northern_blot-ppt

1、Northern Blot for microRNA3MicroRNA簡(jiǎn)介MiRNA的檢測(cè)方法northern blot流程 1.RNA的提取2.聚丙烯酰胺膠分離RNA3.RNA轉(zhuǎn)膜4.RNA探針制備5.Northern印記雜交6.顯色步驟1miRNeasy Mini Kit (QIAGEN, Inc)TRIzol total RNA isolation1.RNA的提取的提取2.聚丙烯酰胺膠分離RNA3.RNA轉(zhuǎn)膜4.RNA探針制備5.Northern印記雜交6.顯色OD (optical density )OD260OD280OD230OD260/OD280: 1.8-2.0OD260/23

2、0 2.0步驟110 ug RNA + 2X loading bufferIncubated at 65 for 10min.On ice for 1min.Acrylamide Gel步驟21.RNA的提取2.聚丙烯酰胺膠分聚丙烯酰胺膠分離離RNA3.RNA轉(zhuǎn)膜4.RNA探針制備5.Northern印記雜交6.顯色（1）配制15%的尿素變性PAGE膠，先用0.5XTBE，60V預(yù)跑30min。（2）將樣品與RNA loading buffer按比例混合，70預(yù)熱5min，立即放置冰上。（3）上樣前，用緩沖液沖洗點(diǎn)樣孔，防止點(diǎn)樣孔中的雜質(zhì)影響電泳。（4）點(diǎn)樣時(shí)，使樣品均勻鋪在點(diǎn)樣孔底部或者使用

3、微量進(jìn)樣器直接在靠近點(diǎn)樣孔底部的位置點(diǎn)樣。（5）冰浴中，恒壓60-80V電泳約1.5h，至溴酚藍(lán)指示帶距底部約3cm處。步驟2（1）電泳結(jié)束后，取出凝膠，浸入預(yù)冷的0.5XTBE緩沖液中。（2）轉(zhuǎn)膜所用的膜以及濾紙也需用0.5XTBE緩沖液浸濕。（3）組裝“三明治”，從負(fù)極到正極依次為：濾紙、膠、膜、濾紙。（4）組裝轉(zhuǎn)膜裝置，確保裝置所有正負(fù)極都連接正確。（5）冰浴中，恒壓60V轉(zhuǎn)膜約1h。步驟31.RNA的提取2.聚丙烯酰胺膠分離RNA3.RNA轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜4.RNA探針制備5.Northern印記雜交6.顯色DIG High Prime DNA Labeling and Detection S

4、tarter Kit II1.RNA的提取2.聚丙烯酰胺膠分離RNA3.RNA轉(zhuǎn)膜4.RNA探針制備探針制備5.Northern印記雜交6.顯色步驟4（1）轉(zhuǎn)膜后，用紫外交聯(lián)儀固定膜， 42干燥15min。（2）加入4ml 預(yù)熱的預(yù)雜交液，42旋轉(zhuǎn)30min。（3）倒掉DIG easy hyb ，加入含探針雜交液（探針用預(yù)雜交液稀釋至25ng/ml）。（4）在39-42 溫度下，雜交過(guò)夜。（5）雜交后的膜在室溫用washing buffer漂洗2遍。步驟51.RNA的提取2.聚丙烯酰胺膠分離RNA3.RNA轉(zhuǎn)膜4.RNA探針制備5.Northern印記雜印記雜交交6.顯色1. 雜交后的膜用10ml washing buffer在室溫漂洗膜。2. 用10ml blocking solution進(jìn)行室溫封閉1h。3. 用10ml antibody solution 進(jìn)行室溫孵育2h。4. 10ml washing buffer漂洗膜次，每次5min。5. 再用