二維電泳詳細(xì)過程

1、北京六一儀器廠DYCZ-26C雙向電泳系統(tǒng)檢測報告技術(shù)部 吳承疆QQ:50894034實(shí)驗(yàn)原理：雙向電泳是一種分析從細(xì)胞、組織或其他生物樣本中提取的蛋白質(zhì)混合物的有力手段，已得到廣泛應(yīng)用。這項(xiàng)技術(shù)利用蛋白質(zhì)的兩種特性，分兩步將不同的蛋白質(zhì)分離。第一向步驟為等電聚焦（IEF），即根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI）差異將蛋白質(zhì)分離。第二向步驟為十二烷基硫酸鈉- 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），即利用蛋白質(zhì)的分子量（Mr, 相對分子量）差異將蛋白質(zhì)分離。雙向凝膠電泳結(jié)果中的每個斑點(diǎn)都對應(yīng)著樣本中的一種蛋白。因此，可將上千種不同的蛋白質(zhì)分離開來，并得到每種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、表觀分子量等信息。實(shí)驗(yàn)方法：一

2、.實(shí)驗(yàn)材料:1.主要儀器和試劑（sigma,Ampholine購自GE）主要試劑超純水（MiLiQ）、尿素(Urea)、硫脲(Thiourea)、二硫蘇糖醇（Dithiothreitol，DTT）、CHAPS（3-3-(膽酰氨丙基)二甲氨基丙磺酸內(nèi)鹽）、Ampholine（PH 3-10或4-7 5-8）碘乙酰胺(Iodoacetamide，IAA)、EDTA-Na2（乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid）、十二烷基磺酸鈉（Sodium Dodecylsulphate，SDS）、溴酚藍(lán)(Bromophenol Blue)、低熔點(diǎn)瓊脂糖、過硫酸銨(Ammon

3、ium Persulfate APS)、TEMED（四甲基乙二胺）、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺；Tris堿、甘氨酸、硝酸銀、無水碳酸鈉、無水乙酸鈉、硫代硫酸鈉、甲醛、無水乙醇、冰醋酸、氫氧化鈉、磷酸、甘油（丙三醇 glycerin ）、牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）、蛋白質(zhì)marker、蛋白定量試劑盒主要儀器DYCZ-26C、DYY-16D、DYY-6D、高速冷凍離心機(jī)、紫外分光光度計、0.1毫克級電子分析天平、超聲波細(xì)胞破碎儀、Millipore純水儀(法國)、Eppendorf普通離心機(jī)、beckman高速冷凍離心機(jī)、瞬時離心機(jī)、恒溫磁力攪拌器、UMAX掃描

4、儀(臺灣)；恒溫?fù)u床、pH計、恒溫振蕩器等。 本次試驗(yàn)材料：動物組織二.實(shí)驗(yàn)試劑的配制樣品裂解液尿素 8M 4.805g CHAPS 4% 0.4g DTT 65mM 0.098g（現(xiàn)加）每小管5毫克 2%Ampholine （40%） 0.5 ml（現(xiàn)加） 每小管25微升溴酚藍(lán) 0.001% 10l （1% 溴酚藍(lán)） MilliQ水 定容至10ml ，分裝成20小管，每小管500uL，-20冰箱保存樣品覆蓋液（含8 mol/L尿素，1% Ampholine）取4.8g新鮮尿素（超純），0.3 ml Ampholine，用去離子水定容至10mL，分裝，每管含有100 uL，置于-20冰箱內(nèi)保存

5、。膠條平衡緩沖液母液 尿素 6M 36g SDS 2% 2g Tris-HCl 0.375M pH8.8 25ml（1.5M pH8.8 Tris-HCl） 甘油 20% 20ml MilliQ水 定容至100ml 分裝成10管，每管10ml，-20冰箱保存。膠條平衡緩沖液I 膠條平衡緩沖液母液 10ml DTT 0.2g 充分混勻，用時現(xiàn)配。 膠條平衡緩沖液II 膠條平衡緩沖液母液 10ml 碘乙酰胺 0.25g 充分混勻，用時現(xiàn)配。低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液 低熔點(diǎn)瓊脂糖 0.5% 0.5g Tris 25mM 0.303g 甘氨酸 192mM 1.44g SDS 0.1% 1ml（10% SDS

6、） 溴酚藍(lán) 0.001% 100l（1%溴酚藍(lán)） MilliQ水 定容至100ml 加熱溶解至澄清，室溫保存。第一向聚丙烯酰胺凝膠儲液丙烯酰胺 7.09g甲叉雙丙烯酰胺 0.405gMilliQ水 溶解后定容至 25 ml第二向30% 聚丙烯酰胺貯液 丙烯酰胺 150g 甲叉雙丙烯酰胺 4g MilliQ水 溶解后定容至 500ml 濾紙過濾后，棕色瓶4冰箱保存。1.5mol/L Tris堿 pH8.8 Tris堿 90.75gMilliQ水 400ml 用1mol/L HCl調(diào)pH至8.8，加MilliQ水定容至500ml。4冰箱保存。10% SDS SDS 10g MilliQ水 100m

