液的間隔時(shí)間是很有確定換液的間隔時(shí)間是很有實(shí)際實(shí)際意義意義的。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗的快慢還取決于所接種的細(xì)胞數(shù)量。的。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗的快慢還取決于所接種的細(xì)胞數(shù)量。隨著培養(yǎng)過程的繼續(xù)隨著培養(yǎng)過程的繼續(xù), ,細(xì)胞會(huì)分裂增生細(xì)胞會(huì)分裂增生, ,數(shù)量增加數(shù)量增加, ,換液換液的時(shí)間間隔就可能越來越短。的時(shí)間間隔就可能越來越短。（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)（primary culture）2021/3/2323二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程5 5、原代細(xì)胞培養(yǎng)方法的注意事項(xiàng)、原代細(xì)胞培養(yǎng)方法的注意事項(xiàng)（1 1）關(guān)于培養(yǎng)液）關(guān)于培養(yǎng)

25、液: :1)1)培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)基的選擇: :培養(yǎng)某一種細(xì)胞培養(yǎng)某一種細(xì)胞, ,到底選用哪一種培養(yǎng)基到底選用哪一種培養(yǎng)基, ,需要根需要根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況摸索確定。據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況摸索確定。2 2）添加物添加物: :選擇好培養(yǎng)基類型以后選擇好培養(yǎng)基類型以后, ,還要摸索需要補(bǔ)加的成分及其還要摸索需要補(bǔ)加的成分及其添加量。添加量。3)3)培養(yǎng)液的酸堿度培養(yǎng)液的酸堿度: :普通動(dòng)物細(xì)胞一般適宜的普通動(dòng)物細(xì)胞一般適宜的p pH H范圍為范圍為7.27.27.47.4當(dāng)當(dāng)p pH H值低于值低于6.86.8時(shí)時(shí), ,會(huì)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。會(huì)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。4)4)換液換液: :換液時(shí)換

26、液時(shí), ,如果細(xì)胞密度很低或者細(xì)胞的生長(zhǎng)較為緩慢如果細(xì)胞密度很低或者細(xì)胞的生長(zhǎng)較為緩慢, ,可以可以不完全更換培養(yǎng)液不完全更換培養(yǎng)液, ,只吸出一半的舊培養(yǎng)液只吸出一半的舊培養(yǎng)液, ,補(bǔ)加相同體積的新培補(bǔ)加相同體積的新培養(yǎng)液即可。養(yǎng)液即可。培養(yǎng)液最好經(jīng)事先預(yù)溫至培養(yǎng)液最好經(jīng)事先預(yù)溫至37370 0C C。（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)（primary culture）2021/3/2324二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程5 5、原代細(xì)胞培養(yǎng)方法的注意事項(xiàng)、原代細(xì)胞培養(yǎng)方法的注意事項(xiàng)（2 2）關(guān)于培養(yǎng)空間）關(guān)于培養(yǎng)空間: :培養(yǎng)空間是指培養(yǎng)物生存的空間培養(yǎng)空間是指培養(yǎng)物生存的

27、空間, ,包括包括液相環(huán)境液相環(huán)境與與氣相氣相環(huán)境環(huán)境兩方面。兩方面。調(diào)整培養(yǎng)空間的調(diào)整培養(yǎng)空間的主要目的主要目的是改變對(duì)培養(yǎng)物的供氧量。是改變對(duì)培養(yǎng)物的供氧量。一般來說一般來說, ,培養(yǎng)液與液面上的空間二者之間的體積比例培養(yǎng)液與液面上的空間二者之間的體積比例以以1 1: :1010為宜。加入的培養(yǎng)液液面高度最好維持在為宜。加入的培養(yǎng)液液面高度最好維持在2 25mm5mm的的范圍。范圍。（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)（primary culture）2021/3/2325二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程5 5、原代細(xì)胞培養(yǎng)方法的注意事項(xiàng)、原代細(xì)胞培養(yǎng)方法的注意事項(xiàng)（3 3）

28、其它方面）其它方面: : 必須根據(jù)不同必須根據(jù)不同細(xì)胞生命力細(xì)胞生命力的不同以及對(duì)環(huán)境轉(zhuǎn)變適應(yīng)的不同以及對(duì)環(huán)境轉(zhuǎn)變適應(yīng)能力的不同能力的不同, ,選擇適宜的取材、分散、種植方法和選用適選擇適宜的取材、分散、種植方法和選用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件。當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件。 除了所培養(yǎng)細(xì)胞自身的活力外除了所培養(yǎng)細(xì)胞自身的活力外, ,原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)不成功最大不成功最大的可能性有兩點(diǎn)的可能性有兩點(diǎn): :其一其一是在對(duì)組織是在對(duì)組織分散分散并并分離分離細(xì)胞的過程細(xì)胞的過程中嚴(yán)重?fù)p傷了細(xì)胞中嚴(yán)重?fù)p傷了細(xì)胞, ,其二其二是給細(xì)胞提供的體外生長(zhǎng)環(huán)境是給細(xì)胞提供的體外生長(zhǎng)環(huán)境, ,尤尤其是其是生長(zhǎng)基質(zhì)生長(zhǎng)基質(zhì)與與培養(yǎng)液培養(yǎng)液條件不

