第2章 微生物發(fā)酵制藥工藝

1、第第2章章 微生物發(fā)酵制藥工藝微生物發(fā)酵制藥工藝本章內(nèi)容2.1 微生物發(fā)酵與制藥2.2 制藥微生物生長特征2.3 制藥微生物菌種的建立2.4 培養(yǎng)基制備2.5 滅菌工藝2.6 微生物發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)2.7 發(fā)酵工藝過程的控制2.8 抗生素生產(chǎn)工藝2.9 氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)工藝2.10 維生素生產(chǎn)工藝2.1 微生物發(fā)酵與制藥v發(fā)酵v發(fā)酵制藥v發(fā)酵制藥的基本過程1 發(fā)酵概念v發(fā)酵概念：通過微生物培養(yǎng)而獲得產(chǎn)物的過程。v發(fā)酵種類：用產(chǎn)品說明，冠以產(chǎn)物名而成，如青霉素發(fā)酵，維生素發(fā)酵；發(fā)酵工程按需氧分為好氧發(fā)酵和厭氧發(fā)酵。 v初級代謝產(chǎn)物：在初級代謝過程中形成的產(chǎn)物，包括各種小分子前體、單體和多糖、蛋白質(zhì)、脂

2、肪、核酸等。生長所必須的。幾乎所有生物初級代謝基本相同。氨基酸，核苷酸，有機酸。v次級代謝產(chǎn)物：比較復(fù)雜的化合物，不是細(xì)胞生長必需的，對生命活動有意義（抗逆境條件）?？股?，毒素，色素。2、發(fā)酵制藥概念v利用制藥微生物的生長繁殖，通過發(fā)酵，代謝合成藥物，然后從中分離提取、精制純化，獲得藥品的過程抗生素的發(fā)現(xiàn) v1928年，英國細(xì)菌學(xué)家Fleming B發(fā)現(xiàn)抗菌物質(zhì)青霉素。在20世紀(jì)40年代，一共發(fā)現(xiàn)了14種抗生素，50年代發(fā)現(xiàn)了20余種，60年代開始了化學(xué)結(jié)構(gòu)改造的合成和半合成抗生素階段。目前發(fā)現(xiàn)并分離到約9000種抗生素，半合成抗生素約1000種，共萬種以上。但實際生產(chǎn)和應(yīng)用的只有100余種

3、。發(fā)酵制藥種類微生物菌體發(fā)酵微生物菌體發(fā)酵是以獲得微生物菌體為目的，如：面包的酵母發(fā)酵、單細(xì)胞蛋白發(fā)酵（利用各種碳源）、真菌類（各種蘑菇、冬蟲夏草）、生物防治劑（蘇云金桿菌，伴孢晶體可以毒殺鱗翅目、雙翅目害蟲）。微生物酶發(fā)酵微生物酶發(fā)酵是以獲得酶為目的的發(fā)酵，如青霉素酰化酶，用于半合成青霉素時，制備中間體6氨基青霉烷酸。微生物代謝產(chǎn)物發(fā)酵初級代謝產(chǎn)物：氨基酸，核苷酸，維生素，有機酸。次級代謝產(chǎn)物：最主要的是抗生素。微生物轉(zhuǎn)化發(fā)酵利用微生物的一種或多種酶把一種化合物轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)構(gòu)相關(guān)的更有價值的產(chǎn)物的生化反應(yīng)為轉(zhuǎn)化發(fā)酵。 制藥微生物的種類 v生產(chǎn)藥物的天然微生物主要包括細(xì)菌、放線菌和絲狀真菌三大類。

4、v細(xì)菌主要生產(chǎn)環(huán)狀或鏈狀多肽類抗生素，如芽孢桿菌(Bacillus)產(chǎn)生桿菌肽（bacitracin），多黏芽孢桿菌（Bacillus polymyxa）產(chǎn)生黏菌肽（colistin）和多黏菌素（polymyxin）。細(xì)菌還可以產(chǎn)生氨基酸和維生素，如黃色短桿菌（Brevibacterium flarum）產(chǎn)生谷氨酸，大小菌生產(chǎn)維生素C。v放線菌主要產(chǎn)生各類抗生素，以鏈霉菌屬最多，諾卡菌屬較少，還有小單孢菌屬。生產(chǎn)的抗生素主要有氨基糖苷類（鏈霉素、新霉素、卡那霉素等）、四環(huán)類（四環(huán)素、金霉素、土霉素等）、放線菌素類（放線菌素D）大環(huán)內(nèi)酯類（紅霉素、螺旋霉素、柱晶白霉素）和多烯大環(huán)內(nèi)酯類（制霉菌素

5、、抗滴蟲霉素等）。酸性、堿性和中性，但以堿性為多。v真菌的曲菌屬產(chǎn)生桔霉素，青霉素菌屬產(chǎn)生青霉素和灰黃霉素等，頭孢菌屬產(chǎn)生頭孢霉素等。脂環(huán)芳香類或簡單的氧雜環(huán)類，多為酸性化合物。 3發(fā)酵制藥的基本過程 菌種選育發(fā)酵工段提煉工段成品工段孢子制備種子制備發(fā)酵控制預(yù)處理分離提取濃縮純化成品工段包裝原料藥實驗室、種子庫發(fā)酵車間提煉車間包裝車間2.2 微生物的生長特征微生物發(fā)酵基本過程特征（批式）菌體生長與產(chǎn)物生成的特征，三個階段v發(fā)酵前期(fermentation prophase)v菌體生長期（cellv發(fā)酵中期(fermentation metaphase)v產(chǎn)物合成（生產(chǎn)）期(product s

6、ynthesis phase) growth phase）v發(fā)酵后期(fermentation anaphase)v菌體自溶期(cell autolysis phase)發(fā)酵前期特征v從接種至菌體達(dá)到一定臨界濃度的時間，包括延滯期、對數(shù)生長期和減速期。v代謝特征：碳源、氮源等基質(zhì)不斷消耗，減少v生長特征：菌體不斷地生長和繁殖，生物量增加。v溶氧變化：不斷下降，菌體臨界值時，濃度最低。vpH變化：先升后降先氨基酸作為碳源，釋放出氨，而后氨被利用。先降后升先用糖作為碳源，釋放出丙酮酸等有機酸，后又被利用。幾個概念v1 延遲期延滯期（lag phase）或適應(yīng)期是指接種后，菌體的生物量沒有明顯增加的

7、一段時間。延遲期是菌體適應(yīng)環(huán)境的過程。延遲期時間長短不一，與遺傳和環(huán)境因素有關(guān)，由菌體與環(huán)境相互作用的程度決定的。因不同接種量、不同菌種和菌齡等而表現(xiàn)不同。工業(yè)上希望延遲期越短越好，常采用如種子罐與發(fā)酵罐培養(yǎng)基盡量接近，對數(shù)期的菌體作為種子、加大接種量等方法進(jìn)行放大培養(yǎng)和發(fā)酵生產(chǎn)。v2 對數(shù)生長期對數(shù)生長期（log phase）是菌體快速繁殖，生物量的增加呈現(xiàn)對數(shù)速度增長的過程。特點是生長速率達(dá)到最大值，并保持不變。細(xì)胞的化學(xué)組成與生理學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。菌體生長不受限制，細(xì)胞分裂繁殖和代謝極其旺盛?？梢哉J(rèn)為細(xì)胞組分恒定，菌體細(xì)胞的生長速率與生物量是一級動力學(xué)關(guān)系v3 減速期減速期(decline p

8、hase)是指菌體生長速率下降的一段時間。由培養(yǎng)基中基質(zhì)濃度下降，有害物質(zhì)積累等不利因素引起。在減速期內(nèi)，生長速率與菌體濃度仍符合一級動力學(xué)關(guān)系，但受基質(zhì)濃度限制。一般生物的減速期較短。發(fā)酵中期特征v以次級代謝產(chǎn)物或目標(biāo)產(chǎn)物的生物合成為主的一段時間。v菌體生長恒定就進(jìn)入產(chǎn)物合成階段v呼吸強度：無明顯變化，不增加菌體數(shù)目v產(chǎn)物量：逐漸增加，生產(chǎn)速率加快，直至最大高峰，隨后合成能力衰退。v對外界變化敏感：容易影響代謝過程，從而影響整個發(fā)酵進(jìn)程。發(fā)酵后期特征v菌體衰老，細(xì)胞開始自溶的一段時間v合成產(chǎn)物能力衰退，生產(chǎn)速率減慢。v氨基氮含有增加，pH上升v發(fā)酵必須結(jié)束，否則產(chǎn)物被破壞v菌體自溶給過濾和提