7、l 混勻后，室溫保存。10% Ap Ap 0.1g MilliQ水 1ml（用時加水溶解） 溶解后，4冰箱保存。10×電泳緩沖液 （1×= 25mM Tris，192mM glycine，0.1% SDS，pH8.3） Tris堿 30g 甘氨酸 144g SDS 10g MilliQ水 1L 混勻后，室溫保存。第一向電極液母液（用前稀釋10倍）正極電極液母液（0.1 mol/L磷酸）：取6.75mL磷酸用去離子水定容至1000mL。負(fù)極電極液母液（0.2 mol/L NaOH）：取16.48gNaOH，用去離子水定容至2000mL，置于4冰箱內(nèi)可以保存2周。注意：正負(fù)極緩

8、沖液體系有多種，要分離不同PH范圍的蛋白質(zhì)，需要選擇恰當(dāng)?shù)木彌_液體系。3.實(shí)驗(yàn)操作A.第一向IEF-PAGE 1.凝膠柱的玻管準(zhǔn)備準(zhǔn)備 干凈玻管(17cm×2mm)內(nèi)徑1.5mm左右的，長度取18cm，先用2M 的NaOH 泡 至少 1hr，用自來水沖后;用雙蒸水沖，用雙蒸水泡至少1hr，中間至少換2，3 次水;后用2M的HCL 泡至少1 個小時，用雙蒸水沖，(不能用自來水沖)，然后雙蒸水泡至少1 個小時，中間換3，4 次水，最后泡在無水乙醇里面1hr，轟干。用Parafilm封口膜封好底部，在15cm處作好標(biāo)記,待用。 2.配制等電聚焦凝膠柱的制備（環(huán)境溫度25）尿素（超級純） 5

9、.5g第一向凝膠貯備液 1.33 mlAmpholine 0.5 ml 去離子水 1.97 mlCHAPS 0.2-0.4gTEMED 15l10%AP 50l 定容至10毫升注意：在加入TEMED和10%AP之前，先減壓抽氣10min，加入后立即準(zhǔn)備裝管（TEMED和10%AP的用量，不同的實(shí)驗(yàn)條件，需實(shí)驗(yàn)室自行摸索，以裝管后2-4小時聚合為宜）3.灌制第一向凝膠將干凈的玻璃管置于盛有凝膠液的燒杯中（插入凝膠液面下），玻璃管一端用封口膜或白色乳膠冒頭密封住，用5mL針頭從密封處插入，倒吸凝膠液于指定位置（約15厘米處）后，室溫下豎直放置，待凝膠聚合后，在凝膠表面加入50l樣品裂解液，再沿玻璃

10、管內(nèi)壁小心注入50l水。放置1-2小時后吸去凝膠上層液體，再加入50l新鮮的樣品裂解液，其上再覆蓋0.02 mol/LNaOH電極緩沖液。4.預(yù)電泳下槽加0.01 mol/L磷酸電極液，上槽加0.02 mol/LNaOH電極緩沖液。下槽接正極，上槽接負(fù)極，打開電源，將電壓分別調(diào)至200V、300V、400V分別15min、30min、30min進(jìn)行預(yù)電泳，以去除未聚合的單體和雜質(zhì)。5.加樣和電泳（根據(jù)樣品性質(zhì)決定電泳時間，經(jīng)驗(yàn)最重要）預(yù)電泳后，吸棄凝膠膠面的溶液，用微量注射器取樣品液30l（約60-150ug蛋白），沿壁加在濃縮膠面上，注入時要慢，避免有氣泡，在樣品液之上小心加入樣品覆蓋液25

11、l，再加入上極緩沖液充滿覆蓋液上方的空隙，將電壓先恒定400V-500V，電泳約16小時，再恒定電壓1000V電泳約2小時。6.剝膠取下凝膠管，用局麻針頭注射器吸取一定量的蒸餾水，將針頭插入膠柱-與管壁之間，邊注水邊旋轉(zhuǎn)玻管，直至膠柱與管壁分開，然后用洗耳球輕輕在玻管的一端加壓，使凝膠柱從玻管緩慢滑出，將凝膠柱置于編號的試管內(nèi)，用蒸餾水沖洗幾次。B.平衡取出膠條分別放入玻璃管中，用平衡緩沖液 I在振蕩儀上振蕩 15 分鐘，倒掉平衡緩沖液 I；再用平衡緩沖液 II在振蕩儀上振蕩 15 分鐘，倒掉平衡緩沖液 II，用去離子水沖洗2次（快速）。C.第二向SDS-PAGE1.玻璃準(zhǔn)備未用過的玻璃和使用

