菠蘿蛋白酶測(cè)定實(shí)驗(yàn)報(bào)告重點(diǎn)

1、14食安（5）班 劉嘉盈 201430520513 劉紫瀅 01430520514 羅志鋒 201430520515馬俊宇 201430520516阮順敏 201330130122菠蘿蛋白酶的提取、初步分離純化及活性測(cè)定14食安（5）班 馬俊宇201430520516摘要：本次實(shí)驗(yàn)通過對(duì)菠蘿皮中存在的菠蘿蛋白酶進(jìn)行粗提取、鹽析和透析從而純化和分離；并采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定提取液中蛋白質(zhì)的含量，利用菠蘿蛋白酶水解酪蛋白后的水解產(chǎn)物酪氨酸，在280nm處吸光值的高低，判斷酶活性的大小。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出，純化程度越高，提取液中蛋白質(zhì)的含量先降低，后升高。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)測(cè)得菠蘿蛋白酶的比活力、回收率隨純化程度

2、的提高而先升高后降低。關(guān)鍵詞：菠蘿蛋白酶 純化 酶活性 蛋白質(zhì)含量 前 言菠蘿蛋白酶主要分布于菠蘿的莖和果實(shí)中，能分解蛋白質(zhì)、肽、脂和酰胺，具有較高的生物活性，在各個(gè)生產(chǎn)領(lǐng)域中得到廣泛的應(yīng)用1。在食品工業(yè)中菠蘿蛋白酶作為一種食品添加劑，能分解蛋白質(zhì)、肽、酯和酰胺等，可用于肉質(zhì)嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生產(chǎn)等。菠蘿蛋白酶來可以用來增加豆餅和豆粉的PDI值和NSI值，從而生產(chǎn)出可溶性蛋白制品及含豆粉的早餐、谷類食物和飲料。其它還有生產(chǎn)脫水豆類、嬰兒食品和人造黃油；澄清蘋果汁；制造軟糖；為病人提供可消化的食品；給日常食品添味等。在醫(yī)藥上它可以治療水腫及多種炎癥，并有助消化，健胃消食等功能2。菠蘿

3、蘿蛋白酶 p H 在 4.05.5處于較穩(wěn)定的狀態(tài)，在中性環(huán)境中酶活保持最高，在偏酸環(huán)境下酶活下降較快，堿性環(huán)境能延緩失活3。本實(shí)驗(yàn)研究粗提取、鹽析和透析所得到的菠蘿蛋白酶提取液中的蛋白質(zhì)含量、酶活性高低、回收率和純化倍數(shù)等，對(duì)酶的純化情況進(jìn)行研究。1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器11 實(shí)驗(yàn)材料與試劑新鮮菠蘿（3個(gè)），鹽析粗提液（PBS），酪蛋白試劑，激活劑，三氯乙酸(TCA)，透析袋，牛血清蛋白，考馬斯亮藍(lán)，乙醇12 實(shí)驗(yàn)儀器電子天平，臺(tái)式天平，恒溫水浴鍋，冰箱，高速離心機(jī)，分光光度計(jì)，研缽，燒杯，量筒，容量瓶，移液管，漏斗，漏斗架，濾紙，試管，試管架，滴管，玻璃棒，紗布，洗耳球，標(biāo)簽紙，橡皮筋DS-1型

4、高速組織搗碎機(jī)：上海標(biāo)本模型廠HZS-H型水浴振蕩器：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司2 實(shí)驗(yàn)方法21 菠蘿蛋白酶的粗酶提取 稱取菠蘿皮材料20g，將菠蘿皮在清水中洗凈，瀝干，切成小段后置于超高 速攪拌機(jī)中，加入約60mL預(yù)冷的0.1mo1/L pH 7.8 PBS，持續(xù)攪拌1015min至粉碎，攪拌完成后用4層紗布過濾，得到濾液后，用冷凍離心機(jī)于4°C 3000rpm離心6min，棄沉淀，即得到菠蘿蛋白酶粗提液，測(cè)定粗提液的體積、蛋白質(zhì)含量和酶活性。22 鹽析 根據(jù)附錄的“硫酸銨飽和度計(jì)算表”，按30%硫酸銨飽和度計(jì)算在上述酶提取液中需添加的固體硫酸銨量，稱取固體硫酸銨于研缽中，研

