細胞復蘇及細胞鑒別與計數(shù)

1、 細胞生物學實驗報告細胞復蘇及細胞鑒別與計數(shù) 姓名： 學號： 班級： 專業(yè)： 同組成員： Part1、細胞復蘇一、實驗原理細胞復蘇是以一定的復溫速率將凍存的培養(yǎng)物恢復到常溫的過程。不論是微生物、動物細胞、植物細胞還是體外培養(yǎng)的器官都可以進行凍存，并在適當條件下復蘇。復蘇細胞原則：快溶。防止在融化過程中已融解水滲透入細胞導致的二次結晶對細胞形成損害。使培養(yǎng)物能快速通過對細胞有損害的50攝氏度區(qū)域，細胞仍能生長，活力受損不大。二、實驗目的掌握細胞復蘇的基本方法三、實驗器材（1）儀器  CO2培養(yǎng)箱，顯微鏡、倒置顯微鏡，超凈臺 （2）材料  培養(yǎng)瓶，試管，移液管，廢液缸

2、，75%酒精棉球，酒精燈，凍存的Hela人宮頸癌細胞，滴管（3）試劑  完全培養(yǎng)基（DMEM），小牛血清，雙抗四、實驗步驟1、準備一個茶缸或1000ml的燒壞，內裝2/3杯40的溫水。2、從液氮中取出凍存管、迅速置于溫水中并攪動。使凍存管中的凍存物在1分鐘內融化。3、將凍存管放入離心管中800rpm離心10分鐘，取出凍存管拿入超凈臺中，75%酒精消毒管口，打開凍存管，棄上清。4、沉淀加1ml完全培養(yǎng)基吹打細胞使之均勻，將細胞轉移至25ml培養(yǎng)瓶中，補加3ml新鮮培養(yǎng)基于干凈培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。5、另取90微升細胞懸液于1.5ml離心管中，再加入10微升0.4%臺盼藍染色,取80µ

3、l細胞液鏡下觀察活力。6、再向上述培養(yǎng)瓶中加入4ml10%含F(xiàn)CS及雙抗的DMEM培養(yǎng)基，輕輕混勻，顯微鏡下觀察。蓋上瓶蓋, 去倒置顯微鏡上觀察細胞形態(tài)。做好標記。將瓶蓋適度擰緊后再稍回轉，以利于CO2氣體的進入，將培養(yǎng)瓶放回CO2培養(yǎng)箱。7、將用過的試劑儀器等擺回原處，將超凈臺打掃干凈，關閉照明燈及抽風機。8、實驗后數(shù)小時后去觀察細胞生長情況，并拍攝照片。五、實驗結果傳代后在顯微鏡下可看到細胞呈懸浮狀態(tài)，全部為單個的分散的細胞。復蘇后大部分細胞生長狀態(tài)良好，透明度大，細胞內顆粒少，沒有空泡,細胞形態(tài)完整。也存在少數(shù)顏色較暗的死細胞，無立體感，細胞通透性差，有顆粒狀物質。 我們5小后對復蘇后的

4、人宮頸癌Hela細胞進行拍照，可觀察到細胞復蘇效果較好，多數(shù)細胞處于開始貼壁狀態(tài)，細胞呈現(xiàn)扁平或梭型，透明度較好。仍有少數(shù)細胞成懸浮狀態(tài)，未貼壁 （凍存的人宮頸癌Hela細胞復蘇 倒置顯微鏡20×）Part2、細胞的計數(shù)與死細胞的鑒別一、實驗原理 細胞計數(shù)方法：血球計數(shù)板。 血球計數(shù)板：由一塊長約7.5cm，寬3.5cm的厚玻璃制成。計數(shù)室的邊長為1mm，中間平臺下陷0.1mm，蓋上蓋片后計數(shù)室的容積為 0.1mm3。所以，可根據(jù)在顯微鏡下觀察到的細胞數(shù)目，換算成單位體積中細胞的數(shù)量。 細胞計數(shù)：細胞壓格計上線不計下，計左不計右，如有少量兩個以上細胞按一個細胞計數(shù)，如超過10%說明消

5、化不充分。 通常認為細胞膜喪失完整性,細胞即可被認為已經(jīng)死亡.臺盼藍(Trypan Blue)是檢測細胞膜完整性最常用的生物染色試劑.健康的正常細胞能夠排斥臺盼藍,而死亡的細胞,膜的完整性喪失,通透性增加,細胞可被臺盼藍染成藍色.依據(jù)此原理,細胞經(jīng)臺盼藍染色后,可通過顯微鏡,直接鏡下計數(shù)或拍照后計數(shù),實現(xiàn)對細胞存活率比較精確的定量分析.二、實驗目的1、掌握用血球計數(shù)板進行細胞計數(shù)的方法。2、學習死活細胞的鑒別方法三、實驗器材（1）儀器 CO2培養(yǎng)箱，顯微鏡、倒置顯微鏡，超凈臺 （2）材料 培養(yǎng)瓶，試管，移液管，廢液缸，75%酒精棉球，酒精燈，凍存的Hela人宮頸 癌細胞，滴

