大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備教學(xué)提綱

1、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?.1. 熟悉感受態(tài)細(xì)胞制備原理。2.2. 掌握大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備的方法。制備感受態(tài)細(xì)胞可以使用電擊法或化學(xué)法。電擊法是利用瞬時(shí)高壓電流處理細(xì)胞懸浮液，使細(xì)胞膜發(fā)生去極化，產(chǎn)生微孔，懸液中的核酸就可通過微孔進(jìn)入細(xì)胞。電擊轉(zhuǎn)化需要儀器幫助化學(xué)法則更加簡(jiǎn)便，尤其適用于原核細(xì)胞原核細(xì)胞感受態(tài)制備。大腸桿菌感受態(tài)制備：RuCl法CaCl2法其原理是細(xì)胞在低溫，低滲CaCl2（0.1M）作用下，會(huì)發(fā)生膨脹，Ca2+使細(xì)胞膜磷脂雙分子層形成液晶結(jié)構(gòu)，促使細(xì)胞外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶解離開來，誘導(dǎo)細(xì)胞成為感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化時(shí)混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-

2、鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，通過熱刺激，液晶態(tài)細(xì)胞膜表面產(chǎn)生裂隙，使外源DNA進(jìn)入細(xì)胞。操作步驟操作步驟細(xì)菌接種與培養(yǎng)細(xì)菌接種與培養(yǎng)取-70冰凍大腸桿菌DH5菌種，用劃線法接種細(xì)菌于培養(yǎng)皿，做好標(biāo)記，于37培養(yǎng)過夜。第二天，從平板上挑取單個(gè)菌落，接種至含有3ml LB培養(yǎng)液的試管中，37振蕩培養(yǎng)過夜。次日取菌液30 L接種至含有3 ml LB培養(yǎng)基的試管中，37劇烈震蕩培養(yǎng)約23小時(shí)（200300r/min）。菌體收集菌體收集當(dāng)菌落600nm OD值達(dá)到0.30.4時(shí)，將試管取出放置冰上1015分鐘。在無菌條件下，取1ml菌液裝入1.5ml離心管中。4,5000rpm離心5min。棄上清，將管

3、倒置于干濾紙上1min，吸干殘留的培養(yǎng)液。制備感受態(tài)制備感受態(tài)(1)加200 L 冰預(yù)冷的0.1M CaCl2到離心管中，振蕩混勻，使菌體懸浮，冰浴30min。(2) 4,5000rpm離心5分鐘，棄上清，將管倒置于干濾紙上，吸干殘留液體。(3) 加50 L冰預(yù)冷的0.1M的CaCl2，重懸浮菌體，放至4保存?zhèn)溆茫?448小時(shí)內(nèi)使用效果較好。如果暫時(shí)不用，可加入等體積的 30%的甘油（甘油終濃度為15%），混勻。液氮速凍后保存于-80低溫冰箱中待用，可保存半年以上。注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和密度細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和密度最好從-70或-20甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。不要用已多次轉(zhuǎn)接，或貯存在4的培養(yǎng)菌液。應(yīng)用對(duì)數(shù)期或?qū)?shù)生長(zhǎng)前期的細(xì)菌，可通過測(cè)定培養(yǎng)液OD600控制。DH5菌株的OD600 為0.5時(shí)，細(xì)胞密度在5107 個(gè)/ml左右，過高或不足均會(huì)使轉(zhuǎn)化率下降。注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)防止污染防止污染 整個(gè)操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，所用器皿，如離心管，移液槍頭等需要經(jīng)高壓滅菌處