5、磨呈粉末，慢慢小量分次向酶提取液中添加固體硫酸銨，邊加邊攪拌，使溶液最終硫酸銨飽和度為30%，放置于冰水混合物（4）30min 后，酶蛋白沉淀析出，4°C 4000rpm離心10min，收集沉淀， 加入0.1mo1/L pH 7.8 PBS約15mL至完全溶解，測(cè)定其體積、蛋白質(zhì)含量和酶活性。23透析 將溶解液裝入2.5 cm×8cm透析袋（預(yù)先將透析袋在蒸餾水中煮沸30min）中，于 500mL 燒杯中，在磁力攪拌器攪拌下用蒸餾水透析，15min換水一次，換水34次后，檢查SO42-是否已被除凈（檢查的方法是：取2mLBaCl2溶液放入一支試管，滴加23滴透析外液至試管中

6、，若出現(xiàn)白色沉淀，表示SO42- 未除凈，若無沉淀出現(xiàn)，表示透析完全）。若透析液有沉淀，將透析液用濾紙過濾，測(cè)定過濾液的體積、蛋白質(zhì)含量和酶活性。24 酶活力測(cè)定方法 取2支試管，設(shè)置一支為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，三支為平行樣品。取0.1mL酶液，加入0.9mL激活劑，加入37預(yù)熱的1%酪蛋白溶液1mL，準(zhǔn)確反應(yīng)10min，加入10%三氯乙酸3mL反應(yīng)終止酶反應(yīng)。對(duì)照管先加入10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其它與測(cè)定管相同。離心（3000r/min，5min）或過濾，清液于280nm波長(zhǎng)下測(cè)定光吸收值。酶活單位定義：在上述條件下 ，每10min增加0.001個(gè)光吸收值為1個(gè)酶單位（U）。實(shí)驗(yàn)步驟按照表格

7、1中完成。試劑(ml)對(duì)照組平行樣品1平行樣品2平行樣品3TCA3酶液0.10.10.10.1激活劑0.90.90.90.9酪蛋白111137°C準(zhǔn)確反應(yīng)10minTCA333A280nm OD值表格13實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)步驟，測(cè)得粗提取、鹽析、透析得到的酶制劑在280nm處的吸光值如下表2示A280nm對(duì)照組平行樣品1平行樣品2平行樣品3粗提取00.5230.5010.433鹽析00.5340.4490.469透析00.4930.4500.535表231 蛋白質(zhì)含量計(jì)算1233.13.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制0-1000ug/ml標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制如表3管號(hào)1234 5 6 10

8、00g/mL牛血清白蛋白（mL）蒸餾水（mL）蛋白質(zhì)濃度（g/mL）01.000. 20. 82000. 40. 64000. 6 0. 8 1.00. 4 0. 2 0 600 800 1000表3 另取6支試管編號(hào)，按表中加入試劑。得到從1到6號(hào)管的牛血清白蛋白溶液濃度分別為0、200、400、600、800、1000g/mL，準(zhǔn)確吸取各管溶液0.lmL，加入5ml考馬斯亮藍(lán)溶液，搖勻，靜置2min，測(cè)定595nm吸光值，繪制0-1000g/mL標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)得不同蛋白質(zhì)濃度在595nm處的吸光度如下表4所示蛋白質(zhì)濃度g/ml02004006008001000A595nm00.1200.33