6、管、血球計數(shù)板（3）試劑 完全培養(yǎng)基（DMEM），小牛血清，雙抗，臺盼藍染料四、實驗步驟1、檢查記數(shù)板：在正式計數(shù)前，先用顯微鏡檢查記數(shù)板的計數(shù)室，看其是否沾有雜質或干枯的菌體。若有污物，則需作以下幾步清洗：（1）、擦洗 用藥棉蘸取95%酒精，輕輕擦洗計數(shù)板的計數(shù)室。（2）、沖洗 用蒸餾水沖洗計數(shù)板，并用毛邊紙吸干其上的水分注意：勿用內火焰來烤干，最后用擦鏡紙揩干凈。2、鏡檢：鏡檢清洗后的計數(shù)板，直至計數(shù)室無污物時，才可用于細胞的計數(shù)。3、加樣：先將蓋玻片安放在計數(shù)室上面，然后搖勻樣品取懸液，從蓋玻片邊緣滴加細胞懸液，連續(xù)23次，直至充滿計數(shù)板和蓋玻片間的空隙。4、計數(shù)： 將加好樣品

7、的記數(shù)板置于顯微鏡載物臺的中央，然后按下列步驟操作：（1）找計數(shù)室：先在低倍顯微鏡下尋找計數(shù)板上的大方格網(wǎng)位置。尋找時顯微鏡的光圈要適當縮小，使視野偏暗。然后順著大方格線，移動計數(shù)板，使計數(shù)室位于視野中間。（2）轉高倍鏡：轉至高倍鏡后，適當調節(jié)光度，使細胞和計數(shù)室線條均清晰為止。然后將計數(shù)室一角的中格移至視野中。（3）計數(shù)：計算計數(shù)板的四角大格內的細胞數(shù)，壓線者只計算左側和上方的，右和下的不計算在內。5、清洗：計數(shù)完畢后，記數(shù)板先用95%酒精輕輕擦洗，再用蒸餾水淋洗，然后吸干，最后用擦鏡紙揩干凈。五、實驗結果我們共取了16個計數(shù)室，體積均為0.1mm3。得到的細胞數(shù)量數(shù)據(jù)如下表所示。 第一組細

8、胞計數(shù)結果計數(shù)室細胞總數(shù)/個死細胞數(shù)/個125424233531318818417522519421628724715617821419第二組細胞計數(shù)結果計數(shù)室細胞總數(shù)/個死細胞數(shù)/個118721221726323427419721515016616618717820818722兩組細胞計數(shù)總計細胞總數(shù)/個死細胞數(shù)/個總數(shù)3319347平均值27422 根據(jù)上表可得：細胞總數(shù)/ml = 274×104 ×10/9=3.04×106個/ml細胞活力(細胞總數(shù) - 藍色細胞數(shù))/細胞總數(shù)X100% = 89.545%六、結果分析：觀察表格中的數(shù)據(jù)可得，本次實驗我們小組

9、所復蘇細胞的細胞存活率為89.545%，細胞總數(shù)為3.04×106個/ml?？傮w而言每個計數(shù)室細胞總數(shù)相差不大，說明細胞懸液中的細胞分散良好，整體而言細胞懸液較為均勻，提高了計數(shù)的準確性。實驗時可能因鏡檢時間過長、因鏡檢而導致的細胞死亡數(shù)增多，導致得到的存活率偏小。七、思考題1、細胞計數(shù)應注意的問題？ 細胞計數(shù)時要求懸浮中細胞數(shù)目在50×104個/ml左右，如果細胞數(shù)目很少要進行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中。 細胞壓格計上線不計下，計左不計右，如有少量兩個以上細胞按一個細胞計數(shù)。鏡下計數(shù)，有時偶爾有兩個以上細胞組成的細胞團，應按單個細胞計算。如果細胞團占10%以上，說明消化不充

10、分，細胞數(shù)少于200個/10平方毫米或多于500個/10平方毫米時，均說明稀釋不當，需重新置備細胞懸液，再重新記數(shù)。 在加樣時要搖勻樣品取懸液，從蓋玻片邊緣滴加細胞懸液，連續(xù)23次，直至充滿計數(shù)板和蓋玻片間的空隙。操作時注意蓋片下不能有氣泡，否則要重新計數(shù)。染色時間不宜過長，以免對細胞造成嚴重損傷。2、檢測細胞的死活還有哪些方法？(1)染色法亞甲基藍溶液染色：亞甲基藍為活體染色劑，可以讓活細胞染色,死細胞不能染色。活細胞被染為深藍色的部分是（細胞核）亞甲基藍可以結合核酸，使細胞核呈藍色。中性紅染色：中性紅是液泡系的專有染料，也是一種低毒性染料，可以使活細胞液泡著紅色，而細胞質和細胞核不被著色；死細胞的液泡不被著色或淺染，染料彌散于整個細胞中，細胞核和細胞質被染成紅色。(2)儀器分析法：可采用微電極技術（利用死活細胞膜兩側電位的差異）、全自動分析細胞記數(shù)儀和流式細胞儀等，可對細胞的死活進行精確的批量檢測。流式細胞儀法用來判斷細胞死活的常用熒光探針有二大類：一類是能透過活的細胞膜進入細胞內而發(fā)出熒光的物質，例如