細胞培養(yǎng)技術(shù)入門

1、細胞培養(yǎng)技術(shù)入門細胞培養(yǎng)技術(shù)入門 在細胞培養(yǎng)中注意的一些問題在細胞培養(yǎng)中注意的一些問題 細胞培養(yǎng)的實驗程序細胞培養(yǎng)的實驗程序 細胞的復(fù)蘇細胞的復(fù)蘇 細胞的計數(shù)細胞的計數(shù) 細胞細胞( (貼壁貼壁) )的傳代培養(yǎng)的傳代培養(yǎng) 細胞的凍存細胞的凍存 懸浮細胞的培養(yǎng)方法懸浮細胞的培養(yǎng)方法 在細胞培養(yǎng)中注意的一些問題在細胞培養(yǎng)中注意的一些問題 環(huán)環(huán) 境境 由于體外培養(yǎng)細胞沒有抗感染能力，若由于體外培養(yǎng)細胞沒有抗感染能力，若實驗者粗心大意，技術(shù)操作不規(guī)范，也會導(dǎo)致實驗者粗心大意，技術(shù)操作不規(guī)范，也會導(dǎo)致污染。因而，每一項工作都必須做到有條不紊污染。因而，每一項工作都必須做到有條不紊和完全可靠，特別是實驗環(huán)境

2、更為重要。和完全可靠，特別是實驗環(huán)境更為重要。 1.1.培養(yǎng)室和超凈臺的消毒培養(yǎng)室和超凈臺的消毒 培養(yǎng)室培養(yǎng)室 無菌培養(yǎng)室每天都要用速消凈或無菌培養(yǎng)室每天都要用速消凈或0.20.2的的新潔而滅（苯扎溴銨）拖洗地面一次（拖布要新潔而滅（苯扎溴銨）拖洗地面一次（拖布要專用），紫外線照射消毒專用），紫外線照射消毒303050min50min。 超凈工作臺超凈工作臺 臺面每次實驗前要用臺面每次實驗前要用 75酒精酒精擦洗，然后紫外線消毒擦洗，然后紫外線消毒30 min。消毒時工作臺。消毒時工作臺面上用品不要過多或重疊放置，否則會遮擋射面上用品不要過多或重疊放置，否則會遮擋射線，降低消毒效果。一些操作用

3、具如移液器、線，降低消毒效果。一些操作用具如移液器、廢液缸。污物盒、試管架等用廢液缸。污物盒、試管架等用75酒精擦洗后酒精擦洗后置于臺內(nèi)同時紫外線照射消毒。在工作臺面消置于臺內(nèi)同時紫外線照射消毒。在工作臺面消毒時切勿將培養(yǎng)細胞和培養(yǎng)用液同時照射紫外毒時切勿將培養(yǎng)細胞和培養(yǎng)用液同時照射紫外線。線。2. 2. 培養(yǎng)前準(zhǔn)備培養(yǎng)前準(zhǔn)備 在開始實驗前要制定好詳細的實驗計劃在開始實驗前要制定好詳細的實驗計劃和操作程序，有關(guān)數(shù)據(jù)的計算要事先做好。和操作程序，有關(guān)數(shù)據(jù)的計算要事先做好。根據(jù)實驗要求，準(zhǔn)備各種所需器材和物品、根據(jù)實驗要求，準(zhǔn)備各種所需器材和物品、清點無誤后將其放置到培養(yǎng)室、超凈臺內(nèi)，清點無誤后將

4、其放置到培養(yǎng)室、超凈臺內(nèi)，然后開始消毒。這樣可以避免開始實驗后，然后開始消毒。這樣可以避免開始實驗后，因物品不全往返拿取而增加污染機會。因物品不全往返拿取而增加污染機會。3. 3. 培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件 氣體環(huán)境：氣體環(huán)境：9595空氣加空氣加5 5COCO2 2混和氣體混和氣體環(huán)境中。環(huán)境中。 PHPH值：值：7.27.27.47.4 溫度：溫度：37 培養(yǎng)實驗用品的前期處理培養(yǎng)實驗用品的前期處理1.1.清洗和浸泡清洗和浸泡: :(1)玻璃器皿玻璃器皿: :新的玻璃器皿在生產(chǎn)過程中常新的玻璃器皿在生產(chǎn)過程中常使玻璃表面呈堿性，并帶有一些如鉛和砷等對使玻璃表面呈堿性，并帶有一些如鉛和砷等對細胞有毒

5、的物質(zhì)，使用前必須徹底清洗。首先細胞有毒的物質(zhì)，使用前必須徹底清洗。首先用自來水初步刷洗，用自來水初步刷洗，5 5稀鹽酸溶液中浸泡過夜。稀鹽酸溶液中浸泡過夜。然后用流水徹底沖洗然后用流水徹底沖洗3-53-5遍，單蒸餾水漂洗遍，單蒸餾水漂洗3 3遍，遍，三（雙）蒸水漂洗三（雙）蒸水漂洗2 2遍，烘干備用。遍，烘干備用。 （2)2)塑料器皿塑料器皿: :塑料器皿經(jīng)沖凈后，晾干，塑料器皿經(jīng)沖凈后，晾干，用用2 2NaOHNaOH浸泡過夜，自來水沖洗，浸泡過夜，自來水沖洗，5 5鹽酸浸鹽酸浸泡泡30min30min，流水徹底沖洗，流水徹底沖洗3-53-5遍，單蒸餾水漂洗遍，單蒸餾水漂洗3 3遍，三（雙