29、合適。條件不合適。（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)（primary culture）2021/3/2326（二）繼代培養(yǎng)（二）繼代培養(yǎng)（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù)（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù)（四）培養(yǎng)物的凍存與復(fù)蘇（四）培養(yǎng)物的凍存與復(fù)蘇（五）培養(yǎng)物的污染（五）培養(yǎng)物的污染（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程2021/3/2327（二）繼代培養(yǎng)（二）繼代培養(yǎng)（secondary culture）二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程將培養(yǎng)物分割成小的部分將培養(yǎng)物分割成小的部分, ,重新接種到另外的培養(yǎng)器皿內(nèi)重新接種到另外的培養(yǎng)器皿內(nèi)

30、, ,再進(jìn)行培養(yǎng)再進(jìn)行培養(yǎng), ,這個(gè)過程就稱為這個(gè)過程就稱為傳代（傳代（passagepassage）或者或者再培養(yǎng)再培養(yǎng)（subculturesubculture）。）。傳代培養(yǎng)的實(shí)質(zhì)就是傳代培養(yǎng)的實(shí)質(zhì)就是分割后再次培養(yǎng)分割后再次培養(yǎng)。只要是將培養(yǎng)物從一個(gè)培養(yǎng)器皿轉(zhuǎn)移到另一個(gè)器皿之內(nèi)只要是將培養(yǎng)物從一個(gè)培養(yǎng)器皿轉(zhuǎn)移到另一個(gè)器皿之內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)就算繼續(xù)培養(yǎng)就算傳代傳代。即便是按。即便是按“一傳一一傳一”的比例進(jìn)行傳代。的比例進(jìn)行傳代。2021/3/23281 1、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標(biāo)、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標(biāo)2 2、傳代的過程、傳代的過程3 3、傳代培養(yǎng)的注意事項(xiàng)、傳代培養(yǎng)的注意事項(xiàng)二二、體外

31、培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程（二）繼代培養(yǎng)（二）繼代培養(yǎng)（secondary culture）2021/3/2329二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程（1 1）植塊培養(yǎng)物與器官培養(yǎng)物）植塊培養(yǎng)物與器官培養(yǎng)物: :植塊培養(yǎng)物生長(zhǎng)一定時(shí)間之后植塊培養(yǎng)物生長(zhǎng)一定時(shí)間之后, ,從植塊內(nèi)長(zhǎng)出從植塊內(nèi)長(zhǎng)出（outgrowingoutgrowing）的細(xì)胞會(huì)越來越多）的細(xì)胞會(huì)越來越多, ,遷移出來的細(xì)胞也會(huì)不斷遷移出來的細(xì)胞也會(huì)不斷分裂繁殖分裂繁殖, ,逐漸長(zhǎng)滿所附著的生長(zhǎng)基質(zhì)表面逐漸長(zhǎng)滿所附著的生長(zhǎng)基質(zhì)表面, ,細(xì)胞之間逐漸發(fā)生細(xì)胞之間逐漸發(fā)生接觸性抑制現(xiàn)象。接觸性抑制

32、現(xiàn)象。若不將原代培養(yǎng)物分割再進(jìn)行培養(yǎng)若不將原代培養(yǎng)物分割再進(jìn)行培養(yǎng), ,植塊培養(yǎng)物可能會(huì)停植塊培養(yǎng)物可能會(huì)停止生長(zhǎng)。止生長(zhǎng)。1 1、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標(biāo)、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標(biāo)（二）繼代培養(yǎng)（二）繼代培養(yǎng)（secondary culture）2021/3/2330二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程（2 2）分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)物）分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)物: :對(duì)于貼壁依賴型細(xì)胞來講對(duì)于貼壁依賴型細(xì)胞來講, ,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng), ,細(xì)胞分細(xì)胞分裂增殖裂增殖, ,數(shù)量愈來愈大數(shù)量愈來愈大, ,逐漸會(huì)在培養(yǎng)瓶皿的底壁形成一完整逐漸會(huì)在培養(yǎng)瓶皿的底壁形成一完整的

33、細(xì)胞層的細(xì)胞層, ,細(xì)胞之間因接觸性抑制作用而停止生長(zhǎng)細(xì)胞之間因接觸性抑制作用而停止生長(zhǎng), ,此時(shí)便需此時(shí)便需要進(jìn)行傳代。要進(jìn)行傳代。判斷分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)物是否需要傳代的判斷分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)物是否需要傳代的主要指標(biāo)主要指標(biāo)就就是觀察培養(yǎng)物是觀察培養(yǎng)物是否已基本長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶皿的底壁是否已基本長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶皿的底壁。1 1、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標(biāo)、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標(biāo)（二）繼代培養(yǎng)（二）繼代培養(yǎng)（secondary culture）2021/3/2331二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程（3 3）懸浮培養(yǎng)物）懸浮培養(yǎng)物: :懸浮培養(yǎng)細(xì)胞之間雖然不容易發(fā)生接觸性抑制現(xiàn)象懸浮培

