電泳技術(shù)介紹及影響電泳的因素

1、電泳技術(shù)介紹及影響電泳的因素一、基本知識(shí)和種類電泳是指帶粒子在電場中向與自身帶相反電荷的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。例如蛋白質(zhì)具有兩性電離性質(zhì)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液的pH在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的堿側(cè)時(shí)，該蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動(dòng)，相反則帶正電荷，在電場中向負(fù)極移動(dòng)，只有蛋白質(zhì)溶液pH在蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)靜電荷是零，在電場中不向任何一極移動(dòng)。電泳現(xiàn)象早在1890年就被發(fā)現(xiàn)，1907年有人曾在瓊脂中電泳，研究白喉毒素。1937年由Tiselius制成界面電泳儀，并開始用于蛋白質(zhì)的研究。從此，人們才逐漸認(rèn)識(shí)到電泳技術(shù)對(duì)于生物科學(xué)研究是一種重要工具。然而，界面電泳結(jié)構(gòu)復(fù)雜，價(jià)格昂貴難于普及。1940年左右，以紙為支持物的

2、電泳問世后，電泳技術(shù)得到迅速發(fā)展。電泳技術(shù)以支持物分，可分為：紙電泳，醋酸纖維素薄膜電泳，淀粉凝膠電泳，瓊脂（糖）凝膠電泳及聚丙烯酰胺凝膠電泳等。經(jīng)凝膠形狀分有水平平板電泳，園盤柱狀電泳及垂直平板電泳。各種類型的電泳技術(shù)概括如表。各類電泳技術(shù)已經(jīng)廣泛地用于基礎(chǔ)理論研究，臨床診斷及工業(yè)制造等方面。例如用醋酸纖維薄膜電泳分析血清蛋白；用瓊脂對(duì)流免疫電泳分析病人血清，為早期診斷原發(fā)性肝癌提供資料；用高壓電泳分離肽段，研究蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)；用高壓電泳和層析結(jié)合研究核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)。凝膠龜泳技術(shù)在分離分析酶。蛋白質(zhì)，核酸等生物大分子方面具有較高的分辯力，為生物化學(xué)，分子生物學(xué)的發(fā)展作出了重大貢獻(xiàn)。 

3、;二、影響電泳的因素不同的帶電顆粒在同一電場中泳動(dòng)的速度不同。常用泳動(dòng)度（或遷移率）來表示。泳動(dòng)度是指帶電顆粒在單位電場強(qiáng)度下泳的速度。影響泳動(dòng)度的主要因素有：1、首先決定于帶顆粒的性質(zhì)，即顆粒所帶凈電荷的數(shù)量，大小及形狀一般說來，顆粒帶凈電荷多，直徑小而接近于球形，則在電場中泳動(dòng)速度快，反之則慢。泳動(dòng)度還與分子的形狀，介質(zhì)粘度，顆粒所帶電荷有關(guān)，泳動(dòng)度與顆表面電荷成正比，與介質(zhì)粘度及顆粒半徑反比。帶電荷的高分子在電解質(zhì)溶液中把一些帶有相反電荷的離子吸引在其周圍，形成一離子擴(kuò)散層。加以電場時(shí)，顆粒向符號(hào)相反的電極移動(dòng)即帶陽電荷顆粒移向負(fù)極，帶陰電荷顆粒移向正移；離子擴(kuò)散層由于帶有過剩的與顆粒符

4、號(hào)相反的電荷，可以向相反方向移動(dòng)。結(jié)果顆粒與離子擴(kuò)散之間的靜電 引力使顆粒的泳動(dòng)度減慢，另外，高分了顆粒表面有一層水，在電場影響下，它與顆 粒一起移動(dòng)，可以認(rèn)為是顆粒的一部分。2、電場強(qiáng)度電場強(qiáng)度也稱電位梯度，是指單位長度（每一厘米）支持物體上的電位降，它對(duì)泳動(dòng)度起著十分重要的作用。例如紙電泳。測(cè)量25厘米長紙條兩端電壓為250伏特，則電場強(qiáng)度為250伏特/25厘米=10伏特/厘米。一般，電場強(qiáng)度越高，帶電顆粒移動(dòng)速度越快。根據(jù)電場強(qiáng)度大小，可將電泳分為常壓電泳和高壓電泳，前者的電壓在100-500伏特，電場強(qiáng)度一般是2-10伏特/厘米；后者電壓可高達(dá)500-1000伏特，電場強(qiáng)度在200-2