6、）蒸水漂洗遍，三（雙）蒸水漂洗2 2遍，烘干備用。針頭式遍，烘干備用。針頭式濾器不能泡酸液濾器不能泡酸液, ,用用2 2NaOHNaOH泡泡6 61212小時小時, ,或者或者煮沸煮沸2020分鐘分鐘, ,常規(guī)沖洗干凈，烘干（常規(guī)沖洗干凈，烘干（6060以下）以下）備用。使用前要包裝，首先要裝好濾膜，安裝備用。使用前要包裝，首先要裝好濾膜，安裝時注意光面朝上時注意光面朝上( (凹向上凹向上) )，然后用注射器回抽，然后用注射器回抽注入檢查膜是否破損，安裝好膜后將螺旋稍微注入檢查膜是否破損，安裝好膜后將螺旋稍微 擰松一些，放入鋁盒內(nèi)（或用牛皮紙包裝）外擰松一些，放入鋁盒內(nèi)（或用牛皮紙包裝）外層用

7、紙包裝備用。注意在超凈臺內(nèi)取出使用時層用紙包裝備用。注意在超凈臺內(nèi)取出使用時應(yīng)該立即將螺旋旋緊；膠塞的處理：按常規(guī)沖應(yīng)該立即將螺旋旋緊；膠塞的處理：按常規(guī)沖洗干凈烘干后，用洗干凈烘干后，用2 2氫氧化鈉溶液煮沸氫氧化鈉溶液煮沸3030分鐘分鐘（用過的膠塞要置入單蒸水中浸泡，再用沸水（用過的膠塞要置入單蒸水中浸泡，再用沸水處理處理3030鐘），自來水洗凈，烘干然后再泡入鐘），自來水洗凈，烘干然后再泡入1 1稀鹽酸液中稀鹽酸液中3030分鐘，用自來水徹底沖洗分鐘，用自來水徹底沖洗3-53-5遍，遍，蒸餾水漂洗蒸餾水漂洗3 3遍，三（雙）蒸漂洗遍，三（雙）蒸漂洗2 2遍，烘干備遍，烘干備用。用。2.

8、2.包裝：包裝： 在消毒前必須進行嚴(yán)格包裝，以便消毒及在消毒前必須進行嚴(yán)格包裝，以便消毒及儲存，防止落入灰塵及消毒后再次被污染。包儲存，防止落入灰塵及消毒后再次被污染。包裝紙（盒）表面用油性記號筆標(biāo)明物品名稱、裝紙（盒）表面用油性記號筆標(biāo)明物品名稱、消毒日期等。消毒日期等。 3.3.消毒消毒: : 在組織細胞培養(yǎng)技術(shù)中，務(wù)必保證組織細在組織細胞培養(yǎng)技術(shù)中，務(wù)必保證組織細胞在無微生物的條件下生長。防止培養(yǎng)物污染胞在無微生物的條件下生長。防止培養(yǎng)物污染可通過消毒滅菌（將已存在的微生物去除）和可通過消毒滅菌（將已存在的微生物去除）和無菌操作技術(shù)（防止已經(jīng)消毒滅菌的用品被污無菌操作技術(shù)（防止已經(jīng)消毒滅

9、菌的用品被污染）來完成。染）來完成。（1 1）消毒滅菌的方法）消毒滅菌的方法 : 物理方法物理方法: : 濕熱（高壓蒸汽）、干熱、濕熱（高壓蒸汽）、干熱、紫外線照射線、過濾、離心沉淀等方法殺滅或紫外線照射線、過濾、離心沉淀等方法殺滅或去除微生物去除微生物. . 化學(xué)方法化學(xué)方法: :使用化學(xué)消毒劑、抗菌素等使用化學(xué)消毒劑、抗菌素等殺滅微生物。殺滅微生物。 (2)(2)消毒滅菌的時間：消毒滅菌的時間： 干熱消毒：一般在烤箱中進行，需加溫到干熱消毒：一般在烤箱中進行，需加溫到 160160，保持，保持9090120 min120 min方能殺死芽孢。消毒方能殺死芽孢。消毒完畢后不可馬上將烤箱門打開