12、過的粘有凝膠的玻璃都必須用3%的氫氧化鈉溶液浸泡過夜才能使用，使用時先用水和清潔劑洗玻璃。用超純水沖洗膠板，洗去清潔劑，然后用無水乙醇擦洗膠板。a、準(zhǔn)備短玻璃膠板：1) 帶上新手套，用鏡頭紙少量蘸取剝離硅烷溶液擦洗玻璃板每個角落。2) 5分鐘后，用少量95%酒精浸濕鏡頭紙，在玻璃板上朝一個方向擦，然后垂直方向擦，重復(fù)擦洗2次。b、準(zhǔn)備長玻璃板：1) 在準(zhǔn)備長膠板前要換手套以避免交叉污染。2) 用浸透12 ml硅化劑溶液的鏡頭紙擦洗玻璃板每個角落。3) 在5分鐘后，加2 ml 95%酒精在膠板上，用紙朝一個方向擦，然后垂直方向擦，重復(fù)擦洗2次。注意：所有的清洗用具必須分開在短膠板和長膠板上使用，

13、以免引起膠板的交叉污染。如果已經(jīng)交叉污染了，凝膠序列可能會破縫或變散。2.凝膠配制及灌膠（1.0mm約80ml兩塊，1.5 約130ml 兩塊）在150ml燒杯中，配制100ml的12%的凝膠水 33 ml第二向凝膠儲備液 40 ml1.5mol/L Tris堿 pH8.8 25 ml10%SDS 1 ml10%AP 0.5 mlTEMED 0.02 ml在加入TEMED和10%AP之前，先減壓抽氣10min，加入后立即準(zhǔn)備裝管（TEMED和10%AP的用量，不同的實(shí)驗(yàn)條件，需實(shí)驗(yàn)室自行摸索， 4小時聚合為宜）將玻璃板對齊，放置于制膠器中夾緊，防止膠液泄露，沿玻璃板上沿一側(cè)緩慢注入凝膠液，防止

14、產(chǎn)生氣泡，約2-3min灌好一塊凝膠，在凝膠液表面加入約700l無水乙醇或正丁醇壓膠，以防空氣氧化，等待聚合。3.膠條的放置待凝膠聚合后，將平衡好的IEF膠條小心倒扣在硬塑料墊板上，由于膠條較軟、易碎，以格齒作以輔助，幫助膠條轉(zhuǎn)移至第二向凝膠上（切忌膠條與凝膠接合處不能有氣泡）用配置好的低熔點(diǎn)瓊脂糖（預(yù)先放置于微波爐中融化），密封住膠條與空氣接觸表面，防止氧化。4.電泳電泳條件：2W恒功率，時間大約30min左右，然后4W恒定功率，大約30min，最后調(diào)節(jié)至18W恒定功率，電泳4-6小時左右，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)膠底處即停止電泳。5.聚丙烯酰胺凝膠電泳的顯色-銀染一塊膠的量：1.固定：過夜+10min

15、去離子水清洗×3   冰醋酸： 50ml 無水乙醇200 ml 定容至500 ml              洗膠：把經(jīng)固定的膠板置于盛有500 ml雙蒸水的塑料盤中清洗三次，每次10min。2.致敏：30min+10min去離子水清洗×3 硫代硫酸鈉：1.57g 無水醋酸鈉：34g 無水乙醇：157.5 ml 定容至500 ml洗膠：把經(jīng)固定的膠板置于盛有500 ml雙蒸水的塑料盤中清洗三次，每次10min3.染色

16、： 20min硝酸銀： 1.25g 定容至500 ml                銀染20min后，純水洗1min2次（振蕩混勻時，注意加遮蔽物以避光）。               4.顯色：2-5min（可配置500×2瓶） 碳酸鈉：25g 37%甲醛：0.2

17、ml 定容至1000 ml                1）.先用少量顯色液快速洗去“黃褐色泥沙樣”的背景雜質(zhì)； 2）.再加入多量顯色液，快速振蕩，密切觀察染色情況，尤其注意不可染過，及時加入終止液。5.終止顯色：10min+30min清洗 7.3g的EDTA.2H2O 定容至500 ml洗膠：把經(jīng)固定的膠板置于盛有500 ml雙蒸水的塑料盤中清洗1次，30min MilliQ水搖晃清洗四，實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論： 從科學(xué)研究上分析，人類已經(jīng)進(jìn)入后基因組時代即蛋白組學(xué)的時代。 蛋白質(zhì)組學(xué)是后基因組時代功能基因組研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。蛋白質(zhì)組學(xué)方法除了應(yīng)用在微生物、腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)、體液研究方面外，還廣泛應(yīng)用于植