34、養(yǎng)細(xì)胞之間雖然不容易發(fā)生接觸性抑制現(xiàn)象, ,但但隨著培養(yǎng)液中細(xì)胞數(shù)量的增加隨著培養(yǎng)液中細(xì)胞數(shù)量的增加, ,細(xì)胞的生存空間會(huì)越來越小細(xì)胞的生存空間會(huì)越來越小, ,營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)愈趨緊張營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)愈趨緊張, ,代謝產(chǎn)物積聚代謝產(chǎn)物積聚, ,培養(yǎng)環(huán)境逐漸不適應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境逐漸不適應(yīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)的生長(zhǎng), ,因而需要傳代。因而需要傳代。1 1、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標(biāo)、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標(biāo)（二）繼代培養(yǎng)（二）繼代培養(yǎng)（secondary culture）2021/3/23321 1、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標(biāo)、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標(biāo)2 2、傳代的過程、傳代的過程3 3、傳代培養(yǎng)的注意事項(xiàng)、傳代培養(yǎng)的注意事項(xiàng)二

35、二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程（二）繼代培養(yǎng)（二）繼代培養(yǎng)（secondary culture）2021/3/2333二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程2 2、傳代的過程、傳代的過程（1 1）分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)物）分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)物 : : （貼壁依賴型細(xì)胞）（貼壁依賴型細(xì)胞）1 1）棄去原培養(yǎng)液（吸出或傾倒）棄去原培養(yǎng)液（吸出或傾倒） ; ;2 2）漂洗）漂洗: :1212次次, ,3 3）離解細(xì)胞）離解細(xì)胞: :4 4）終止消化）終止消化: :5 5）吹打分離細(xì)胞）吹打分離細(xì)胞: :6 6）離心）離心: :7 7）重新懸浮、計(jì)數(shù)）重新懸浮、計(jì)數(shù):

36、 :8 8）分裝）分裝: :9 9）送培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。）送培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。（二）繼代培養(yǎng)（二）繼代培養(yǎng)（secondary culture）2021/3/2334（2 2）懸浮培養(yǎng)物）懸浮培養(yǎng)物: :無需分割培養(yǎng)物。無需分割培養(yǎng)物。1 1）離心）離心: :2 2）重新懸浮、計(jì)數(shù)）重新懸浮、計(jì)數(shù): :3 3）分裝）分裝: :4 4）送培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。）送培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程2 2、傳代的過程、傳代的過程（二）繼代培養(yǎng)（二）繼代培養(yǎng)（secondary culture）2021/3/2335二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程2

37、2、傳代的過程、傳代的過程（3 3）植塊培養(yǎng)物）植塊培養(yǎng)物: : 對(duì)這種培養(yǎng)物對(duì)這種培養(yǎng)物, ,僅在少數(shù)情況下再培養(yǎng)。僅在少數(shù)情況下再培養(yǎng)。由于它們一般是種植在生長(zhǎng)基質(zhì)蓋玻片上由于它們一般是種植在生長(zhǎng)基質(zhì)蓋玻片上, ,再培養(yǎng)時(shí)一般再培養(yǎng)時(shí)一般不更換生長(zhǎng)基質(zhì)蓋玻片不更換生長(zhǎng)基質(zhì)蓋玻片, ,只是將培養(yǎng)物分割并舍棄部分培養(yǎng)物只是將培養(yǎng)物分割并舍棄部分培養(yǎng)物, ,而將剩余的培養(yǎng)物繼續(xù)培養(yǎng)而將剩余的培養(yǎng)物繼續(xù)培養(yǎng)（二）繼代培養(yǎng)（二）繼代培養(yǎng)（secondary culture）2021/3/23361 1、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標(biāo)、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標(biāo)2 2、傳代的過程、傳代的過程3 3、傳代培養(yǎng)的

38、注意事項(xiàng)、傳代培養(yǎng)的注意事項(xiàng)二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程（二）繼代培養(yǎng)（二）繼代培養(yǎng)（secondary culture）2021/3/2337二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程3 3、傳代培養(yǎng)的注意事項(xiàng)、傳代培養(yǎng)的注意事項(xiàng)傳代培養(yǎng)首先必須注意的事項(xiàng)傳代培養(yǎng)首先必須注意的事項(xiàng):根據(jù)不同細(xì)胞的承受能力根據(jù)不同細(xì)胞的承受能力;選擇合適的時(shí)間選擇合適的時(shí)間;采用適當(dāng)?shù)姆椒?。采用適當(dāng)?shù)姆椒?。（二）繼代培養(yǎng)（二）繼代培養(yǎng)（secondary culture）2021/3/2338二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程3 3、傳代培養(yǎng)的注意事項(xiàng)