10、，以免冷空氣突完畢后不可馬上將烤箱門打開，以免冷空氣突然進入，影響消毒效果和損壞玻璃器皿或發(fā)生然進入，影響消毒效果和損壞玻璃器皿或發(fā)生意外事故。意外事故。 濕熱消毒：一般使用高壓蒸汽滅菌器進行濕熱消毒：一般使用高壓蒸汽滅菌器進行消毒，要求是：消毒，要求是： 不能裝太滿，保持消毒器內(nèi)氣體流通。不能裝太滿，保持消毒器內(nèi)氣體流通。 在加熱升壓之前，打開排氣閥門，使加在加熱升壓之前，打開排氣閥門，使加熱后消毒器內(nèi)的殘留冷空氣排出。熱后消毒器內(nèi)的殘留冷空氣排出。 關(guān)閉排氣關(guān)閉排氣閥門，開始升壓，待達到所需要的壓力時，開閥門，開始升壓，待達到所需要的壓力時，開始記錄時間，并控制壓力恒定。始記錄時間，并控制

11、壓力恒定。 一般物品：布類、金屬器械、玻璃器一般物品：布類、金屬器械、玻璃器皿等消毒的要求是皿等消毒的要求是 1515磅磅20 min20 min；常規(guī)使用；常規(guī)使用液體：消毒液體：消毒 1515磅磅 15 min 15 min 。橡膠和塑料用。橡膠和塑料用品品 ：如濾器、：如濾器、EPEP管、離心管等高壓管、離心管等高壓1010磅磅15 15 minmin。 紫外線消毒：紫外線消毒：主要用于實驗室房間里的空主要用于實驗室房間里的空氣、操作氣、操作 臺表面及桌椅等消毒。時間為臺表面及桌椅等消毒。時間為30min30min2h2h左右。左右。 過濾除菌消毒：過濾除菌消毒：適用于組織細胞培養(yǎng)使用適

12、用于組織細胞培養(yǎng)使用的液體的液體 如血清、合成培養(yǎng)液、酶及含有蛋白如血清、合成培養(yǎng)液、酶及含有蛋白質(zhì)具有生物活性的液體等。質(zhì)具有生物活性的液體等。 4.4.細胞培養(yǎng)用液及培養(yǎng)基（液）細胞培養(yǎng)用液及培養(yǎng)基（液）: : （1 1）水：）水：雙蒸水、三蒸水，可高壓除菌。雙蒸水、三蒸水，可高壓除菌。 （2 2）平衡鹽溶液（）平衡鹽溶液（PBS)PBS)：PHPH為為7.27.27.47.4，不，不含鈣鎂離子含鈣鎂離子 ，可高壓除菌。，可高壓除菌。（3 3）消化液）消化液 ： 胰蛋白酶液：胰蛋白酶液：常用胰蛋白酶的濃度為常用胰蛋白酶的濃度為0 025 25 ，pHpH值值7.27.2左右。需過濾除菌。左

13、右。需過濾除菌。 EDTAEDTA液：液：常用濃度為常用濃度為 0 00202，配制時，配制時采用無采用無CaCa2+2+、MgMg2+2+平衡鹽液溶解，高壓滅菌平衡鹽液溶解，高壓滅菌后即可使用。后即可使用。 胰蛋白酶胰蛋白酶EDTAEDTANa2:Na2:需過濾除菌。胰需過濾除菌。胰蛋白酶和蛋白酶和EDTANaEDTANa2 2聯(lián)合使用可提高消化率，聯(lián)合使用可提高消化率，但需注意但需注意EDTAEDTA不能被血清中和，消化后要不能被血清中和，消化后要徹底清洗，否則細胞易脫壁。徹底清洗，否則細胞易脫壁。 膠原酶：膠原酶：適于消化分離纖維性組織、適于消化分離纖維性組織、上皮及癌組織，可使上皮細胞

14、與膠原成上皮及癌組織，可使上皮細胞與膠原成分分離而不受損害。可用分分離而不受損害?？捎肂SSBSS或含血清或含血清的培養(yǎng)液配制，這樣實驗操作簡便同時的培養(yǎng)液配制，這樣實驗操作簡便同時提高細胞成活率。提高細胞成活率。 但膠原酶價格較高，大量使用將增加實驗但膠原酶價格較高，大量使用將增加實驗成本。膠原酶的常用劑量為成本。膠原酶的常用劑量為 200 U200 Umlml（約為（約為 lmglmgmlml）或）或 0 003030 03 3。(4)(4)培養(yǎng)基（液）過濾除菌培養(yǎng)基（液）過濾除菌 常用常用0 022pm22pm微孔濾膜。微孔濾膜。（4 4）l640l640培養(yǎng)液培養(yǎng)液( (常用常用) )

15、（5 5）DMEMDMEM、F12F12培養(yǎng)液培養(yǎng)液 （6 6）HamHam培養(yǎng)液培養(yǎng)液 ( (無血清培養(yǎng)中常用的無血清培養(yǎng)中常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基) )（7 7）HepesHepes：具有較強的緩沖能力，能具有較強的緩沖能力，能常時間恒定緩沖液的常時間恒定緩沖液的PHPH值。使用濃度可根值。使用濃度可根據(jù)緩沖要求而定。據(jù)緩沖要求而定。（8 8）3% L-3% L-谷氨酰胺：谷氨酰胺：可作為細胞能量來源，可作為細胞能量來源，使用量使用量1 1。但其在溶液中極不穩(wěn)定，需重新加。但其在溶液中極不穩(wěn)定，需重新加入。入。（9 9）丙酮酸鈉、葡萄糖：）丙酮酸鈉、葡萄糖：是屬碳水化合物的是屬碳水化合物