9、90.4760.5990.720 表4繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線如下圖1示3.1.2 樣品的測(cè)定 準(zhǔn)確吸取樣品溶液0.1mL放入具塞刻度試管中，與步驟（1） 操作相同，測(cè)得樣品的光吸收值A(chǔ)595nm。測(cè)得樣品吸光值如下表5示。樣品粗提取蛋白質(zhì)鹽析蛋白質(zhì)透析蛋白質(zhì)吸光度1.0361.2231.2631.0421.1891.3091.0271.2161.274平均值1.0351.2091.282表53.1.3 結(jié)果計(jì)算 由標(biāo)準(zhǔn)曲線可查出相應(yīng)的蛋白濃度（g/mL），可按如下公 式計(jì)算出樣品中蛋白含量。 查出的蛋白提取液濃度（g/mL）×定容體積(mL)樣品蛋白含量(g g鮮重) 樣品重量(g)實(shí)驗(yàn)

10、所用樣品質(zhì)量為20g，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)含量如下表6示粗提取鹽析透析定容體積/ml5915.517.8蛋白質(zhì)提取液濃度g/ml1469.91718.41822.7樣品蛋白質(zhì)含量g g鮮重 4381.591344.111635.95樣品總蛋白質(zhì)含量mg86.7226.6432.44表632酶活力計(jì)算0.001×0.1A280nm酶液活力（U/mL）= ×稀釋倍數(shù)樣品酶活力計(jì)算如下表7示粗提取鹽析透析A280nm平均值0.6061.0250.738蛋白質(zhì)提取液酶活力U/mL6060102507380總活力U357540158875131364表733酶比活的計(jì)算 酶比

11、活（U/mg· 蛋白）=酶活力/酶蛋白質(zhì)含量酶比活的計(jì)算結(jié)果如下表8示粗提取鹽析透析酶比活U/mg·蛋白4122.95963.84049.4表834酶純化過程中回收率計(jì)算 回收率（%）=（純化酶總活力/ 粗酶液總活力）×100= （純化酶活力×純化酶液體積）/（粗酶活力×粗酶體積）×10035酶純化倍數(shù)的計(jì)算純化倍數(shù)=純化酶比活力/粗酶比活力36實(shí)驗(yàn)結(jié)果 將測(cè)定的數(shù)據(jù)整理計(jì)算分別填入下表9示，并將菠蘿蛋白酶的分離純化效果進(jìn)行分析和討論。菠蘿蛋白酶分離純化表步驟總體積（mL）總蛋白質(zhì)含量（mg）總活力（U）比活力（U/mg·

12、蛋白）回收率（%）純化倍數(shù)粗提取5986.723575404122.91001.00鹽析15.526.641588755963.844.41.45透析17.832.441313644049.436.70.98表9根據(jù)表9得出以下結(jié)論，在粗提取、鹽析和透析得到的提取液中：蛋白質(zhì)含量先下降，后上升；蛋白酶總活力逐漸下降；蛋白質(zhì)提取液的比活力先上升，后下降；酶純化過程的回收率分別為100%、44.4%和36.7%；純化倍數(shù)分別為1.00、1.45和0.98。4實(shí)驗(yàn)結(jié)論與討論4.1數(shù)據(jù)分析a) 本實(shí)驗(yàn)中利用粗提取鹽析透析的方法分離提純菠蘿皮中所含的菠蘿蛋白酶。菠蘿蛋白酶鹽析后的蛋白質(zhì)提取液濃度最高，粗

13、提取次之，透析最低。隨著鹽析和透析的進(jìn)行，菠蘿蛋白酶的蛋白質(zhì)含量和酶活力依次降低。菠蘿蛋白酶鹽析后的酶比活最高，粗提取略次之，透析最低。b) 提取液中總蛋白的含量下降，這是由于對(duì)菠蘿皮提取液進(jìn)行了純化和分離，提取液中除了菠蘿蛋白酶外的其他物質(zhì)被除去，酶蛋白純度提高。但提取液中總蛋白含量下降。c) 透析后比活力下降，理論上比活力應(yīng)該升高，下降的原因可能是，實(shí)驗(yàn)采用的是先進(jìn)行粗提取，再進(jìn)行鹽析，后進(jìn)行透析，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)酶逐漸失活，導(dǎo)致最終測(cè)得的酶比活力下降。也可能是實(shí)驗(yàn)環(huán)境中的溫度、pH、金屬離子等因素影響了酶分子的活性。d) 酶的回收率隨酶的純化程度的增強(qiáng)而降低。酶的回收率表示酶的穩(wěn)定性。