9、取等帶來困難。v自溶作用（autolysis） 自溶作用是細(xì)胞的自我毀滅（cellular self-destruction），速溶酶體將酶釋放出來將自身細(xì)胞降解。在正常情況下，溶酶體的膜是十分穩(wěn)定的，不會對細(xì)胞自身造成傷害。 如果細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷，造成溶酶體破裂，那么細(xì)胞就會在溶酶體酶的作用下被降解，如某些紅細(xì)胞常會有這種情況發(fā)生。 在多細(xì)胞生物的發(fā)育過程中，自溶對于形態(tài)建成具有重要作用。 生長與產(chǎn)物的關(guān)系模型v從菌體生長、能源利用和產(chǎn)物生成速度的變化及其之間的動力學(xué)關(guān)系出發(fā)，Gaden把發(fā)酵過程分為三種模型。 vI型：菌體生長與產(chǎn)物生成偶聯(lián)型(coupling model)。菌體的生長與產(chǎn)

10、物生成直接關(guān)聯(lián)，生長期與生產(chǎn)期是一致的。產(chǎn)物往往是初級代謝的直接產(chǎn)物，菌體生長、糖的分解代謝、能源利用和產(chǎn)物形成幾乎平行，生長期與生產(chǎn)期是一致的，菌體生長期和產(chǎn)物形成不是分開的。細(xì)胞生長、基質(zhì)消耗、能源利用和產(chǎn)物生成動力學(xué)曲線幾乎平行，變化趨勢同步，都有最大值，出現(xiàn)的時間接近。組成型表達(dá)的基因工程菌的產(chǎn)物生成屬于此類型，蛋白質(zhì)產(chǎn)物是細(xì)胞能量代謝的結(jié)果。乳酸、醋酸等初級分解代謝產(chǎn)物的生成也屬于此類型。所以產(chǎn)物生成速率和比速率分別為：vII型：菌體生長與產(chǎn)物生成半偶聯(lián)型（semi-coupling model）。該模型介于偶聯(lián)和非偶聯(lián)模型之間，產(chǎn)物生成與基質(zhì)消耗、能量利用之間存在間接關(guān)系。產(chǎn)物來自

11、能量代謝所用的基質(zhì)，但是在次級代謝與初級代謝分開的。在細(xì)胞生長期內(nèi)，基本無產(chǎn)物生成，在生長的中后期生成大量的產(chǎn)物而進(jìn)入產(chǎn)物形成期。分批發(fā)酵出現(xiàn)兩個高峰，先是基質(zhì)消耗和菌體生長的高峰，然后是產(chǎn)物形成的高峰。如檸檬酸和某些氨基酸的發(fā)酵，一部分組成型表達(dá)的蛋白質(zhì)藥物也屬于此類型。產(chǎn)物生成速率和比速率分別為： ； vIII型：菌體生長與產(chǎn)物生成非偶聯(lián)型（non-coupling model）。菌體生長期與產(chǎn)物生成期為獨立的兩個階段，先形成物質(zhì)消耗和菌體生長高峰，幾乎沒有或很少有產(chǎn)物生成，然后進(jìn)入菌體生長靜止期，產(chǎn)物大量生成，并出現(xiàn)產(chǎn)物高峰。產(chǎn)物可能來自于中間代謝途徑，而不是分解代謝過程，物質(zhì)消耗和菌體

12、生長之后，菌體利用中間代謝途徑，初級代謝與產(chǎn)物形成是完全分開的，如抗生素、生物堿、微生物毒素的發(fā)酵。對于誘導(dǎo)型基因工程菌，往往在靜止期，加入誘導(dǎo)物，基因轉(zhuǎn)錄和產(chǎn)物表達(dá)，所以產(chǎn)物生成速率和比速率分別為：代謝產(chǎn)物的生物合成 v代謝（metabolism）是生物體內(nèi)進(jìn)行的生理生化反應(yīng)的統(tǒng)稱。代謝分為分解代謝(catabolism)和合成代謝(anabolism)，前者是指把大分子降解為小分子的過程，為合成代謝提供能量和原料；而后者是指把小分子合成為復(fù)雜大分子的過程，滿足細(xì)胞生長和分化的需要。初級代謝是營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)和對細(xì)胞具有生理活性作用的物質(zhì)，為細(xì)胞提供能量、合成中間體及其生物大分子的

13、代謝網(wǎng)絡(luò)。在初級代謝過程中形成的產(chǎn)物為初級代謝產(chǎn)物（primary metabolite），包括各種小分子前體、單體和多糖、蛋白質(zhì)、脂肪、核酸等。幾乎所有生物的初級代謝基本相同。次級代謝存在于某些生物中，并在一定時期表達(dá)。次級代謝對正常的生長可能不必要，但對抵抗逆境、分解毒素、生殖等具有重要意義。 次級代謝產(chǎn)物生物合成的基本特征 v（1）次級代謝產(chǎn)物種類繁多，結(jié)構(gòu)特殊，含有不常見的化合物和化學(xué)鍵。如氨基糖、苯醌、香豆素、環(huán)氧化合物、生物堿、內(nèi)酯、核苷、雜環(huán)等基團(tuán)，聚乙烯不飽和鍵、大環(huán)、環(huán)肽等鍵。 v（2）具有種屬特異性，與種屬分類學(xué)無關(guān)。分類學(xué)上相同的菌種能產(chǎn)生不同結(jié)構(gòu)的抗生素，如灰色鏈霉菌既

14、可以產(chǎn)生氨基環(huán)醇類抗生素，又可以產(chǎn)生大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。分類學(xué)上不同的菌種能產(chǎn)生相同結(jié)構(gòu)的抗生素，如霉菌和鏈霉菌均可產(chǎn)生頭孢菌素C。一種微生物的不同菌株產(chǎn)生結(jié)構(gòu)不同的多種次級代謝物，而同一菌株會產(chǎn)生一組結(jié)構(gòu)類似的化合物。 v（3）生長期轉(zhuǎn)向生產(chǎn)期，形態(tài)與生理發(fā)生變化。次級代謝產(chǎn)物是在細(xì)胞生長后期開始形成，當(dāng)生長受限制時被啟動。完成菌體營養(yǎng)生長期（trophophase）之后，出現(xiàn)次級代謝物合成期（idiophase），其生物合成比生長對環(huán)境更敏感，要求更高。次級代謝產(chǎn)物是以初級代謝產(chǎn)物為前體，受到初級代謝的調(diào)節(jié)?？赡苁侨狈δ撤N營養(yǎng)成分，菌體生長抑制，啟動了次級代謝物合成。菌體內(nèi)中間代謝物積累，抑

15、制了初級代謝酶，使之消失或活性下降，誘導(dǎo)了新酶的出現(xiàn)，轉(zhuǎn)入生產(chǎn)期。芽孢桿菌形成芽孢，放線菌和真菌形成孢子，抗生素合成可能是細(xì)胞分化的伴隨現(xiàn)象。 v（4）次級代謝產(chǎn)物是結(jié)構(gòu)相似的一組混合物，但活性差異較大。參與反應(yīng)的酶的底物特異性不強。產(chǎn)生菌利用一種或兩種以上的初級代謝產(chǎn)物合成一種主要的次級代謝產(chǎn)物，并繼續(xù)對該產(chǎn)物進(jìn)行修飾生成多種衍生物。一種次級代謝產(chǎn)物可由兩種或兩種以上代謝途徑合成。 v（5）次級代謝產(chǎn)物的合成受多基因控制。往往以基因簇形式存在。除染色體外，還有細(xì)胞質(zhì)遺傳物質(zhì)，可能存在于質(zhì)粒、線粒體基因。遺傳物質(zhì)的變異和丟失是導(dǎo)致菌種退化和生產(chǎn)不穩(wěn)定的重要因素，所以具有代謝不穩(wěn)定性。次級代謝產(chǎn)