16、的成分，是細胞生命的能量來源。成分，是細胞生命的能量來源。（1010）抗生素：）抗生素：最終濃度為青霉素最終濃度為青霉素 100 U100 Umlml，鏈霉素鏈霉素100U100Umlml（青霉素為（青霉素為8080萬萬U U瓶，將其溶瓶，將其溶解于解于4ml4ml三蒸水中，每升培養(yǎng)液中加入三蒸水中，每升培養(yǎng)液中加入0.5ml0.5ml；鏈霉素為鏈霉素為100100萬萬U U瓶，將其溶解在瓶，將其溶解在5ml5ml三蒸水中，三蒸水中，每升培養(yǎng)液加每升培養(yǎng)液加0.5ml0.5ml）。）。 （1111）細胞生長液：）細胞生長液：是用以維持細胞生長增殖是用以維持細胞生長增殖的液體。其是配方：的液體。

17、其是配方：基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基 80809090 血清血清 10102020 雙抗雙抗 100u/ml 100u/ml （1212）細胞維持液：）細胞維持液：用以維持細胞緩慢生長或用以維持細胞緩慢生長或不死的培養(yǎng)液。其是配方：不死的培養(yǎng)液。其是配方：基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基 9595 血清血清 2 25 5 雙抗雙抗100u/ml 100u/ml （1313）凍存液：）凍存液：其是配方：其是配方： 1010DMSO DMSO 40 40小牛血清（小牛血清（3030FBSFBS） 1 1的的5.65.6NaHCONaHCO3 3 1 1雙抗雙抗 4848（5858）基礎(chǔ)培養(yǎng)液。）基礎(chǔ)培養(yǎng)液。（141

18、4）MEMMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)液: :其是配方：其是配方： 63%MEM63%MEM液液 2020的乳蛋白水解物的乳蛋白水解物 1010的小牛血清的小牛血清 1 1的雙抗（的雙抗（P P、S S） 用用5.65.6NaHCONaHCO3 3溶液調(diào)溶液調(diào)pHpH至至7.27.27.47.4。細胞培養(yǎng)的實驗程序細胞培養(yǎng)的實驗程序細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng) 動物組織原代培養(yǎng)動物組織原代培養(yǎng) 細胞株的體外培養(yǎng)細胞株的體外培養(yǎng)血管、骨髓、羊水、胸水、腹水內(nèi)血管、骨髓、羊水、胸水、腹水內(nèi) 細胞株貯存在液氮灌或細胞株貯存在液氮灌或8080細胞及皮膚、粘膜、神經(jīng)、胚胎、細胞及皮膚、粘膜、神經(jīng)、胚胎、 以下的低溫冰箱中以下的

19、低溫冰箱中 腫瘤等組織腫瘤等組織 分離分離 復(fù)蘇復(fù)蘇組織切成組織切成1cm1cm3 3小塊，方法根據(jù)樣本而異。小塊，方法根據(jù)樣本而異。 細胞復(fù)蘇時速度要快，立即放入細胞復(fù)蘇時速度要快，立即放入有機械分散法、剪切分離法、消化分離法有機械分散法、剪切分離法、消化分離法 37 37 水浴箱中充分溶解，立即水浴箱中充分溶解，立即（胰酶消化分離法、膠原酶法（胰酶消化分離法、膠原酶法 ） 離心離心500500 1000r/min1000r/min1 1 2min2min，棄掉上清液。棄掉上清液。獲得細胞懸液種入獲得細胞懸液種入 接種入瓶中培養(yǎng)接種入瓶中培養(yǎng)培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)培養(yǎng)瓶中培養(yǎng) 3737培養(yǎng)箱（或培養(yǎng)箱

20、（或5%CO5%CO2 2培養(yǎng)箱）中培養(yǎng)培養(yǎng)箱）中培養(yǎng)2424小時后換液小時后換液去處對細胞生長有毒物質(zhì)，如去處對細胞生長有毒物質(zhì)，如DMSODMSO、細胞組織殘渣、細胞代謝產(chǎn)物、細胞組織殘渣、細胞代謝產(chǎn)物 貼壁細胞貼壁細胞 懸浮細胞懸浮細胞直接去掉上清液直接去掉上清液 離心去掉上清液，必要時做細胞飼離心去掉上清液，必要時做細胞飼養(yǎng)層以凈化細胞養(yǎng)層以凈化細胞 傳代傳代 細胞生長細胞生長8080以上覆蓋培養(yǎng)瓶底，根據(jù)細胞生長周期不同而異，以上覆蓋培養(yǎng)瓶底，根據(jù)細胞生長周期不同而異， 2 23 3天或天或1 1周左右一代周左右一代 貼壁細胞貼壁細胞 懸浮細胞懸浮細胞. .消化法，用胰酶消化法，用胰