39、、傳代培養(yǎng)的注意事項(xiàng)（1 1）傳代的時(shí)機(jī)與再培養(yǎng)的細(xì)胞密度）傳代的時(shí)機(jī)與再培養(yǎng)的細(xì)胞密度: :不要急于傳代是對(duì)大多數(shù)生命力較為脆弱的細(xì)胞體外培養(yǎng)不要急于傳代是對(duì)大多數(shù)生命力較為脆弱的細(xì)胞體外培養(yǎng)的的上策上策。除非需要利用傳代實(shí)現(xiàn)其它的目的除非需要利用傳代實(shí)現(xiàn)其它的目的, ,如通過傳代對(duì)培養(yǎng)物如通過傳代對(duì)培養(yǎng)物中的混合細(xì)胞進(jìn)行分離。中的混合細(xì)胞進(jìn)行分離。由于在體時(shí)細(xì)胞之間的相互作用有利于細(xì)胞的生存和生命由于在體時(shí)細(xì)胞之間的相互作用有利于細(xì)胞的生存和生命活動(dòng)活動(dòng), ,因而在進(jìn)行體外分離細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)盡量給細(xì)胞提供相互作因而在進(jìn)行體外分離細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)盡量給細(xì)胞提供相互作用的條件。一個(gè)重要的方法就是增大接種

40、的細(xì)胞密度用的條件。一個(gè)重要的方法就是增大接種的細(xì)胞密度, ,使培養(yǎng)使培養(yǎng)的細(xì)胞盡快發(fā)生相互作用。的細(xì)胞盡快發(fā)生相互作用。（二）繼代培養(yǎng)（二）繼代培養(yǎng)（secondary culture）2021/3/2339二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程3 3、傳代培養(yǎng)的注意事項(xiàng)、傳代培養(yǎng)的注意事項(xiàng)（2 2）傳代數(shù)或代數(shù)與培養(yǎng)物的生長(zhǎng)）傳代數(shù)或代數(shù)與培養(yǎng)物的生長(zhǎng): :傳代數(shù)或代數(shù)（傳代數(shù)或代數(shù)（passage numberpassage number）是指對(duì)培養(yǎng)物傳代的次）是指對(duì)培養(yǎng)物傳代的次數(shù)。用它可以相對(duì)地衡量某一培養(yǎng)物的數(shù)。用它可以相對(duì)地衡量某一培養(yǎng)物的培養(yǎng)年齡培養(yǎng)年齡（cul

41、ture culture ageage）。）。經(jīng)過一次傳代經(jīng)過一次傳代, ,細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境就發(fā)生一次大的變化。體細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境就發(fā)生一次大的變化。體外生長(zhǎng)的細(xì)胞若處于外生長(zhǎng)的細(xì)胞若處于“動(dòng)蕩動(dòng)蕩”的生活環(huán)境中的生活環(huán)境中, ,其生物學(xué)性狀往其生物學(xué)性狀往往容易發(fā)生改變往容易發(fā)生改變, ,尤其是細(xì)胞的遺傳特性可能會(huì)發(fā)生改變。尤其是細(xì)胞的遺傳特性可能會(huì)發(fā)生改變。應(yīng)該認(rèn)識(shí)到應(yīng)該認(rèn)識(shí)到,傳代對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和性狀是有影響的傳代對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和性狀是有影響的,在必要性在必要性不強(qiáng)的情況下不強(qiáng)的情況下,少傳代為上。少傳代為上。（二）繼代培養(yǎng)（二）繼代培養(yǎng)（secondary culture）2021/3/2340（

42、二）繼代培養(yǎng)（二）繼代培養(yǎng)（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù)（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù)（四）培養(yǎng)物的凍存與復(fù)蘇（四）培養(yǎng)物的凍存與復(fù)蘇（五）培養(yǎng)物的污染（五）培養(yǎng)物的污染（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程2021/3/2341二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù)（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù)這里要介紹的是這里要介紹的是,體外培養(yǎng)這門技術(shù)從創(chuàng)體外培養(yǎng)這門技術(shù)從創(chuàng)立以來所發(fā)展起來的、若干種被普遍運(yùn)用的、立以來所發(fā)展起來的、若干種被普遍運(yùn)用的、具有代表性的基本方法和技術(shù)。具有代表性的基本方法和技術(shù)。這些基

43、本的方法和技術(shù)有的還在使用這些基本的方法和技術(shù)有的還在使用,有有的則已不常使用的則已不常使用,代之以一些改良的方法和技代之以一些改良的方法和技術(shù)。術(shù)。2021/3/2342二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù)（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù)1 1、懸滴培養(yǎng)法、懸滴培養(yǎng)法2 2、培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法3 3、蓋玻片培養(yǎng)法、蓋玻片培養(yǎng)法4 4、旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法、旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法5 5、灌注小室培養(yǎng)法、灌注小室培養(yǎng)法6 6、培養(yǎng)板培養(yǎng)法培養(yǎng)板培養(yǎng)法7 7、二倍體細(xì)胞培養(yǎng)法、二倍體細(xì)胞培養(yǎng)法8 8、克隆培養(yǎng)法克隆培養(yǎng)法9 9、中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、中空纖維細(xì)胞培