16、物的構(gòu)建單位 v微生物合成的次級代謝產(chǎn)物是由微生物代謝產(chǎn)生的一些中間產(chǎn)物，如由碳水化合物降解生成的五碳（C5）、四碳（C4）、三碳（C3）、二碳（C2）化合物和初級代謝產(chǎn)物合成。把構(gòu)成次級代謝產(chǎn)物的基本結(jié)構(gòu)單位稱為生源（biogen）。生源直接或間接來源于次級代謝過程的中間產(chǎn)物或初級代謝產(chǎn)物。構(gòu)建單位包括聚酮體、甲羥戊酸、糖類、不常見的氨基酸（如D氨基酸、氨基酸等）、環(huán)多醇和氨基環(huán)多醇等。次級代謝產(chǎn)物的生物合成的基本過程v次級代謝產(chǎn)物的合成基本過程包括構(gòu)建單位的聚合再修飾裝配。在此過程中，次級代謝產(chǎn)物的累積受合成途徑中某些酶活性的限制，這些關(guān)鍵酶活性大小與產(chǎn)量正相關(guān)。 （1）前體聚合v微生物合

17、成生源后，通過縮合反應(yīng)形成聚酮體、寡肽、聚乙烯等。各種聚酮體的合成過程相似，只是起始單位和延長單位不同。聚酮體是26個二碳單位的聚合反應(yīng)的結(jié)果，酮基被保留，或只是還原為羥基。聚酮體可直接形成環(huán)，如四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類。進(jìn)而被修飾，與相應(yīng)基團(tuán)如氨基糖、糖胺等結(jié)合，形成結(jié)構(gòu)和生理活性不同的化合物。乙酰CoA羧化形成丙二酰CoA，再與8個丙二酰單位縮合形成9酮化合物，再轉(zhuǎn)化為中間體三環(huán)化合物。甲基化、還原、脫水、加氫、氧化形成4氧脫水四環(huán)素，加氯形成4氧脫水氯四環(huán)素，轉(zhuǎn)氨形成4氨基脫水氯四環(huán)素，再甲基化形成脫水氯四環(huán)素，脫氫氯四環(huán)素，最后形成氯四環(huán)素。大環(huán)內(nèi)酯是24碳單位縮合而成。氨基酸的聚合有三種

18、形式：氨基酸活化成磷酸酯，再被酶催化縮合，如谷胱甘肽；蛋白質(zhì)的核糖體模板合成途徑；多酶復(fù)合物將氨基酸活化后，按硫模板或非核糖體機理縮合，形成肽鏈。氨基酸與ATP反應(yīng)，在羧基上形成腺苷單磷酸酯被激活。氨基酸被轉(zhuǎn)移到酶的巰基上，形成硫酯鍵。硫酯鍵斷裂，提高能量，使2個氨基酸之間形成肽鍵（羧基與氨基結(jié)合）。依次，形成多肽鏈。如短桿菌肽S是由2條5肽首尾連接而成。 （2）結(jié)構(gòu)修飾 v包括糖基化、?；?、甲基化、羥基化、氨基化、氧化還原等，使抗生素產(chǎn)生了共存的系列類似物。在聚酮體鏈延長的過程中，伴隨許多基團(tuán)的化學(xué)修飾，如引入氧、氯原子、甲基等，再以糖苷鍵與糖類物質(zhì)連接，酰胺鍵與氨基酸連接，形成各種抗生素

19、。如四環(huán)素類，先形成聚酮體，在C7位發(fā)生氯化則是金霉素，在C5位上先氧化后還原則是土霉素。 （3）裝配 v合成各個組分后，需要按一定順序在特異酶作用下組裝，才能形成有活性的藥物。 2.3 制藥微生物菌種的建立v發(fā)酵生產(chǎn)藥物，需產(chǎn)量高的菌種，自然界中的菌種趨向于快速生長和繁殖，而發(fā)酵工業(yè)需要大量積累產(chǎn)物，因此菌種選育很重要。常規(guī)方法是利用天然變異，從中選擇優(yōu)良株系。隨后物理因子（紫外線、X射線、中子、激光等）和化學(xué)因子（烷化劑、堿基類似物等）和生物因子（噬菌體、抗生素）誘變育種。20世紀(jì)80年代，以原生質(zhì)體融合的雜交育種和基因工程育種，90年代以后，可以用基因組shuffling育種。新藥生產(chǎn)菌

20、的選育 v自然分離 v自然選育 v誘變育種 v雜交育種 v基因工程技術(shù)育種 微生物藥物與菌種的篩選流程v樣品采集 微生物分離 培養(yǎng)v 篩選方法學(xué)建立 篩選鑒定前藥新化合物 化合物分離純化 陽性結(jié)果 v 生產(chǎn)出發(fā)菌 菌種鑒定與保藏 v 新化合物新藥研究與開發(fā)1、生產(chǎn)菌的自然分離(1)v來源：大大土土、海水體v樣品的采集：80%表層土土（010cm），、海（0100m）v處理：根分離目的和微生物的特性，用物理和化學(xué)的方法處理。（1）溫度；高溫可得到放線菌。（2）SDS酵母膏，CaCO3、NaOH處理，減少細(xì)菌，有利于放線菌分離；乙酸乙酯、氯仿、苯處理，除去真菌。 （3）離心、膜過濾1、生產(chǎn)菌的自然

21、分離(2)v培養(yǎng)基：選擇適宜的培養(yǎng)基，營養(yǎng)和pH；添加抑制劑。v分離方法：（1）稀釋法：無菌水，生理鹽水，緩沖液（2）濾膜法：0.22 0.45 m。細(xì)菌在膜上，放線菌菌絲可穿透，進(jìn)入培養(yǎng)基。v培養(yǎng)條件：溫度。放線菌：2530，3237，714天至1月；4550，12d 。藥物的篩選v瓊脂擴散法活性測定：非致病菌為對象，耐藥細(xì)菌和厭氧菌的抗生素，篩選生物活性物質(zhì)。HPLC、LCMS等，分析鑒定活性物質(zhì)。v向篩選v高通量篩選v高內(nèi)內(nèi)篩選 從臨床有效的抗生素的作用機理和細(xì)菌的耐藥機理來設(shè)計篩選模型，有目的的篩選具有某種作用機理的抗生素。v高通量篩選是指以分子水平和細(xì)胞水平的實驗方法為基礎(chǔ)，以微板形

22、式作為實驗工具載體，以自動化操作系統(tǒng)執(zhí)行試驗過程，以靈敏快速的檢測儀器采集實驗結(jié)果數(shù)根，以計算機對實驗數(shù)根進(jìn)行分析處理，同一時間對數(shù)以千萬樣品檢測，并以相應(yīng)的數(shù)根庫支持整體系運轉(zhuǎn)的技術(shù)體系。 v所謂高內(nèi)內(nèi)篩選是指在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整性的前提下，同時檢測被篩樣品對細(xì)胞形態(tài)、生長、分化、遷移、凋亡、代謝途徑及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)各個環(huán)節(jié)的影響，在單一實驗中獲取大量相關(guān)信息，確定其生物活性和潛在毒性。從技術(shù)層面而言，高內(nèi)內(nèi)篩選是一種應(yīng)用高分辨率的熒光數(shù)碼影像系統(tǒng)，在細(xì)胞水平上檢測多個指標(biāo)的多元化、功能性篩選技術(shù)，旨在獲得被篩樣品對細(xì)胞產(chǎn)生的多維立體和實時快速的生物效應(yīng)信息。高內(nèi)內(nèi)篩選技術(shù)的檢測范圍包括：點激

23、活、細(xì)胞凋亡、分裂指數(shù)、蛋白轉(zhuǎn)位、細(xì)胞活力、細(xì)胞遷移、受體內(nèi)化、細(xì)胞毒性、細(xì)胞周期和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。2、菌種選育自然選育（1）定義：不經(jīng)過人工誘變處理，：根菌種的自然突變而進(jìn)行的菌種篩選過程。v應(yīng)用：（1）菌種的提純復(fù)壯。（2）防止退化，穩(wěn)定生產(chǎn)水平。1年1次。v過程v菌種 單孢子 平板分離 單菌落測活 優(yōu)良菌株v效率低, 增產(chǎn)幅度小2、菌種選育誘變育種（2）v定義：人為創(chuàng)造條件（誘變劑處理），使菌種發(fā)生變異，篩選優(yōu)良個體，淘汰劣質(zhì)個體。v物理類：紫外線，快中子，激光，太空射線。v化學(xué)類：堿基類似物，嵌合劑，亞硝酸。v生物類：噬菌體，轉(zhuǎn)座子。v特點：快速，簡單，效益大。v缺點：無定向性。誘變育種流