21、酶EDTANa2EDTANa2消化，消化， 直接吹打或離心法、自然沉淀法，直接吹打或離心法、自然沉淀法， 時間根據(jù)細胞而定時間根據(jù)細胞而定 吸一半液到另一瓶吸一半液到另一瓶凍存凍存凍存程序凍存程序 細胞凍存管寫好標(biāo)簽：細胞名稱，時間及保存人。細胞凍存管寫好標(biāo)簽：細胞名稱，時間及保存人。 取對數(shù)生長期的細胞（取對數(shù)生長期的細胞（2 25 5 1O1O5 5cellscellsmlml），收集細胞前），收集細胞前24h24h換液；換液； 吸出培養(yǎng)液，用吸出培養(yǎng)液，用PBSPBS洗細胞一次，除去，加入消化液胰蛋白酶洗細胞一次，除去，加入消化液胰蛋白酶EDTANaEDTANa2 2（消化時間根據(jù)細胞而

22、定），去掉消化液，加入培養(yǎng)液充（消化時間根據(jù)細胞而定），去掉消化液，加入培養(yǎng)液充分混勻，分混勻，1000rp1000rp離心離心1min ,1min ,去掉上清液；去掉上清液； 重懸浮于凍存液中，大約重懸浮于凍存液中，大約1 15 5 10106 6cellscellsmlml； 每個凍存管中加入每個凍存管中加入lmllml細胞懸浮液，擰緊蓋子。細胞懸浮液，擰緊蓋子。 冷凍細胞應(yīng)緩慢降溫，可用裝有異丙醇的冷凍盒冷凍細胞應(yīng)緩慢降溫，可用裝有異丙醇的冷凍盒30min 30min 1h1h后后, ,再放入再放入-20-200 0C C冰箱中冰箱中2h2h左右，然后轉(zhuǎn)至左右，然后轉(zhuǎn)至-80-800 0

23、C C冰箱，可保存數(shù)月，如冰箱，可保存數(shù)月，如需長期保存，應(yīng)在需長期保存，應(yīng)在-80-800 0C C冰箱中放冰箱中放3h 3h 8h8h后轉(zhuǎn)至液氮中。后轉(zhuǎn)至液氮中。 細胞計數(shù)細胞計數(shù) 一、原理一、原理 細胞計數(shù)結(jié)果以細胞數(shù)細胞計數(shù)結(jié)果以細胞數(shù)/ /毫升表示。在細毫升表示。在細胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細胞，胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細胞，總細胞中活細胞所占的百分比叫做總細胞中活細胞所占的百分比叫做細胞活力細胞活力，由組織中分離細胞一般也要檢查活力，以了解由組織中分離細胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對細胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的分離的過程對細胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的細胞

24、也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。細胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。 用臺盼（酚）蘭染細胞，死細胞著色，用臺盼（酚）蘭染細胞，死細胞著色，活細胞不著色，從而可以區(qū)分死細胞與活細活細胞不著色，從而可以區(qū)分死細胞與活細胞。利用細胞內(nèi)某些酶與特定的試劑發(fā)生顯胞。利用細胞內(nèi)某些酶與特定的試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，也可測定細胞相對數(shù)和相對活力。色反應(yīng)，也可測定細胞相對數(shù)和相對活力。二、儀器、用品與試劑二、儀器、用品與試劑1 1、儀器與用品：、儀器與用品：普通顯微鏡、血球計數(shù)板、普通顯微鏡、血球計數(shù)板、EPEP管、毛細吸管等。管、毛細吸管等。2 2、試劑、試劑： SP20SP20細胞、細胞、 0.40.4

25、臺盼（酚）蘭其臺盼（酚）蘭其配方是：臺盼（酚）蘭配方是：臺盼（酚）蘭 0.4g0.4g加雙蒸水加雙蒸水100ml100ml等。等。 3 3、材料：、材料：細胞懸液細胞懸液細胞懸液的制備：細胞懸液的制備： 用毛吸管吸用毛吸管吸5 5滴細胞懸液到滴細胞懸液到EPEP管中，加入管中，加入1 1滴滴0.40.4臺盼藍染液或苯胺黑，混勻，靜置臺盼藍染液或苯胺黑，混勻，靜置2 23min,3min,活細胞不會被染色，而死細胞著藍色，這樣加入活細胞不會被染色，而死細胞著藍色，這樣加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細胞和死細胞。染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細胞和死細胞。三、操作步驟三、操作步驟 1 1、將血球計