44、養(yǎng)技術(shù)1010、微載體細(xì)胞培養(yǎng)法、微載體細(xì)胞培養(yǎng)法1111、微囊培養(yǎng)技術(shù)、微囊培養(yǎng)技術(shù)2021/3/23432 2、培養(yǎng)瓶（培養(yǎng)瓶（culture flaskculture flask）培養(yǎng)法培養(yǎng)法凡是可以用于培養(yǎng)生物結(jié)構(gòu)成分的瓶子都可凡是可以用于培養(yǎng)生物結(jié)構(gòu)成分的瓶子都可以叫做以叫做培養(yǎng)瓶培養(yǎng)瓶。早期的培養(yǎng)瓶主要是早期的培養(yǎng)瓶主要是玻璃玻璃培養(yǎng)瓶培養(yǎng)瓶, ,如今國(guó)外主如今國(guó)外主要用一次性使用的要用一次性使用的塑料塑料培養(yǎng)瓶。培養(yǎng)瓶。 卡氏瓶卡氏瓶（carlsbergs flask） 北京瓶北京瓶 塑料培養(yǎng)瓶塑料培養(yǎng)瓶 所謂所謂培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法, ,就是將擬培養(yǎng)對(duì)象直接接種就是將擬培養(yǎng)

45、對(duì)象直接接種在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi), ,再放入培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)的方法。這種培再放入培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)的方法。這種培養(yǎng)法只是強(qiáng)調(diào)所用的培養(yǎng)器皿是培養(yǎng)瓶而已。養(yǎng)法只是強(qiáng)調(diào)所用的培養(yǎng)器皿是培養(yǎng)瓶而已。 2021/3/2344卡氏瓶卡氏瓶北京瓶北京瓶經(jīng)典的培養(yǎng)瓶經(jīng)典的培養(yǎng)瓶2021/3/23456 6、培養(yǎng)板培養(yǎng)法培養(yǎng)板培養(yǎng)法培養(yǎng)板培養(yǎng)法培養(yǎng)板培養(yǎng)法過去曾被稱為過去曾被稱為微量培養(yǎng)法微量培養(yǎng)法（microculturemicroculture）: :是現(xiàn)代體外培養(yǎng)技術(shù)中最為普遍應(yīng)用的常規(guī)培養(yǎng)方法之一。是現(xiàn)代體外培養(yǎng)技術(shù)中最為普遍應(yīng)用的常規(guī)培養(yǎng)方法之一。它是將所培養(yǎng)的細(xì)胞接種在培養(yǎng)板的孔內(nèi)它是將所培養(yǎng)的細(xì)胞接種

46、在培養(yǎng)板的孔內(nèi), ,然后在然后在COCO2 2培養(yǎng)箱中進(jìn)培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)的一種培養(yǎng)方法。行培養(yǎng)的一種培養(yǎng)方法。 培養(yǎng)板的應(yīng)用使得細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)板的應(yīng)用使得細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化, ,使得細(xì)使得細(xì)胞培養(yǎng)可以微量培養(yǎng)的方式進(jìn)行胞培養(yǎng)可以微量培養(yǎng)的方式進(jìn)行, ,使得科研工作者能夠?qū)ε囵B(yǎng)使得科研工作者能夠?qū)ε囵B(yǎng)物進(jìn)行規(guī)范的、定量的組間比較。物進(jìn)行規(guī)范的、定量的組間比較。培養(yǎng)板一般都是一次性使用的培養(yǎng)器皿培養(yǎng)板一般都是一次性使用的培養(yǎng)器皿, ,有極為規(guī)范的商有極為規(guī)范的商品供應(yīng)。品供應(yīng)。 2021/3/23468 8、克隆培養(yǎng)法（、克隆培養(yǎng)法（cloning culture tech

47、niquecloning culture technique） 克?。寺。╟loneclone）一詞既有名詞意義又有動(dòng)詞含義。一詞既有名詞意義又有動(dòng)詞含義。作名詞講時(shí)作名詞講時(shí), ,意指由同一個(gè)祖細(xì)胞分裂增生而來的一個(gè)子意指由同一個(gè)祖細(xì)胞分裂增生而來的一個(gè)子細(xì)胞群細(xì)胞群, ,體外培養(yǎng)技術(shù)中常用的細(xì)胞克隆（體外培養(yǎng)技術(shù)中常用的細(xì)胞克?。╟ell clonecell clone或或colonycolony）即為此意。即為此意。作動(dòng)詞解時(shí)作動(dòng)詞解時(shí), ,克隆一詞主要指從同一個(gè)祖細(xì)胞經(jīng)分裂增殖克隆一詞主要指從同一個(gè)祖細(xì)胞經(jīng)分裂增殖而產(chǎn)生一個(gè)子細(xì)胞群的過程而產(chǎn)生一個(gè)子細(xì)胞群的過程, ,體外培養(yǎng)技術(shù)中的