24、程v出發(fā)菌種 單孢子懸液 誘變處理 v高產(chǎn)菌株 單菌落初篩 稀釋涂板v復(fù)篩 穩(wěn)定性特性 中試放大 投入生產(chǎn)2、菌種選育雜交育種（3）v概念：兩個不同基因型的菌株，通過結(jié)合或原生質(zhì)體融合，使遺傳物質(zhì)發(fā)生重新組合，從中分離篩選出具有優(yōu)良性狀的新菌株。v特點：有一定的定向性。v種類：v準(zhǔn)性生殖v接合v原生質(zhì)體融合（1）準(zhǔn)性生殖育種v概念：準(zhǔn)性生殖v范圍：放線菌，半半菌菌的真菌v過程v兩條菌絲 相互結(jié)合 異核體 二倍體 重組單倍體 v產(chǎn)黃青霉：提高青霉素產(chǎn)量 對氟苯丙氨酸v灰黃鏈霉菌：灰黃霉素產(chǎn)量v v準(zhǔn)性生殖是指異核體（單個生物個體中含有兩種或兩種以上基因型）細(xì)胞中兩個遺傳物質(zhì)不同地細(xì)胞核可以結(jié)合成

25、雜合二倍體地細(xì)胞核。這種雜合二倍體的細(xì)胞核在有絲分裂過程中可以發(fā)生染色體和單倍體化,最后形成遺傳物質(zhì)重組的單倍體的過程。也就是不經(jīng)過減數(shù)分裂就能導(dǎo)致基因重組的生殖過程。 （2）接合育種v范圍：細(xì)菌、放線菌v過程：v兩種細(xì)胞混合培養(yǎng) 基因片段進(jìn)入另一細(xì)胞 合子 重組單倍體v雖然有成功報導(dǎo)，但多數(shù)效果不顯著（3）原生質(zhì)體融合育種v概念v通過生物學(xué)、化學(xué)或物理學(xué)的方法，使兩個不同種類的體細(xì)胞融合在一起，從而產(chǎn)生具有兩個親本遺傳性狀的新細(xì)胞.v用去壁酶處理將微生物細(xì)胞壁除去，制成原生質(zhì)體，在高滲條件下，用聚乙二醇（PEG）促進(jìn)原生質(zhì)體發(fā)生融合，再生細(xì)胞壁，從而獲得異核體或重組子，這一技術(shù)叫原生質(zhì)體融合

26、。 3、菌種保藏v原因：菌種經(jīng)過多次傳代，會發(fā)生遺傳變異，導(dǎo)致退化，從而喪失生產(chǎn)能力甚至菌株死亡。v目的：保持菌種原有優(yōu)良特性，延長生命時限，長期存活、不退化。v原理：使菌種代謝處于不活活狀態(tài)，生長繁殖受抑制的休眠狀態(tài)。v措：物理和化學(xué)方法（溫度：低溫；水分：干燥；氧氣：缺氧；營養(yǎng)；缺乏）保藏方法v低溫斜面保藏：低溫降低新陳代謝。4，RH70以下。短期保藏，16個月；易變異v石蠟封存：隔絕氧氣，減少蒸發(fā)。4，約1年。v砂土管保藏：干燥抑制生長。孢子吸附在砂土上，真空抽氣干燥。干燥器于冰箱，數(shù)年。v冷凍干燥保藏：保護(hù)劑降低菌體細(xì)胞冰點，減少冰晶對細(xì)胞傷害。低溫避光，中期保藏，510年。v液氮保藏

27、：培養(yǎng)物與冷凍保護(hù)劑混合，密封。液氮（196）罐或80冰箱。低溫、缺氧、避光和營養(yǎng)缺乏環(huán)境。長期保藏。保藏機構(gòu)中國v中國典型培養(yǎng)物保藏中心:China Center for Type Culture Collection (CCTCC)。v中國國學(xué)學(xué)典型培養(yǎng)物保藏藏委會,下設(shè)9個庫v中國國通微生物菌種保藏管理中心：China General Microbiological Culture Collection Center (CGMCC)，微生物所（真菌和細(xì)菌）；武漢所（病毒）v抗生素菌種保藏管理中心（CACC）：中國醫(yī)學(xué)國學(xué)學(xué)抗生素所，四川抗生素所，華北制藥集團(tuán)抗生素所小結(jié)v生產(chǎn)菌的分離：自

28、然分離與篩選v菌種選育：自然選育、雜交育種、誘變育種v菌種保藏：低溫、干燥；機構(gòu)2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基制備v概念（medium） 供微生物生長繁殖和合成各種代謝產(chǎn)物所需要的按一定比例配制的多種營養(yǎng)物質(zhì)的混合物。v培養(yǎng)基的組成和比例是否否當(dāng)，直接影響微生物的生長、生產(chǎn)和工藝選擇、產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量。2.4.1 培養(yǎng)基的成分v碳源v氮源v無機鹽v水v生長因子前體與促進(jìn)劑v消泡劑1、碳源(carbon sources)v概念：構(gòu)成微生物細(xì)胞和代謝產(chǎn)物中碳素的營養(yǎng)物質(zhì)。v作用：v為正常生理活動和過程提供能量來源，為細(xì)胞物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的合成提供碳骨架。碳源種類v糖類：葡萄糖、淀粉、糊精和糖蜜v脂肪：豆油、棉籽油

29、和豬油v醇類：甘油、乙醇、甘露醇、山梨醇、肌醇v蛋白類：蛋白胨、酵母膏v速效碳源：糖類、有機酸v遲效碳源：酪蛋白水解產(chǎn)生的脂肪酸2、氮源（nitrogen sources）v概念：構(gòu)成微生物細(xì)胞和代謝產(chǎn)物中氮素的營養(yǎng)物質(zhì)。v作用：為生長和代謝主要提供氮素來源。v種類：無機氮源、有機氮源有機氮源v幾乎所有微生物都能利用有機氮源：v黃豆餅粉、花生餅粉、棉籽餅粉、玉米漿、蛋白胨、酵母粉、尿素。無機氮源v氨水、銨鹽和硝酸鹽等。氨鹽比硝酸鹽更快被利用。v工業(yè)應(yīng)用：主要氮源或輔助氮源；調(diào)節(jié)pH值v生理酸性物質(zhì)：代謝后能產(chǎn)生酸性殘留物質(zhì)。 （NH4）2SO4利用后，產(chǎn)生硫酸v生理堿性物質(zhì)：代謝后能產(chǎn)生堿性殘

30、留物質(zhì)。 硝酸鈉利用后，產(chǎn)生氫氧化鈉。3、無機鹽和微量元素v概念：組成生理活性物質(zhì)或具有生理調(diào)節(jié)作用礦物質(zhì)v作用方式：低濃度起促進(jìn)作用，高濃度起抑制作用。v種類：鹽離子磷、硫、鉀、鈉、鎂、鈣，常常添加v鐵、鋅、銅、鉬、鈷、錳、氯，一般不加。4、水v菌體細(xì)胞的主要成分。v營養(yǎng)傳傳的介質(zhì)。v良好導(dǎo)體，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長環(huán)境溫度。v培養(yǎng)基的主要成分之一。5、生長因子（growth factor）v概念：維持微生物生長所必需的微量有機物，不起碳源和氮源作用。v種類：維生素、氨基酸、嘌呤或嘧啶及其衍生物、脂肪酸等。天然成分中含有：一般無需添加。v營養(yǎng)缺陷型菌株：必需添加。6、前體(precursor)v概念：