26、數(shù)板及蓋片用軟紗布擦試干凈，、將血球計數(shù)板及蓋片用軟紗布擦試干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板上。并將蓋片蓋在計數(shù)板上。 2 2、將細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，、將細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間。使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間。 3 3、靜置、靜置3 3分鐘。分鐘。 4 4、鏡下觀察，計算計數(shù)板四個大、鏡下觀察，計算計數(shù)板四個大格細胞總數(shù)，壓線細胞只計左側(cè)和上格細胞總數(shù)，壓線細胞只計左側(cè)和上方的。然后按下式計算：方的。然后按下式計算：（細胞懸液的細胞數(shù)）（細胞懸液的細胞數(shù)）/ml/ml （ 四個大格子四個大格子細胞數(shù)細胞數(shù)/4)/4)稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)10104 4 /ml

27、 /ml 四、細胞計數(shù)要點：四、細胞計數(shù)要點： 1.1.要求懸液中細胞數(shù)目不低于要求懸液中細胞數(shù)目不低于10104 4個個/ml/ml，如，如果細胞數(shù)目很少要進行離心再懸浮于少量培養(yǎng)果細胞數(shù)目很少要進行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中；液中； 2.2.要求細胞懸液中的細胞分散良好，否則要求細胞懸液中的細胞分散良好，否則影響計數(shù)準(zhǔn)確性。影響計數(shù)準(zhǔn)確性。 3.3.取樣計數(shù)前，應(yīng)充分混勻細胞懸液，尤其取樣計數(shù)前，應(yīng)充分混勻細胞懸液，尤其時多次取樣計數(shù)時更意每次取樣都要混勻，以時多次取樣計數(shù)時更意每次取樣都要混勻，以求計數(shù)準(zhǔn)確；求計數(shù)準(zhǔn)確； 4.4.操作時，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓操作時，注意蓋片下不能

28、有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計數(shù)。懸液流入旁邊槽中，否則要重新計數(shù)。 5.5.數(shù)細胞的原則是只數(shù)完整的細胞，若細胞聚數(shù)細胞的原則是只數(shù)完整的細胞，若細胞聚集成團時只按照一個細胞計算。如果細胞壓在格集成團時只按照一個細胞計算。如果細胞壓在格線上時，則只計上線，不計下線，只計左線，不線上時，則只計上線，不計下線，只計左線，不計右線。計右線。 體外細胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)體外細胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)概述概述 復(fù)蘇細胞與凍存的要求相反，應(yīng)采用快復(fù)蘇細胞與凍存的要求相反，應(yīng)采用快速融化的手段。這樣可以保證細胞外結(jié)晶在速融化的手段。這樣可以保證細胞外結(jié)晶在很短的時間內(nèi)即融化。避免由于緩慢融化使很短的時間內(nèi)

29、即融化。避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細胞造成水分滲入細胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細胞造成損害。損害。用品和試劑用品和試劑 培 養(yǎng) 液 、 吸 管 、 離 心 管 、 培 養(yǎng) 瓶 、培 養(yǎng) 液 、 吸 管 、 離 心 管 、 培 養(yǎng) 瓶 、CHO/HelaCHO/Hela細胞等。細胞等。操作步驟（圖）操作步驟（圖） 注注 意意 存取凍存管時都要佩戴防護眼鏡和手套，存取凍存管時都要佩戴防護眼鏡和手套，凍存管投入存放溫水的器皿中后應(yīng)立即把蓋子凍存管投入存放溫水的器皿中后應(yīng)立即把蓋子扣上，以防發(fā)生意外。扣上，以防發(fā)生意外。 離心后上清夜一定要吸干凈，以免因離心后上清夜一定要吸干凈，以免因

30、DSMODSMO的毒性造成細胞活力下降而難以復(fù)活。的毒性造成細胞活力下降而難以復(fù)活。 細胞傳代培養(yǎng)細胞傳代培養(yǎng)一、原理一、原理 在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和（細胞增值達到一定密度后），為使細胞能繼（細胞增值達到一定密度后），為使細胞能繼續(xù)生長，同時也將細胞數(shù)量擴大，就必須進行續(xù)生長，同時也將細胞數(shù)量擴大，就必須進行傳代（再養(yǎng)）。傳代培養(yǎng)也是一種將細胞種保傳代（再養(yǎng)）。傳代培養(yǎng)也是一種將細胞種保存下去的方法。同時也是利用培養(yǎng)細胞進行各存下去的方法。同時也是利用培養(yǎng)細胞進行各種實驗的必經(jīng)過程。懸浮型細胞直接分瓶就可種實驗的必經(jīng)過程。懸浮型細胞直接分瓶就可

31、以，而貼壁細胞需經(jīng)消化后才能分瓶。以，而貼壁細胞需經(jīng)消化后才能分瓶。二、材料和試劑二、材料和試劑 細胞：貼壁細胞株細胞：貼壁細胞株CHOCHO 試劑：試劑：0.250.25胰酶、胰酶、16401640培養(yǎng)基（含培養(yǎng)基（含1010小牛血清）。小牛血清）。 儀器和器材：倒置顯微鏡，培養(yǎng)箱、培養(yǎng)儀器和器材：倒置顯微鏡，培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、吸管、廢液缸等。瓶、吸管、廢液缸等。 三、操作步驟三、操作步驟 將長滿細胞的培養(yǎng)瓶中原來的培養(yǎng)液棄去。將長滿細胞的培養(yǎng)瓶中原來的培養(yǎng)液棄去。 加入加入0.50.51ml 0.251ml 0.25胰酶溶液，使瓶底細胰酶溶液，使瓶底細胞都浸入溶液中。胞都浸入溶液中。 瓶口塞