48、細(xì)胞克隆體外培養(yǎng)技術(shù)中的細(xì)胞克?。╟ell cloningcell cloning）就是這個(gè)意思。就是這個(gè)意思。 克隆培養(yǎng)法也可以稱作克隆培養(yǎng)法也可以稱作單細(xì)胞分離培養(yǎng)法單細(xì)胞分離培養(yǎng)法（single cell single cell cultureculture）, ,就是將從細(xì)胞懸液中獲得的單個(gè)細(xì)胞用于培養(yǎng)就是將從細(xì)胞懸液中獲得的單個(gè)細(xì)胞用于培養(yǎng), ,使使之分裂增殖而產(chǎn)生一個(gè)細(xì)胞群的培養(yǎng)方法。之分裂增殖而產(chǎn)生一個(gè)細(xì)胞群的培養(yǎng)方法。 2021/3/2347克隆培養(yǎng)法克隆培養(yǎng)法最基本的要求是最基本的要求是擬用于培養(yǎng)并分裂增殖的祖細(xì)擬用于培養(yǎng)并分裂增殖的祖細(xì)胞必須是一個(gè)細(xì)胞胞必須是一個(gè)細(xì)胞, ,

49、如此才能獲得具有同一祖先的子細(xì)胞群。如此才能獲得具有同一祖先的子細(xì)胞群。 理論上講理論上講, ,各種生物體細(xì)胞都可以進(jìn)行克隆培養(yǎng)各種生物體細(xì)胞都可以進(jìn)行克隆培養(yǎng), ,但由于細(xì)但由于細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)繁殖的環(huán)境、生命力等方面均不如在體時(shí)胞在體外培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)繁殖的環(huán)境、生命力等方面均不如在體時(shí)的情況。所以的情況。所以, ,能夠進(jìn)行克隆培養(yǎng)的細(xì)胞一般只是一些細(xì)胞活能夠進(jìn)行克隆培養(yǎng)的細(xì)胞一般只是一些細(xì)胞活力強(qiáng)、增殖能力強(qiáng)、對(duì)體外生長(zhǎng)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)的細(xì)胞力強(qiáng)、增殖能力強(qiáng)、對(duì)體外生長(zhǎng)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)的細(xì)胞,如腫瘤如腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化（無限）細(xì)胞系、（胚胎）干細(xì)胞以及微生物細(xì)胞細(xì)胞和轉(zhuǎn)化（無限）細(xì)胞系、（胚胎）干細(xì)胞

50、以及微生物細(xì)胞等。這些細(xì)胞種類即便是單個(gè)細(xì)胞被置于體外培養(yǎng)環(huán)境等。這些細(xì)胞種類即便是單個(gè)細(xì)胞被置于體外培養(yǎng)環(huán)境,也可也可以逐漸適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境并行分裂增殖以逐漸適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境并行分裂增殖,從而形成一群子細(xì)胞。從而形成一群子細(xì)胞。8 8、克隆培養(yǎng)法（、克隆培養(yǎng)法（cloning culture techniquecloning culture technique） 2021/3/2348實(shí)驗(yàn)課時(shí)間實(shí)驗(yàn)課時(shí)間:第第7 9周周實(shí)驗(yàn)課地點(diǎn)實(shí)驗(yàn)課地點(diǎn):104館四樓館四樓注意事項(xiàng)注意事項(xiàng): :1.1.網(wǎng)上沒有名字的網(wǎng)上沒有名字的 同學(xué)同學(xué)請(qǐng)不要填報(bào)實(shí)請(qǐng)不要填報(bào)實(shí) 驗(yàn)課名單。驗(yàn)課名單。2.2.現(xiàn)在不能確定現(xiàn)在不能

51、確定 自己時(shí)間的同學(xué)自己時(shí)間的同學(xué) 不要填報(bào)不要填報(bào), ,可以可以 下次上課時(shí)再報(bào)。下次上課時(shí)再報(bào)。3.3.一旦填報(bào)就不能一旦填報(bào)就不能 再更改時(shí)間。再更改時(shí)間。2021/3/2349（二）繼代培養(yǎng)（二）繼代培養(yǎng)（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù)（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù)（四）培養(yǎng)物的凍存與復(fù)蘇（四）培養(yǎng)物的凍存與復(fù)蘇（五）培養(yǎng)物的污染（五）培養(yǎng)物的污染（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程2021/3/2350（四）培養(yǎng)物的凍存與復(fù)蘇（四）培養(yǎng)物的凍存與復(fù)蘇二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程在體外培養(yǎng)工作中在體外培養(yǎng)工作中, ,

52、為了保種和長(zhǎng)期保存培養(yǎng)物的活性為了保種和長(zhǎng)期保存培養(yǎng)物的活性, ,常須將培養(yǎng)物進(jìn)行冷凍保存常須將培養(yǎng)物進(jìn)行冷凍保存, ,并在需要的時(shí)候重新復(fù)蘇和培養(yǎng)。并在需要的時(shí)候重新復(fù)蘇和培養(yǎng)。、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理冷凍保存冷凍保存（cryopreservation）:就是將體外培養(yǎng)物懸就是將體外培養(yǎng)物懸 浮在加有或不加冷凍保護(hù)劑的溶液中浮在加有或不加冷凍保護(hù)劑的溶液中, ,以一定的以一定的 冷凍速率降至零下某一溫度（一般是低于冷凍速率降至零下某一溫度（一般是低于-70-70 的超低溫條件）的超低溫條件）, ,并在此溫度下對(duì)其長(zhǎng)期保存的并在此溫度下對(duì)其長(zhǎng)期保存的 過程。過程

