慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠腦內(nèi)去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運體基因表達(dá)的變

1、慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠腦內(nèi)去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運體基因表達(dá)的變 作者：唐建軍，張印南，張金玲，許崇濤 摘要目的：探討慢性不可預(yù)見性應(yīng)激抑郁模型大鼠腦內(nèi)去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運體(NET)基因表達(dá)的變化。方法：40只SD雄性大鼠隨機分為正常對照組和抑郁模型組。在建立慢性不可預(yù)見性應(yīng)激抑郁模型后，應(yīng)用動物行為分析系統(tǒng)記錄大鼠自主活動的變化，用逆轉(zhuǎn)錄_聚合酶鏈反應(yīng)法測定NET mRNA的含量。結(jié)果：實驗后第21d，抑郁模型組的活動時間、總路程明顯減少(P<005)，休息時間明顯延長(P<005)，腦橋NET基因表達(dá)明顯下降(P<005)。結(jié)論：抑郁模型大鼠腦橋NET基因表達(dá)

2、下降可能與抑郁障礙發(fā)病有關(guān)。 關(guān)鍵詞抑郁障礙；慢性應(yīng)激；去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運體；逆轉(zhuǎn)錄_聚合酶鏈反應(yīng)法AbstractObjective：To investigate the expression change of brain norepinephrine transporter(NET)mRNA in rats treated with chronic unpredicted mild stress. Methods：Male Sprague_Dawley rats were randomly divided into normal control group and depression m

3、odel group. Chronic stress depression rat model was established and then the autonomic behavior was measured by animal behavior analysis system. The expression of mRNA coding for NET was assayed by reverse transcription_polymerase chain reaction. Results：After unpredicted mild stressors, the motive

4、time and distance were significantly decreased(P<005), and the resting time was significantly prolonged(P<005), the expression of NET mRNA in pontine tissue was significantly decreased(P<005)in depression model group, compared with normal control group. Conclusion：The decreased

5、expression of NET mRNA in pontine might be associated with the etiology of depressive disorder.2 / 16Key Wordsdepressive disorder; chronic stress; norepinephrine transporter; reverse transcription_polymerase chain reaction隨著對抑郁障礙的深入研究，發(fā)現(xiàn)除5_羥色胺(5_HT)系統(tǒng)功能不足外，去甲腎上腺素(NE)系統(tǒng)的功能低下也是構(gòu)成抑郁障礙的病理生理基礎(chǔ)之一。NE再攝取位點即

6、NE轉(zhuǎn)運體(NET)位于神經(jīng)末梢突觸前膜，其功能是重攝取突觸間隙的NE進入突觸前膜，終止NE對突觸后膜受體的作用。NET是多種抗抑郁藥物的作用靶點，抗抑郁藥物可通過阻斷NET以提高胞外NE濃度，延長NE對神經(jīng)元突觸后膜受體的作用時間而達(dá)到抗抑郁效果1。因此NET對去甲腎上腺素能神經(jīng)傳遞起著重要作用，它的基因表達(dá)變化有可能與抑郁障礙的發(fā)病機制有關(guān)。本實驗在建立慢性不可預(yù)見性應(yīng)激的抑郁大鼠模型基礎(chǔ)上，采用逆轉(zhuǎn)錄_聚合酶鏈反應(yīng)法(RT_PCR)，觀察抑郁模型大鼠腦內(nèi)NET mRNA表達(dá)的變化。1 材料與方法11 動物成年Sprague_Dawley(SD)雄性大鼠(中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供)4

7、0只，2月齡，體質(zhì)量(200±12)g。實驗前每籠5只飼養(yǎng)1周動物房室溫(20±2)，明/暗交替環(huán)境，自由進食、飲水。1周后開始實驗，單籠飼養(yǎng)。將其隨機分為正常對照組(20只)和抑郁模型組(20只)。12 試驗方法121 應(yīng)激過程 抑郁模型組每日隨機安排1種應(yīng)激(行為限制2h、4冰水游泳5min、禁食、禁水各24h、夾尾1min、明/暗顛倒24h、電擊足底5min、鼠籠傾斜45° 24h、潮濕墊料10h、空瓶放置1h和45高溫5min)，連續(xù)21d2。正常對照組不接受任何應(yīng)激，自由進食、飲水。實驗期間，每周稱重大鼠。122自發(fā)活動測定 用DigBehv動物行為視頻

8、跟蹤分析系統(tǒng)(上海吉量軟件科技有限公司，中國)測定實驗前和實驗后第21d大鼠的自發(fā)活動(檢測在9001100AM進行，時程5min)。自發(fā)活動在開放場(40cm×40cm×65cm)進行，由攝像系統(tǒng)和視頻合成器記錄大鼠的活動情況，計算機分析系統(tǒng)分析大鼠的運動軌跡，監(jiān)視、分析休息及活動時間、總路程、線性度、平均速度、中央?yún)^(qū)域活動時間及路程、四周活動(四角和四邊)時間及路程的行為改變。123 腦內(nèi)mRNA測定 用RT_PCR測定總RNA抽提。實驗后(第21d)兩組同時斷頭取腦，冰上分離出下丘腦、海馬、額葉和腦橋，抽提組織總RNA，用40L無核酸酶的水稀釋RNA沉淀。用BioPh