32、好橡皮塞，放在倒置鏡下觀察細胞。瓶口塞好橡皮塞，放在倒置鏡下觀察細胞。隨著時間的推移，原貼壁的細胞逐漸趨于圓形，隨著時間的推移，原貼壁的細胞逐漸趨于圓形，在還未漂起時將胰酶棄去，加入在還未漂起時將胰酶棄去，加入10ml10ml培養(yǎng)液終培養(yǎng)液終止消化。觀察消化也可以用肉眼，當(dāng)見到瓶底止消化。觀察消化也可以用肉眼，當(dāng)見到瓶底發(fā)白并出現(xiàn)細針孔空隙時終止消化。一般室發(fā)白并出現(xiàn)細針孔空隙時終止消化。一般室溫消化時間約為溫消化時間約為1 13 3分鐘。分鐘。 用吸管將貼壁的細胞吹打成懸液，分到另用吸管將貼壁的細胞吹打成懸液，分到另外兩到三瓶中，塞好橡皮塞（或瓶蓋），置外兩到三瓶中，塞好橡皮塞（或瓶蓋），置

33、3737下繼續(xù)培養(yǎng)。第二天觀察貼壁生長情況。下繼續(xù)培養(yǎng)。第二天觀察貼壁生長情況。四、注意事項四、注意事項 形成的單層細胞相互匯合，整個瓶底逐漸形成的單層細胞相互匯合，整個瓶底逐漸被覆蓋時要立即進行分離培養(yǎng)，否則細胞會因生被覆蓋時要立即進行分離培養(yǎng)，否則細胞會因生存空間不足或密度過大，營養(yǎng)障礙，影響細胞生存空間不足或密度過大，營養(yǎng)障礙，影響細胞生長。長。 傳代時不同的細胞消化時間不同，因而要傳代時不同的細胞消化時間不同，因而要根據(jù)需要注意觀察及時進行處理。以免因消化過根據(jù)需要注意觀察及時進行處理。以免因消化過頭而產(chǎn)生過多的細胞碎片，影響細胞生長。頭而產(chǎn)生過多的細胞碎片，影響細胞生長。 吹打細胞時

34、動作要輕巧盡可能減少對細胞的吹打細胞時動作要輕巧盡可能減少對細胞的損傷。損傷。 防止由于培養(yǎng)細胞污染等因素造成細胞系的防止由于培養(yǎng)細胞污染等因素造成細胞系的絕種，要及時凍存細胞。絕種，要及時凍存細胞。 細胞檔案要記錄好，如組織來源，生物學(xué)特細胞檔案要記錄好，如組織來源，生物學(xué)特性，培養(yǎng)液要求、傳代、換液時間和規(guī)律，細胞性，培養(yǎng)液要求、傳代、換液時間和規(guī)律，細胞的遺傳學(xué)標(biāo)志，生長形態(tài)，常規(guī)病理染色的標(biāo)本的遺傳學(xué)標(biāo)志，生長形態(tài)，常規(guī)病理染色的標(biāo)本等。等。附附1 116401640基礎(chǔ)培養(yǎng)基配置方法基礎(chǔ)培養(yǎng)基配置方法: :16401640粉粉 10.4g 10.4g Hepes 2.38g Hepe

35、s 2.38g 葡萄糖葡萄糖 2.5g 2.5g 丙酮酸鈉丙酮酸鈉 110mg NaHCO110mg NaHCO3 3 2g 2g 雙（三）蒸水加至雙（三）蒸水加至1000ml1000ml附附2 2：消化液配制方法：消化液配制方法：稱取稱取0.25g0.25g胰酶蛋白酶（活力為胰酶蛋白酶（活力為1 1：250250），加），加100ml100ml無無CaCa2+2+、MgMg2+2+的的HanksHanks液液( (或或PBSPBS液液) )溶解，溶解，濾器過濾除用前可在濾器過濾除用前可在3737下回溫。胰酶溶液中下回溫。胰酶溶液中也可加入也可加入EDTAEDTANaNa2 2，使最終濃度達，