53、。復(fù)蘇復(fù)蘇（thawing）:就是以一定的復(fù)溫速率將凍存的培養(yǎng)物就是以一定的復(fù)溫速率將凍存的培養(yǎng)物 恢復(fù)到常溫的過程?；謴?fù)到常溫的過程。 2021/3/2351細(xì)胞內(nèi)的冰晶損傷（細(xì)胞內(nèi)的冰晶損傷（intracellular ice-damage）: :是指因細(xì)胞內(nèi)部結(jié)冰而致的細(xì)胞損傷是指因細(xì)胞內(nèi)部結(jié)冰而致的細(xì)胞損傷。 純水純水（細(xì)胞懸浮其中）（細(xì)胞懸浮其中） 低于零度 結(jié)冰結(jié)冰 細(xì)胞內(nèi)外的水分都會(huì)結(jié)冰細(xì)胞內(nèi)外的水分都會(huì)結(jié)冰 冰晶造成細(xì)胞膜和細(xì)胞器的破壞并引起細(xì)胞死亡冰晶造成細(xì)胞膜和細(xì)胞器的破壞并引起細(xì)胞死亡 、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理2021/3/2352溶質(zhì)損傷

54、（溶質(zhì)損傷（solute damagesolute damage）或稱溶液損傷（或稱溶液損傷（solution damagesolution damage）是指因保存細(xì)胞的溶液溶質(zhì)濃度增高而致的細(xì)胞損傷。是指因保存細(xì)胞的溶液溶質(zhì)濃度增高而致的細(xì)胞損傷。溶液溶液（細(xì)胞懸浮其中）（細(xì)胞懸浮其中） 溫度下降 細(xì)胞外的水分先結(jié)冰細(xì)胞外的水分先結(jié)冰 在復(fù)溫時(shí)在復(fù)溫時(shí), ,大量水分就會(huì)滲入細(xì)胞內(nèi)大量水分就會(huì)滲入細(xì)胞內(nèi), ,造成細(xì)胞死亡造成細(xì)胞死亡 未結(jié)冰的溶液中電解質(zhì)濃度升高未結(jié)冰的溶液中電解質(zhì)濃度升高 細(xì)胞在高溶質(zhì)的溶液中時(shí)間過長(zhǎng)細(xì)胞在高溶質(zhì)的溶液中時(shí)間過長(zhǎng), ,細(xì)胞膜上脂質(zhì)會(huì)受到損細(xì)胞膜上脂質(zhì)會(huì)受到損

55、壞壞, ,細(xì)胞便會(huì)發(fā)生滲漏。細(xì)胞便會(huì)發(fā)生滲漏。 、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理2021/3/2353在溶液中加入冷凍保護(hù)劑在溶液中加入冷凍保護(hù)劑(cryoprotectant)時(shí)時(shí), ,則可保護(hù)細(xì)則可保護(hù)細(xì)胞免受溶質(zhì)損傷和冰晶損傷。胞免受溶質(zhì)損傷和冰晶損傷。因?yàn)槔鋬霰Ｗo(hù)劑易同溶液中水分子結(jié)合因?yàn)槔鋬霰Ｗo(hù)劑易同溶液中水分子結(jié)合, ,從而降低冰點(diǎn)從而降低冰點(diǎn), ,減減少冰晶的形成少冰晶的形成, ,并且通過其摩爾濃度并且通過其摩爾濃度, ,降低未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)降低未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度的濃度, ,使細(xì)胞免受溶質(zhì)的損傷使細(xì)胞免受溶質(zhì)的損傷, ,細(xì)胞得以在超低溫條件下保存。

56、細(xì)胞得以在超低溫條件下保存。在復(fù)蘇時(shí)在復(fù)蘇時(shí), ,一般以很快的速度升溫一般以很快的速度升溫,1,12 2 minmin內(nèi)恢復(fù)到常溫內(nèi)恢復(fù)到常溫, ,細(xì)胞內(nèi)外不會(huì)重新形成較大的冰晶細(xì)胞內(nèi)外不會(huì)重新形成較大的冰晶, ,也不會(huì)暴露在高濃度溶質(zhì)的也不會(huì)暴露在高濃度溶質(zhì)的溶液中過長(zhǎng)時(shí)間溶液中過長(zhǎng)時(shí)間, ,從而不會(huì)產(chǎn)生冰晶損傷和溶質(zhì)損傷從而不會(huì)產(chǎn)生冰晶損傷和溶質(zhì)損傷, ,凍存的細(xì)凍存的細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后仍保持其正常的結(jié)構(gòu)和功能。胞經(jīng)復(fù)蘇后仍保持其正常的結(jié)構(gòu)和功能。冷凍保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞的冷凍保護(hù)效果還與冷凍速率、冷凍溫冷凍保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞的冷凍保護(hù)效果還與冷凍速率、冷凍溫度和復(fù)溫速率有關(guān)。度和復(fù)溫速率有關(guān)。 、培養(yǎng)物的冷