31、加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中的某些化合物，被直接結(jié)合到目標(biāo)產(chǎn)物分子中，而自身的結(jié)構(gòu)無多大的變化。v使用：v添加前體是提高抗生素產(chǎn)量的重要措。v多次少量、連續(xù)流加的工藝。7、促進(jìn)劑(accelerant)v概念：v促進(jìn)產(chǎn)物生成的物質(zhì)，但不是營養(yǎng)物，也不是前體的一類化合物。v種類：v氯化物有利于灰黃霉素、金霉素合成。v表面活性劑吐溫、清洗劑，脂溶性小分子化合物等，起誘導(dǎo)作用。8、消沫劑（defoamingagent）v概念：降低泡沫的液膜強度和表面黏度，使泡沫破裂的化合物。v種類：表面活性劑，低表面面力。v天然動植物油脂類、高分子化合物（高碳醇脂肪酸和酯類、聚醚類、硅酮類）。v作用：v消除泡沫，防止逃液和染

32、菌。2.4.2 培養(yǎng)基種類及其質(zhì)量控制技術(shù)v培養(yǎng)基的種類v按用途：選擇性、鑒別性、富營養(yǎng)培養(yǎng)基等v按物理性質(zhì)：固體，半固體、液體培養(yǎng)基v按化學(xué)組成：合成、半合成、天然培養(yǎng)基v按發(fā)酵過程中所處位置和作用：斜面或平板固體、種子、發(fā)酵和補料培養(yǎng)基。1、固體培養(yǎng)基v概念：（solid medium）v細(xì)菌和酵母的固體斜面或平板培養(yǎng)基，鏈霉菌和絲狀真菌的孢子培養(yǎng)基。v制備：v液體培養(yǎng)基添加1.0-2.0%瓊脂粉。v作用：v提供菌體的生長繁殖，形成孢子。1、固體培養(yǎng)基要求與質(zhì)量控制v單細(xì)胞培養(yǎng)基：v營養(yǎng)豐富，滿足菌體生長迅速，不能引起變異。v孢子培養(yǎng)基：v基質(zhì)濃度較低，無機鹽濃度適量，以利于孢子形成。營養(yǎng)

33、不宜太豐富，否則不易產(chǎn)生孢子。2、種子培養(yǎng)基v概念：（seed medium）v供孢子發(fā)芽和菌體生長繁殖，搖瓶和種子罐培養(yǎng)基,為液體。v作用：v使種子擴大培養(yǎng)，增加細(xì)胞數(shù)目，生長形成強壯、健康和高活性的種子。2、種子培養(yǎng)基要求與質(zhì)量控制v培養(yǎng)基成分必需完全，營養(yǎng)豐富。v用速效性、容易被利用的碳、氮源和無機鹽等物質(zhì)，但濃度不宜高。v種子培養(yǎng)基要與發(fā)酵培養(yǎng)基相適應(yīng)，主要成分接近，不能差異太大。v縮短發(fā)酵的延滯期。3、發(fā)酵培養(yǎng)基v概念：(fermentation medium)v提供微生物生長、目標(biāo)產(chǎn)物生成的生產(chǎn)用培養(yǎng)基。v作用：v不僅要滿足菌體的生長和繁殖，還要滿足菌體合成目標(biāo)產(chǎn)物，是發(fā)酵生產(chǎn)中最

34、關(guān)鍵和最重要的培養(yǎng)基。3、發(fā)酵培養(yǎng)基要求v營養(yǎng)物質(zhì)濃度和粘度適中。v組成上豐富完整。v不同菌種和不同產(chǎn)物，對培養(yǎng)基的要求差異很大，組成和配方需要優(yōu)化。4、補料培養(yǎng)基(fed medium）v概念：發(fā)酵過程中添加補充的培養(yǎng)基。v作用：穩(wěn)定工藝條件，延長發(fā)酵周期，提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量v組成：各種必要的營養(yǎng)物質(zhì)，碳源、氮源、前體v制備：按單一成分配制，各自獨立控制，或按一定比例制成復(fù)合補料培養(yǎng)基。5、控制發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量v（1）控制水質(zhì)：v恒定水源和恒定的水質(zhì)。v地下深層井水，對水質(zhì)定期化驗檢查，使用符合要求的水質(zhì)配制各種培養(yǎng)基v措：檢測與控制水質(zhì)參數(shù)vpH、溶解氧、可溶性固體、污染程度、各種礦物，特別是

35、重金屬的種類和含量。（2）控制培養(yǎng)基原料的質(zhì)量：來源與種類的選擇農(nóng)副產(chǎn)品：因品種、產(chǎn)地、加工、貯存條件不同而質(zhì)量差異較大?；瘜W(xué)原料：雜質(zhì)含量也不相同。措：保持穩(wěn)定的原料來源。更換原料時，必需再進(jìn)行一系列試驗，確保產(chǎn)量和質(zhì)量的控制和穩(wěn)定性。原料的選擇試驗：v不同碳源、氮源對菌種生長的能力和產(chǎn)物的生產(chǎn)能力很不相同。v對原料進(jìn)行試驗，選擇滿足發(fā)酵要求的來源。v注意：v碳氮濃度與配比：適宜v速效和緩效成分相互配合，發(fā)揮綜合優(yōu)勢vpH：配制時加入酸堿性物質(zhì)搭配，甚至使用緩沖劑。（3）控制培養(yǎng)基的黏度：v對發(fā)酵的影響：v高黏度的培養(yǎng)基，不易徹底滅菌v影響發(fā)酵的通氣攪拌等物理過程v直接影響菌體對營養(yǎng)的利用v

36、目標(biāo)產(chǎn)物的分離提取造成困難v措：固體不溶性成分，淀粉、黃豆粉等增加培養(yǎng)基的黏度，酶水解，降低大分子物質(zhì)（4）控制滅菌操作： 高壓蒸氣滅菌影響培養(yǎng)基的有效成分甚至是活性。v較高溫度下長時間滅菌，營養(yǎng)成分會破壞，甚至產(chǎn)生有毒物質(zhì)。v磷酸鹽與碳酸鈣、鎂鹽、銨鹽也能反應(yīng)，生成沉淀或絡(luò)合物，降低利用度。v維生素等不耐高溫分解破壞、失活。2.4.3 制藥生產(chǎn)用培養(yǎng)基的配制v一般設(shè)計原則v設(shè)計思路v計算與定量配制v優(yōu)化1、培養(yǎng)基設(shè)計一般原則v生物學(xué)原則：根不同微生物營養(yǎng)和反應(yīng)需求設(shè)計。營養(yǎng)物質(zhì)組成：較豐富，濃度適當(dāng)。成分之間比例：否當(dāng)，C/N比適宜。原料之間：不能產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)。適宜的pH和滲透壓v工藝原則：

37、不影響通氣攪拌、分離精制和廢物處理，過程容易控制。v低成本原則：原料來源方便，質(zhì)量穩(wěn)定，質(zhì)優(yōu)價廉。v高效經(jīng)濟(jì)原則：滿足菌體生長和合成產(chǎn)物的需求，最高得率，最小副產(chǎn)物。2、培養(yǎng)基設(shè)計基本思路 起始培養(yǎng)基：根他人的經(jīng)驗和使用。v單因素實驗：確定最適宜的培養(yǎng)基成分。v多因素實驗：各成分之間最佳配比和濃度優(yōu)化。v中試放大試驗：搖瓶、小型發(fā)酵罐，到中試，最后放大到生產(chǎn)罐。v綜合考慮各種因素，產(chǎn)量、純度、成本等后，確定一個適宜的生產(chǎn)配方。3、理論計算與定量配制微生物生長和生產(chǎn)可用下列表達(dá)式表示：碳源和能源氮源其他營養(yǎng)物質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)物CO2H2O熱量v單位細(xì)胞生物量所需最小的營養(yǎng)物質(zhì):v單位產(chǎn)量的最小底物濃度:

38、碳源和氮源進(jìn)行轉(zhuǎn)化率計算和分析v初步計算：參考微生物的化學(xué)和元素組成。v轉(zhuǎn)化率：單位質(zhì)量原料生產(chǎn)的產(chǎn)物量或細(xì)胞量。v理論轉(zhuǎn)化率：根代謝途徑的物料衡算v實際轉(zhuǎn)化率：發(fā)酵過程中實際測量數(shù)值計算。v目標(biāo)：使實際轉(zhuǎn)化率靠近理論轉(zhuǎn)化率。2.5 滅菌工藝v滅菌方法與原理v培養(yǎng)基滅菌工藝v空氣除菌工藝幾個概念v雜菌：除生產(chǎn)菌以外的任何微生物。v污染：感染雜菌的培養(yǎng)或發(fā)酵體系。v消毒：殺滅或清除病原微生物，達(dá)到無害化程度，殺滅率99.9%以上。v殺菌：殺滅或清除一切微生物，達(dá)到無活微生物存在的過程，殺滅率99.9999%以上。v滅菌：微生物殺滅率99.999999%以上。2.5.1 滅菌方法與原理v1、化學(xué)滅

39、菌v2、物理滅菌1、化學(xué)滅菌v用化學(xué)物質(zhì)殺滅微生物的滅菌操作。v化學(xué)滅菌劑：v氧化劑類等，鹵化物類，有機化合物等。v機理：蛋白質(zhì)變性，酶失活，破壞細(xì)胞膜透性，細(xì)胞死亡。v應(yīng)用：皮膚表面、器具、實驗室和工廠的無菌區(qū)域的臺面、地面、墻壁及空間的滅菌。2、物理滅菌v各種物理條件如高溫、輻射、超聲波及過濾等進(jìn)行滅菌v紫外線等射線：局部空間v干熱滅菌：實驗室器皿v蒸汽滅菌：培養(yǎng)基v效果好，操作方便，廣泛使用。3 干熱滅菌 v在高溫120以上，蛋白質(zhì)、酶、核酸、生物膜等生物大分子變性、凝聚破壞，甚至是降解，生物細(xì)胞破裂，內(nèi)容物釋放，生物體死亡。對于干熱滅菌，足夠長的時間和足夠高的溫度，都可以殺滅生物體。干

40、熱滅菌效果沒有濕熱滅菌好，是實驗室常用的器皿的方法。工業(yè)采用160、2h，或170、1h干熱空氣，用于需保持干燥的器械、容器的滅菌。溫度越高，時間相應(yīng)縮短。4 蒸汽滅菌v濕熱滅菌效果優(yōu)于干熱滅菌，原因在于濕熱狀態(tài)下，穿透力強，蒸汽冷凝時釋放出大量能量，使蛋白質(zhì)、核酸等內(nèi)部的化學(xué)鍵破壞、降解，導(dǎo)致生物體死亡。一般在115140，保持一段時間，可以殺死各種生物體。由于蒸汽價格低廉，來源方便，效果可靠，操作控制簡便，因此濕熱滅菌常用于培養(yǎng)基和設(shè)備容器的滅菌。常用條件為115121，壓力1105Pa，維持1530分鐘。芽孢是一種休眠體，外面有厚膜包裹，耐熱性很強，不易殺滅。因此在設(shè)計滅菌操作時，經(jīng)常以

41、殺死芽孢的溫度和時間為指標(biāo)。為了確保徹底滅菌，實際操作中往往增加50的保險系數(shù)。2.5.2 培養(yǎng)基滅菌v1、微生物高溫死亡動力學(xué)與滅菌的關(guān)系v微生物受熱死亡過程的一級動力學(xué)反應(yīng)：vdX/dt= kdXv微生物濃度與滅菌時間成正比，濃度越高，滅菌時間越長。v以殺死芽孢的溫度和時間為指標(biāo)。v確保徹底滅菌，實際操作中增加50的保險系數(shù)。2、培養(yǎng)基滅菌的操作方式v(1)分批滅菌操作，間歇滅菌,實罐滅菌：v配制好培養(yǎng)基輸入發(fā)酵罐內(nèi)，直接蒸汽加熱，達(dá)到滅菌要求的溫度和壓力后維持一段時間，再冷卻至發(fā)酵要求的溫度。v特點：不需其他的附屬設(shè)備，操作簡便，手動。v缺點：加熱和冷卻時間較長。營養(yǎng)成分損失較多，罐利用

42、率低。適合小批量生產(chǎn)規(guī)模。分批操作的滅菌過程分批滅菌的操作過程v通入蒸汽：空氣管、夾套通入蒸汽。v加熱升溫：70，取樣管、放料管通入蒸汽。v維持保溫：120，罐壓0.1MPa，排氣。調(diào)節(jié)進(jìn)汽和排氣量，維持30min。v冷卻降溫：依次關(guān)閉排氣、進(jìn)汽閥。罐壓低于空氣壓力后，通入無菌空氣，夾套通入冷卻水降溫。（2）連續(xù)滅菌操作v高溫短時滅菌操作，連續(xù)：v培養(yǎng)基在發(fā)酵罐外經(jīng)過一套滅菌設(shè)備連續(xù)的加熱滅菌，冷卻后送入已滅菌的發(fā)酵罐內(nèi)的工藝過程。v加熱升溫、維持滅菌溫度和冷卻降溫三個階段由不同的設(shè)備執(zhí)行：加熱器，保溫設(shè)備，冷卻器。（2）連續(xù)滅菌操作流程圖培養(yǎng)基與高壓蒸汽直接混勻，達(dá)到滅菌溫度（130140）

43、（2）連續(xù)滅菌操作過程v配料：配料罐，配制培養(yǎng)基。v預(yù)熱罐：定容和預(yù)加熱。7090。v加熱器：培養(yǎng)基與蒸汽混合，快速升到130140。v維持罐：維持滅菌時間,57分鐘。v冷卻管：培養(yǎng)基經(jīng)過冷卻水管冷卻。4050。v輸入滅菌的發(fā)酵罐中。連續(xù)滅菌的特點1）高溫快速滅菌工藝，營養(yǎng)成分破壞的少2）熱能利用合理，易于自動化控制；3）不適合粘度大或固形物含量高的培養(yǎng)基滅菌；4）增加了連續(xù)滅菌設(shè)備及操作環(huán)節(jié)，增加染菌幾率。5）對壓力要求高，一般為0.45-0.8 MPa。2.5.3 空氣除菌操作工藝v1、發(fā)酵對空氣的要求v好氧微生物需要氧氣供應(yīng)，通入空氣。v連續(xù)一定流量的壓縮無菌空氣。v壓強：0.2-0.4

44、 MPa。v空氣質(zhì)量：相對濕度小于70；比培養(yǎng)溫度高1030；潔凈度100級。2、工業(yè)制備大量空氣的方法v加熱滅菌：空氣在進(jìn)入培養(yǎng)系統(tǒng)之前，一般需用空壓機以提高壓力，所以空氣熱滅菌時所需溫度的提高，可直接利用空氣壓縮時的溫度升高來實現(xiàn) .v靜電除菌：靜電除塵是利用靜電引力來吸附帶電離子而達(dá)到除塵滅菌的目的。懸浮于空氣中的微生物、微生物孢子大多數(shù)帶有不同的電荷，沒有電荷的微粒進(jìn)入高壓靜電場時則會被電離成帶電微粒，但對于一些直徑很小的微粒，它所帶的電荷很小，當(dāng)產(chǎn)生的引力等于或小于氣流對微粒的拖帶力或微粒布朗運動的動量時，微粒就不能被吸附而沉降，所以靜電除塵對很小的微粒效率較低。v介質(zhì)過濾：是使空氣

45、通過經(jīng)高溫滅菌的介質(zhì)過濾層，將空氣中的微生物等顆粒阻截在介質(zhì)層中，而達(dá)到除菌的目的。3、空氣除菌原理空氣中附著在塵埃上的微生物大小為0.5-5um。 是依靠氣流通過濾層時，基于濾層纖維的層層阻礙，迫使空氣在流動過程中出現(xiàn)無數(shù)次改變氣速大小和方向的繞流運動，從而導(dǎo)致微生物微粒與濾層纖維間產(chǎn)生撞擊、攔截、布朗擴散、重力及靜電引力等作用，從而把微生物微粒截留、捕集在纖維表面上，實現(xiàn)了過濾。 v當(dāng)微粒隨氣流以一定的速度垂直向纖維方向運動時，空氣受阻，改變運當(dāng)微粒隨氣流以一定的速度垂直向纖維方向運動時，空氣受阻，改變運動方向，繞過纖維前進(jìn)，而微粒由于它的運動慣性較大，未能及時改變動方向，繞過纖維前進(jìn)，而