36、使最終濃度達0.020.02。 細胞的凍存細胞的凍存 一、概述一、概述 凍存細胞時要緩慢冷凍。因為細胞在直凍存細胞時要緩慢冷凍。因為細胞在直接冷凍時，細胞內(nèi)外的水分都會很快形成冰接冷凍時，細胞內(nèi)外的水分都會很快形成冰晶，冰晶的形成將引起一系列的不良反應(yīng)。晶，冰晶的形成將引起一系列的不良反應(yīng)。首先細胞脫水首先細胞脫水, ,部分蛋白質(zhì)由于上述因素而變部分蛋白質(zhì)由于上述因素而變性，引起細胞內(nèi)部空間結(jié)構(gòu)紊亂，細胞內(nèi)冰性，引起細胞內(nèi)部空間結(jié)構(gòu)紊亂，細胞內(nèi)冰晶的形成和細胞膜系統(tǒng)上蛋白質(zhì)、酶的變性，晶的形成和細胞膜系統(tǒng)上蛋白質(zhì)、酶的變性，引起細胞能量代謝的障礙。引起細胞能量代謝的障礙。細胞膜上的類脂蛋白復(fù)合

37、體在冷凍中易發(fā)生破壞細胞膜上的類脂蛋白復(fù)合體在冷凍中易發(fā)生破壞引起胞膜通透性的改變、使細胞內(nèi)容物喪失。細引起胞膜通透性的改變、使細胞內(nèi)容物喪失。細胞核內(nèi)胞核內(nèi)DNADNA也是冷凍時細胞易受損傷部分。如細也是冷凍時細胞易受損傷部分。如細胞內(nèi)冰晶形成較多，隨冷凍溫度的降低，冰晶體胞內(nèi)冰晶形成較多，隨冷凍溫度的降低，冰晶體積膨脹造成積膨脹造成DNADNA的空間構(gòu)型發(fā)生不可逆的損傷性的空間構(gòu)型發(fā)生不可逆的損傷性變化，而引起細胞的死亡。因此在細胞凍存時要變化，而引起細胞的死亡。因此在細胞凍存時要盡可能的均勻地減少細胞內(nèi)水分，減少細胞內(nèi)冰盡可能的均勻地減少細胞內(nèi)水分，減少細胞內(nèi)冰晶的形成是減少細胞損傷的關(guān)

38、鍵。晶的形成是減少細胞損傷的關(guān)鍵。 目前多采用甘油或二甲基亞砜作保護劑。這目前多采用甘油或二甲基亞砜作保護劑。這兩種物質(zhì)分子量小，溶解度大，易穿透細胞，兩種物質(zhì)分子量小，溶解度大，易穿透細胞，可以使冰點下降，提高胞膜對水的通透性；加可以使冰點下降，提高胞膜對水的通透性；加上緩慢冷凍方法可使細胞內(nèi)的水分滲出細胞外，上緩慢冷凍方法可使細胞內(nèi)的水分滲出細胞外，在胞外形成冰晶，減少細胞內(nèi)冰晶的形成，從在胞外形成冰晶，減少細胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成所造成的細胞損傷。這樣而減少由于冰晶形成所造成的細胞損傷。這樣可以最大限度的保存細胞活力?？梢宰畲笙薅鹊谋４婕毎盍?。二、用品和試劑二、用品和試劑

39、 0.25 0.25胰蛋白酶。胰蛋白酶。 含含10102020( (胎牛胎牛) )血清培養(yǎng)液。血清培養(yǎng)液。 吸管、離心管、吸管、離心管、2ml2ml凍存管（如質(zhì)量不好，凍存管（如質(zhì)量不好，有時密封不嚴(yán)，使用時炸裂；因而使用前要有時密封不嚴(yán)，使用時炸裂；因而使用前要仔細檢查）。仔細檢查）。 酒精燈（或其他安瓶封口設(shè)備）酒精燈（或其他安瓶封口設(shè)備） 、封口膠、封口膠等。等。 凍存液凍存液: : DMSODMSO液液 ： 1010DMSO 1DMSO 1雙抗（過濾）雙抗（過濾） 4040小牛血清（小牛血清（3030FBSFBS） 4848（5858）基礎(chǔ)培養(yǎng)液）基礎(chǔ)培養(yǎng)液( (無菌無菌) ) 1 1

40、的的5.65.6NaHCONaHCO3 3 ( (無菌無菌) ) 無色新鮮甘油（無色新鮮甘油（1 1磅蒸汽高壓消毒）磅蒸汽高壓消毒）三、操作步驟三、操作步驟 （圖）（1 1）取生長狀態(tài)好的細胞即選擇對數(shù)）取生長狀態(tài)好的細胞即選擇對數(shù)生長期細胞，已經(jīng)長滿的細胞凍存。生長期細胞，已經(jīng)長滿的細胞凍存。（2 2）離心洗滌）離心洗滌 用胰蛋白酶把單層生長的細用胰蛋白酶把單層生長的細胞消化下來，懸浮生長的細胞則不需處理。胞消化下來，懸浮生長的細胞則不需處理。依據(jù)傳代方法把消化好的細胞收集于離心管依據(jù)傳代方法把消化好的細胞收集于離心管加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液并計數(shù)，離心加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液并計數(shù)，離心 1000 rpm1000 rpmminmin2 min2 min。去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液。去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液。（3 3）加含）加含1010DMSODMSO凍存液凍存液 加入配制好加入配制好的凍存培養(yǎng)液（含的凍存培養(yǎng)液（含1010DMSODMSO或甘油），或甘