14、從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出，酶的回收率下降，可能的原因是反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)、環(huán)境溫度、pH、金屬離子等因素影響了酶的穩(wěn)定性，使酶的回收率下降。菠蘿蛋白酶因含有一個(gè)不穩(wěn)定的游離巰基，所以在實(shí)驗(yàn)過程中極易被氧化而使其酶活下降4。e) 鹽析純化倍數(shù)大于1，透析純化倍數(shù)小于1。鹽析由于反應(yīng)時(shí)間較短，純化效果較好，純化倍數(shù)是大于1的。而由于ii、iii中提到的因素對(duì)菠蘿蛋白酶活性的影響，導(dǎo)致純化后的酶對(duì)比于粗提取的酶，活性更低。所以透析得到的純化倍數(shù)為小數(shù)。4.2防止酶失活變性的措施由于菠蘿蛋白酶是一種巰基蛋白酶，極易被氧化而使其酶活下降。凡是能使蛋白質(zhì)變性的因素都可能使它失去活性，比如物理因素溫度、時(shí)間、壓力、光、磁

15、場(chǎng)；化學(xué)因素氧化、還原、溶劑、金屬離子、離子強(qiáng)度、pH和生物因素酶修飾和酶降解5。所以分離純化的時(shí)候要注意不能用不潔凈的儀器（盛裝過 PBS）來盛裝酶液，不能靠近萬用爐，不能用自來水作為透析液。在新型吸附沉淀法提取菠蘿蛋白酶中，可以利用乙二胺四乙酸，它是一種螯合物，可有效地螯合原料中某些重金屬離子，以避免其與酶結(jié)合而使酶失去活性，抗壞血酸則具有還原性，分子上的活潑羥基氫可使酶活性中心保持還原狀態(tài)，從而有效地保持酶活性，其中以EDTA和L-半胱氨酸組合，效果最佳5。維生素C，也可以增強(qiáng)菠蘿蛋白酶的穩(wěn)定性，使菠蘿蛋白酶的活性也有所提高，使用維生素C也比較經(jīng)濟(jì)6。4.3常見的酶活性表示方法a) U/

16、mL酶液：1mL液體酶，1min水解酪蛋白產(chǎn)生1微克酪氨酸為一個(gè)酶活力單位。用于表示液體酶中的酶活大??；b) U/mg蛋白質(zhì)：1g酶制劑，1min水解酪蛋白產(chǎn)生1微克酪氨酸為一個(gè)活力單位。用于表示酶制劑中酶活的大小；c) U/g干重或鮮重：1g樣品，1min水解酪蛋白產(chǎn)生1微克酪氨酸為一個(gè)活力單位。表示材料中酶活的大小。4.3硫酸銨鹽析選擇0%30%飽和度的原因?qū)嶒?yàn)中硫酸銨鹽析選擇30%飽和度，是因?yàn)殡S著硫酸銨濃度的逐漸增大，鹽析得到的菠蘿蛋白酶的酶活回收率逐漸增大，當(dāng)硫酸銨的飽和度達(dá)到40%的時(shí)侯菠蘿蛋白酶的酶活回收率最大，為83.6%，往后開始逐漸減小，當(dāng)硫酸銨的飽和度越大時(shí)，菠蘿皮浸提液的鹽析效果越好6，所以取30%左右的最好。參考文獻(xiàn)1歐英杰.蘿蛋白酶酶活力影響因素及測(cè)定酶活力方法的研究進(jìn)展J.廣東化工.2010（37）：40-512 章佩芬，郭勇，羅煥敏等. 菠蘿蛋白酶的研究與應(yīng)用進(jìn)展J.華西藥學(xué)雜志，2002，17(2):128-129.3董瑞蘭.菠蘿蛋白酶的分離純化及部分應(yīng)用性質(zhì)的研究. D.福建：