46、微粒由于它的運動慣性較大，未能及時改變運動方向隨主導(dǎo)氣流前進(jìn)，于是微粒直沖到纖維的表面，由于磨擦粘附，運動方向隨主導(dǎo)氣流前進(jìn)，于是微粒直沖到纖維的表面，由于磨擦粘附，微粒就滯留在纖維表面上。微粒就滯留在纖維表面上。 當(dāng)氣流速度下降到一定值時，若微粒當(dāng)氣流速度下降到一定值時，若微粒 隨氣流慢慢靠近纖維時，受纖維所阻改變隨氣流慢慢靠近纖維時，受纖維所阻改變 方向，繞過纖維前進(jìn)，并在纖維的周邊形方向，繞過纖維前進(jìn)，并在纖維的周邊形 成一層邊界滯留區(qū)，滯留區(qū)的氣流流速更成一層邊界滯留區(qū)，滯留區(qū)的氣流流速更 慢，當(dāng)與纖維表面接觸時就被捕集。慢，當(dāng)與纖維表面接觸時就被捕集。 （）、布朗擴散作用機理（）、布

47、朗擴散作用機理 直徑很小的微粒在很慢的氣流中能直徑很小的微粒在很慢的氣流中能產(chǎn)生一種不規(guī)則的直線運動，稱為布朗產(chǎn)生一種不規(guī)則的直線運動，稱為布朗擴散。擴散。 v重力沉降是一個穩(wěn)定的分離作用，當(dāng)微重力沉降是一個穩(wěn)定的分離作用，當(dāng)微粒所受的重力大于氣流對它的拖帶力時，粒所受的重力大于氣流對它的拖帶力時，微粒就容易沉降。微粒就容易沉降。 懸浮在空氣中的微粒大多帶有不同電懸浮在空氣中的微粒大多帶有不同電荷，這些帶電的微粒會受帶異性電荷的荷，這些帶電的微粒會受帶異性電荷的物體所吸引而沉降。物體所吸引而沉降。 當(dāng)空氣流過介質(zhì)時，上述當(dāng)空氣流過介質(zhì)時，上述五種除菌機理同時起作用，五種除菌機理同時起作用，不過

48、氣流速度不同，起主不過氣流速度不同，起主要作用的機理也就不同。要作用的機理也就不同。當(dāng)氣流速度較大時，除菌當(dāng)氣流速度較大時，除菌效率隨空氣流速的增加而效率隨空氣流速的增加而增加，此時慣性沖擊起主增加，此時慣性沖擊起主要作用；當(dāng)氣流速度較小要作用；當(dāng)氣流速度較小時，除菌效率隨氣流速度時，除菌效率隨氣流速度的增加而降低，此時擴散的增加而降低，此時擴散起主要作用；當(dāng)氣流速度起主要作用；當(dāng)氣流速度中等時，可能是截留起主中等時，可能是截留起主要作用。如果空氣流速過要作用。如果空氣流速過大，除菌效率又下降，則大，除菌效率又下降，則是由于已被捕集的微粒又是由于已被捕集的微粒又被湍動的氣流夾帶返回到被湍動的氣

49、流夾帶返回到空氣中?？諝庵?。 圖4-15 過濾除菌效率（ ）與氣速（vs)的關(guān)系/ %慣性沖擊機理vs / (m/s)擴散機理噬菌體攔截機理0重新污染除菌效率除菌效率影響深層過濾效率的因素影響深層過濾效率的因素 v微粒大小、過濾介質(zhì)的種類、規(guī)格、介微粒大小、過濾介質(zhì)的種類、規(guī)格、介質(zhì)的填充密度、過濾介質(zhì)層厚度以及所質(zhì)的填充密度、過濾介質(zhì)層厚度以及所通過的空氣氣流速度等。通過的空氣氣流速度等。4、空氣過濾介質(zhì)膜過濾介質(zhì)：孔徑小于被截留微生物體積硝酸纖維酯、聚四氟乙烯、聚砜、尼龍膜，四氟乙烯、纖維素樹脂微孔濾膜。0.1-0.5umv深層過濾介質(zhì)：空空大于被截留微生物體積。纖維狀或顆粒狀：棉花(50

50、um)、玻璃纖維、活性炭過濾紙：超細(xì)玻璃纖維紙(1-1.5um)v金屬燒結(jié)管：單：或幾十：甚至上百：金屬微孔濾管安裝在過濾器內(nèi)。5、空氣滅菌工藝過程一一. .概述：概述： 提高壓縮前空氣的潔凈度的主要措：提高壓縮前空氣的潔凈度的主要措： 提高空氣吸氣口的位置和加強吸入空提高空氣吸氣口的位置和加強吸入空氣的前過濾。氣的前過濾。 一、空氣預(yù)處理設(shè)備一、空氣預(yù)處理設(shè)備 1 1粗過濾器粗過濾器 v 安裝在空氣壓縮機前的粗過濾器，其主要作用：捕安裝在空氣壓縮機前的粗過濾器，其主要作用：捕集較大的灰塵顆粒，防止壓縮機受損，同時也可減輕集較大的灰塵顆粒，防止壓縮機受損，同時也可減輕總過濾器負(fù)荷?？傔^濾器負(fù)荷

51、。v 粗過濾器一般要求過濾效率高，阻力小，否則會粗過濾器一般要求過濾效率高，阻力小，否則會增加空氣壓縮機的吸入負(fù)荷和降低空氣壓縮機的排氣增加空氣壓縮機的吸入負(fù)荷和降低空氣壓縮機的排氣量。量。v 常用的粗過濾器有：布袋過濾、填料式過濾、油浴常用的粗過濾器有：布袋過濾、填料式過濾、油浴洗滌和水霧除塵等。洗滌和水霧除塵等。 振動機構(gòu)含塵氣流圖4-7 機械振動袋式除塵器濾袋凈氣121-濾網(wǎng) 2-加油斗 3-油鏡 4-油層圖4-8 油浴洗滌裝置空氣出口空氣出口空氣出口圖4-9 水霧除塵裝置空氣入口過濾網(wǎng)高壓水入口 貯氣罐的作用：貯氣罐的作用：（1 1）消除脈動維持罐）消除脈動維持罐壓的穩(wěn)定。壓的穩(wěn)定。（

52、2 2）使部分液滴在罐）使部分液滴在罐內(nèi)沉降。內(nèi)沉降。（3 3）保溫滅菌）保溫滅菌。 出灰口排氣進(jìn)氣圖4-11 旋風(fēng)分離器 v其結(jié)構(gòu)同一級冷卻器相同，由于季節(jié)關(guān)系或其其結(jié)構(gòu)同一級冷卻器相同，由于季節(jié)關(guān)系或其它原因?qū)嚎s空氣的冷卻效果達(dá)不到工藝要求它原因?qū)嚎s空氣的冷卻效果達(dá)不到工藝要求的情況下，可增設(shè)二級冷卻器，再次冷卻。的情況下，可增設(shè)二級冷卻器，再次冷卻。 v通過油水分離器凈化過的空氣，仍通過油水分離器凈化過的空氣，仍含有粒度較小的雜質(zhì)及油水霧滴，含有粒度較小的雜質(zhì)及油水霧滴，需在除霧器中進(jìn)一步除去。除霧器需在除霧器中進(jìn)一步除去。除霧器結(jié)構(gòu)較簡單，為一個中間夾有填料結(jié)構(gòu)較簡單，為一個中間夾

53、有填料瓷環(huán)的容器，油水霧滴遇到填料瓷瓷環(huán)的容器，油水霧滴遇到填料瓷環(huán)便凝聚下來，最后，可通過油水環(huán)便凝聚下來，最后，可通過油水排出口排出。排出口排出。2.6發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)v 選擇合適的培養(yǎng)基；提供適宜的環(huán)境條件v微生物發(fā)酵工藝過程的三個工段：v種子制備v接種v發(fā)酵培養(yǎng)2.6.1 種子制備v種子的制備：v種子的逐級擴大培養(yǎng)過程。v獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。1孢子制備v種子活化：將保存菌種接種在固體培養(yǎng)基上，在適宜條件下培養(yǎng)，恢復(fù)其固有生物特性。v放線菌孢子：采用瓊脂斜面培養(yǎng)基。v霉菌孢子：大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基。v細(xì)菌：采用碳源有限而氮源豐富的配方。2生產(chǎn)種子制備v