57、凍保存與復(fù)蘇原理、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理2021/3/2354（）冷凍速率（）冷凍速率細(xì)胞在冷凍過程中會(huì)發(fā)生如下生理變化細(xì)胞在冷凍過程中會(huì)發(fā)生如下生理變化: :* * 當(dāng)細(xì)胞被冷至當(dāng)細(xì)胞被冷至-5-5左右時(shí)左右時(shí), ,因溶液中加有冷凍保因溶液中加有冷凍保護(hù)劑而降低了溶液的冰點(diǎn)護(hù)劑而降低了溶液的冰點(diǎn), ,細(xì)胞內(nèi)外溶液仍未結(jié)冰細(xì)胞內(nèi)外溶液仍未結(jié)冰; ;* * 當(dāng)細(xì)胞被冷至當(dāng)細(xì)胞被冷至-5-5- -1515之間時(shí)之間時(shí), ,細(xì)胞外溶液先細(xì)胞外溶液先出現(xiàn)結(jié)冰而細(xì)胞內(nèi)仍保持未結(jié)冰狀態(tài)。細(xì)胞內(nèi)未結(jié)冰的出現(xiàn)結(jié)冰而細(xì)胞內(nèi)仍保持未結(jié)冰狀態(tài)。細(xì)胞內(nèi)未結(jié)冰的水分子會(huì)比細(xì)胞外部分結(jié)冰溶液中的水分子具有更高的水分子

58、會(huì)比細(xì)胞外部分結(jié)冰溶液中的水分子具有更高的化學(xué)能化學(xué)能, ,其結(jié)果是其結(jié)果是: :細(xì)胞內(nèi)水分為了和細(xì)胞外水分保持化細(xì)胞內(nèi)水分為了和細(xì)胞外水分保持化學(xué)能的平衡學(xué)能的平衡, ,會(huì)向細(xì)胞外流動(dòng)會(huì)向細(xì)胞外流動(dòng)。是指降溫的速度。是指降溫的速度。、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理2021/3/2355冷凍速度不同冷凍速度不同, ,細(xì)胞內(nèi)水分向細(xì)胞外流動(dòng)的情況細(xì)胞內(nèi)水分向細(xì)胞外流動(dòng)的情況就會(huì)不同就會(huì)不同: :（1 1）冷凍速度慢）冷凍速度慢, ,細(xì)胞內(nèi)水分外滲多細(xì)胞內(nèi)水分外滲多, ,細(xì)胞脫水細(xì)胞脫水, ,體積縮小體積縮小, ,細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度增高細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度增高, ,細(xì)胞內(nèi)不發(fā)生結(jié)冰細(xì)

59、胞內(nèi)不發(fā)生結(jié)冰; ;（2 2）冷凍速度快）冷凍速度快, ,細(xì)胞內(nèi)水分沒有足夠的時(shí)間外細(xì)胞內(nèi)水分沒有足夠的時(shí)間外滲滲, ,結(jié)果隨著溫度的下降而發(fā)生細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰結(jié)果隨著溫度的下降而發(fā)生細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰; ;（3 3）冷凍速度非?？欤闯焖倮鋬觯├鋬鏊俣确浅？欤闯焖倮鋬觯? ,則細(xì)胞則細(xì)胞內(nèi)形成的冰晶非常小或不結(jié)冰而呈玻璃狀凝固（玻璃內(nèi)形成的冰晶非常小或不結(jié)冰而呈玻璃狀凝固（玻璃化冷凍）。化冷凍）。 、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理（）冷凍速率（）冷凍速率2021/3/2356超快速玻璃化冷凍超快速玻璃化冷凍: :是細(xì)胞存活最理想的冷凍方法。是細(xì)胞存活最理想的冷凍方法。 因?yàn)榧?xì)

60、胞內(nèi)外呈玻璃化凝固因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)外呈玻璃化凝固, ,無冰晶形成或形成很無冰晶形成或形成很小的冰晶小的冰晶, ,對(duì)細(xì)胞膜和細(xì)胞器不造成破壞對(duì)細(xì)胞膜和細(xì)胞器不造成破壞; ;細(xì)胞也不會(huì)細(xì)胞也不會(huì)在高濃度溶質(zhì)的溶液中暴露時(shí)間過長(zhǎng)而受損。在高濃度溶質(zhì)的溶液中暴露時(shí)間過長(zhǎng)而受損。 不同細(xì)胞的最適冷凍速率不同。所以不同細(xì)胞的最適冷凍速率不同。所以, ,在對(duì)一在對(duì)一種細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存之前種細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存之前, ,首先要測(cè)定其最適冷凍首先要測(cè)定其最適冷凍速率速率, ,以保證獲得最高冷凍存活率。以保證獲得最高冷凍存活率。 、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理（）冷凍速率（）冷凍速率2021/3/