5、000伏特/厘米。常壓電泳分離 時(shí)間需數(shù)小時(shí)至數(shù)天，高壓電泳時(shí)間短，有時(shí)僅幾分鐘即可，高壓電泳主要用于分離氨基酸，肽，核苷酸，由于電壓升高，電壓也隨之增大，故需冷卻裝置。3、溶液的pH值溶液的pH值決定了帶電顆粒解離的程度，也決定了物質(zhì)所帶凈電荷的多少，對(duì)于蛋白質(zhì)，氨基酸等兩性電解質(zhì)而言，溶液pH值離電點(diǎn)越遠(yuǎn)，顆粒所帶凈電荷越多；電泳速度越快；反之則越慢。例如血清中幾種主要蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)各不相同，白蛋白等電點(diǎn)是4.0。2球蛋白等電點(diǎn)是5.06，球蛋白等電點(diǎn)是5.1，球蛋白等電點(diǎn)是7.1。當(dāng)在pH8.6的電泳緩沖液中電泳時(shí)，這些蛋白質(zhì)都帶負(fù)電荷，它們的泳動(dòng)速度是白蛋 白< 2球蛋白>

6、球蛋白>球蛋白。因此，當(dāng)要分離一種蛋白質(zhì)混合物時(shí)，應(yīng)選擇 一種能擴(kuò)大各種蛋白質(zhì)所帶電荷量差異的pH值，以利于各種蛋白質(zhì)分子的解離。同 時(shí)，為保持電泳過程中溶液pH恒定也須使用緩沖液。4、溶液的離子強(qiáng)度溶液的離子強(qiáng)度是另一個(gè)重要選擇的條件，在保持足夠緩沖能力前提下，離子強(qiáng) 度要最小。溶液的離子強(qiáng)度越高，帶電顆粒泳動(dòng)速度越慢，反之越快。濃度大的緩沖液在合適電壓下，有較低的電阻和較大的電流，產(chǎn)熱較高。如果這種額外的熱可以驅(qū)散，高濃度的緩沖液擴(kuò)散常數(shù)較低，可以產(chǎn)生較窄細(xì)的電泳區(qū)帶。離子強(qiáng)度很高時(shí)要用低電壓，避免過多產(chǎn)熱，這樣又導(dǎo)致長的電泳時(shí)間，以致增加變性和區(qū)帶分離困難。5、電滲作用 在支持物的電泳中，影響電泳的另一個(gè)重要因素是電滲作用。所謂電滲就是指在電場中液體對(duì)固體支持物的相對(duì)移動(dòng)，例如在pH8.6時(shí)，血清蛋白質(zhì)進(jìn)行紙電泳時(shí)，球蛋白與其他蛋白質(zhì)一樣帶負(fù)電荷，應(yīng)該向正極移動(dòng)，然而它卻向負(fù)極方向移動(dòng)，這就是電滲作用的結(jié)果。濾紙的纖維間具有大量孔隙帶有負(fù)電荷，如一束毛細(xì)管，進(jìn)行電泳時(shí)蛋白質(zhì)通過這些孔隙向前移動(dòng)。紙的孔隙帶有負(fù)電荷，與帶電顆粒一樣可以吸引正離子，因此介質(zhì)沿管壁相對(duì)地帶的較多的正電荷。在電場中，帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)向正極移動(dòng)，而介質(zhì)卻向反向陰極移動(dòng)，從而對(duì)蛋白質(zhì)顆粒的泳動(dòng)起阻礙作用。由于球蛋白分子顆