54、搖瓶種子制備：母瓶、子瓶。v種子罐種子制備：一級、二級、三級種子。v種子罐級數(shù)：制備種子需逐級擴大培養(yǎng)的次數(shù)v確定種子級數(shù)的因素:v菌種生長特性及菌體繁殖速度：生長快，少v發(fā)酵罐的容積：越大，多v產(chǎn)物的品種及生產(chǎn)規(guī)模：越大，多v所選用工藝條件：有利于生長的工藝，少發(fā)酵類型的定義v一級發(fā)酵：將孢子或菌絲接入直接發(fā)酵罐v二級發(fā)酵：經(jīng)過一級種子罐，再到發(fā)酵罐；谷氨酸生產(chǎn)v三級發(fā)酵：二級種子擴大培養(yǎng)，經(jīng)過二次種子罐，再接入發(fā)酵罐。青霉素生產(chǎn)v四級發(fā)酵：三級種子擴大培養(yǎng)，經(jīng)過三級種子罐，再到發(fā)酵罐。鏈霉素生產(chǎn)菌接種方式v單種法：一個種子罐的種子接種一只發(fā)酵罐。v雙種法：兩個種子罐的種子接種一只發(fā)酵罐。v

55、倒種法：從發(fā)酵罐中取出一定量發(fā)酵液，接種到另一個發(fā)酵罐。2.6.2 培養(yǎng)技術(shù)1、固體表面培養(yǎng)技術(shù)：Solid surface culturev原始，最早采用。v2、液體深層培養(yǎng)：Liquid submerged culturev主要的發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)3、高密度培養(yǎng)（high cell density culture）v概念：菌體濃度（干重）至少達(dá)到50g/L以上的一種理想培養(yǎng)，發(fā)酵工藝目標(biāo)和方向。v優(yōu)點: v縮小發(fā)酵體積v增加表達(dá)量v成本低，生產(chǎn)率高。2.6.3 發(fā)酵培養(yǎng)的操作方式 1、分批式操作；間歇式操作；不連續(xù)操作v2、流加式操作，補料分批式操作v3、半連續(xù)式操作，反復(fù)分批式或換液培養(yǎng)v4、

56、連續(xù)式操作，衡態(tài)操作v5、灌流式操作1、分批式操作v概念：培養(yǎng)液一次性裝入發(fā)酵罐，一次性接種，經(jīng)過一段時間培養(yǎng)，一次性卸出全部培養(yǎng)物。v特點：非衡態(tài)過程發(fā)酵體系的組成（基質(zhì)、產(chǎn)物及細(xì)胞濃度）都隨發(fā)酵時間而變化。v缺點：開始時基質(zhì)濃度很高，到中后期，營養(yǎng)物濃度很低，產(chǎn)物濃度很高，對發(fā)酵不利。v輔助時間：清洗罐，裝料、滅菌，時間長。2、流加式操作v概念：裝入大部分培養(yǎng)液，一次性接種，在培養(yǎng)過程中連續(xù)不斷補充新培養(yǎng)基，但不取出培養(yǎng)液。v特點：v流加能源和碳源物質(zhì)及氨水等。v克服了批式的缺點，使生長和生產(chǎn)保持適宜水平。v缺點：整個發(fā)酵體積不斷增加。3、半連續(xù)式操作v概念：培養(yǎng)液一起裝入發(fā)酵罐，一次性接

57、種。間歇取出部分發(fā)酵培養(yǎng)物（帶放），同時補充同等數(shù)量的新培養(yǎng)基；然后繼續(xù)培養(yǎng)，直至發(fā)酵結(jié)束。v特點：v發(fā)酵罐內(nèi)的培養(yǎng)液總體積保持不變v使生長和生產(chǎn)保持適宜水平。v缺點：喪失部分前體，喪失部分菌體，利于非生產(chǎn)菌突變株的生長4連續(xù)式操作v概念：培養(yǎng)液一起裝入發(fā)酵罐，接種后培養(yǎng)過程中，不斷補充新培養(yǎng)基,同時取出包括培養(yǎng)液和菌體在內(nèi)的發(fā)酵液，直至發(fā)酵結(jié)束。v特點：v恒定狀態(tài)的發(fā)酵，發(fā)酵罐內(nèi)體積及其物系的組成將不隨時間而變。v培養(yǎng)基連續(xù)穩(wěn)定流加；產(chǎn)物連續(xù)穩(wěn)定收獲；提高菌體密度；自動化。v缺點：時間長，雜菌污染、突變機會增多。5、灌流（注）式操作v概念：培養(yǎng)液與菌體一起裝入發(fā)酵罐，菌體培養(yǎng)過程中，不斷補充

58、新培養(yǎng)基，取出部分條件培養(yǎng)基，菌體仍然滯留罐內(nèi)。v特點：v除去有毒害的代謝物v補充營養(yǎng)物質(zhì)2.7 發(fā)酵培養(yǎng)工藝控制v微生物發(fā)酵生產(chǎn)水平取決于:v生產(chǎn)菌種性能與合適的環(huán)境條件v發(fā)酵過程各種參數(shù)處于不斷變化狀態(tài)v關(guān)鍵在于過程檢測與控制檢測儀器與主要參數(shù)v原位傳感器：pH，溶氧，溫度，壓力v在線儀器：尾氣分析儀v離線儀器：基質(zhì)、產(chǎn)物濃度v生物學(xué)參數(shù)：菌體濃度，形態(tài)，雜菌v物理參數(shù)：溫度，壓力，攪拌，粘度v化學(xué)參數(shù)：基質(zhì)濃度，pH，溶解氧，尾氣，補料，消泡2.7.1 生物學(xué)檢測主要的參數(shù)與控制v1.細(xì)胞形態(tài)v鏡檢：顯微鏡檢測，染色，光學(xué)、熒光，電鏡v應(yīng)用：v是否污染，發(fā)酵過程狀態(tài)，菌種的真實性。2.

59、菌體濃度v概念：菌濃：單位體積發(fā)酵培養(yǎng)液內(nèi)菌體細(xì)胞的含量。v應(yīng)用：v決定適宜補料量、供氧量等，以得到最佳生產(chǎn)水平。臨界菌體濃度控制v概念：攝氧速率與氧傳傳速率平衡時的菌體濃度 菌體濃度超過此濃度，抗生素的生產(chǎn)速率會迅速下降。菌體遺傳特性與發(fā)酵罐氧傳質(zhì)特性的綜合反映。3.發(fā)酵污染雜菌的檢測與控制v種子污染培養(yǎng)基滅菌不徹底v空氣帶菌v設(shè)備及其附件滲漏2.7.2 物理參數(shù)的檢測與控制v1.溫度的檢測與控制v發(fā)酵溫度概念:發(fā)酵中的所維持溫度v在生長和生產(chǎn)的最適溫度范圍內(nèi)v測定：v熱電阻等熱敏原件測定，溫度計上讀出。（1）發(fā)酵熱的構(gòu)成與計算v發(fā)酵熱（fermentation heat）v產(chǎn)生熱與散失熱之

60、差v產(chǎn)生熱：生物熱和攪拌熱v散失熱：蒸發(fā)熱、顯熱和輻射熱。vQ發(fā)酵Q生物Q攪伴Q蒸發(fā)Q顯Q輻射生物熱(biological heat)v概念：菌體生長過程中直接釋放到體外的熱能。v影響因素：v培養(yǎng)基成分：越豐富，生物熱越多。v菌體濃度、呼吸強度：越大，生物熱越多。v不同生長階段：生物熱也不同。v發(fā)酵熱平衡的主要依根：對數(shù)期的生物熱攪拌熱(agitation heat)v概念：攪拌器引起的液體做機械運動時因為摩擦所產(chǎn)生的熱量。v影響因素：v發(fā)酵罐：攪拌設(shè)備、攪拌方式v培養(yǎng)基：發(fā)酵液黏度。v計算：單位體積發(fā)酵液的消耗功率與熱功量（3600kJ/kWh）的乘積。散失熱v蒸發(fā)熱：空氣進(jìn)入發(fā)酵罐后，引起