9、otometer蛋白核酸定量測定儀(Eppendorf公司，德國)測吸光度值(A260/A280)和RNA濃度。引物合成。由上海生工公司根據(jù)文獻設(shè)計合成NET和_肌動蛋白(_actin)cDNA引物3。所有引物序列均經(jīng)PCR_PLAN軟件分析，確認(rèn)其序列與相應(yīng)目的基因的同源序列無互補性。NET的上游引物P1為5_CATCAACTGTGTTACCAG_TTTTATT_3；下游引物P2為5_AACATGGCCAGAAGAAAGGTACC_3，PCR擴增產(chǎn)物長度為334bp的DNA片段。_actin的上游引物P3為5_ACACTGTGCCCATCTACGAGG_3；下游引物P4為5_AGGGGCCG

10、GACTCGTCATACT_3，PCR擴增產(chǎn)物長度為623bp的DNA片段。RT_PCR反應(yīng)參數(shù)。通過退火溫度和循環(huán)數(shù)的調(diào)整，依據(jù)美國Promega公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(編號A3500)步驟，確定RT_PCR反應(yīng)參數(shù)。逆轉(zhuǎn)錄模板RNA為1L(質(zhì)量濃度1g/L)，加入Oligo dT_Adaptor Primer 1L，RNase Inhibitor 05L，10×RNA PCR Buffer 2L，Reverse Transcrptase 1L，MgCl2 4L，dNTP 2L(均為10mmol/L)；再加無核酸酶水至終體積為20L。反應(yīng)條件：42 15min、95 5min、0 5mi

11、n。以_actin為內(nèi)參照，用PCR擴增目的基因。反應(yīng)體系：逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5L，10×RNA PCR Buffer 245L，各引物均為05L(終濃度20pmol/L)；Taq酶(5u/L)0125L，MgCl2 18L，加滅菌蒸餾水至總體積為25L。起始變性95 3min，然后執(zhí)行如下反應(yīng)條件：94 30s，57 30s，72 1min，共35個循環(huán)，72最后延伸7min，10保存。PCR產(chǎn)物電泳及定量分析。取PCR產(chǎn)物5L，加DNA上樣緩沖液1L，于質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂糖凝膠中電泳，70mV下電泳80min。AlphaEaseFC凝膠掃描成像系統(tǒng)對電泳條帶進行密度掃描，計算目的基因RT_

12、PCR產(chǎn)物吸光度值與看家基因_actin RT_PCR產(chǎn)物吸光度值之比值，作為目的基因mRNA的相對含量。124 統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS 115統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料用±s表示，兩組指標(biāo)比較用t檢驗，方差不齊時用t檢驗。2 結(jié)果21 自發(fā)活動測定結(jié)果抑郁模型組實驗后第21d與正常對照組比，自發(fā)活動有明顯改變(表1)。表1 兩組自發(fā)活動的比較（略）22 總RNA測定結(jié)果用BioPhotometer蛋白核酸定量測定儀測出的腦組織所提取的總RNA濃度為(0520)g/L，A260/A280在1820之間，表明RNA相對分子質(zhì)量完整，無降解、無污染。23 RT_PCR產(chǎn)物確認(rèn)用RT_

13、PCR擴增產(chǎn)物作瓊脂糖凝膠電泳分析，所得片段大小與文獻報道一致3(圖1)。圖1A、1B分別為NET和_actin mRNA在腦橋處的表達(dá)，電泳條帶清晰可見，能正常分析。圖1C為NET mRNA在額葉處表達(dá)，電泳條帶微弱，甚至沒有，無法分析。_actin mRNA在額葉處的表達(dá)正常，條帶清晰。NET mRNA在海馬和下丘腦的表達(dá)和額葉基本相同，幾乎無電泳條帶，無法正常分析。24 腦橋NET mRNA含量經(jīng)_actin校正后的結(jié)果顯示，抑郁模型組實驗后第21d腦橋NET mRNA的表達(dá)與正常對照組比明顯下降(P<005)(圖2)。3 討論研究顯示NE系統(tǒng)神經(jīng)功能低下與抑郁障礙的發(fā)病有

14、密切關(guān)系4。腦橋是參與調(diào)節(jié)睡眠、覺醒、記憶力、注意力行為的重要結(jié)構(gòu)，腦內(nèi)去甲腎上腺素能神經(jīng)元胞體主要分布在腦橋的藍(lán)斑核，通過纖維投射分布到下丘腦、海馬和額葉等腦區(qū)。NET mRNA僅分布在去甲腎上腺素能神經(jīng)元上，腦內(nèi)其他類型的神經(jīng)元不表達(dá)NET5。本實驗中，無論抑郁模型組還是正常對照組，在下丘腦、海馬和額葉處用RT_PCR法均檢測不到NET mRNA表達(dá)，這是因為只有神經(jīng)元胞體內(nèi)才具有合成蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，而核糖體卻幾乎不存在于軸突和神經(jīng)末梢內(nèi)。去甲腎上腺素能神經(jīng)元的胞體主要集中在腦橋，因此在下丘腦、海馬和額葉處幾乎無NET mRNA表達(dá)。NET蛋白在藍(lán)斑核處合成后，以順向軸突運輸?shù)姆绞椒植嫉街?/p>

15、各個腦區(qū)的神經(jīng)纖維末梢，發(fā)揮重吸收NE的作用6。本實驗采用慢性不可預(yù)見性應(yīng)激抑郁大鼠模型，模擬人類慢性、低水平的應(yīng)激源所致抑郁障礙來研究腦內(nèi)NET，在受體水平探討抑郁障礙發(fā)病的神經(jīng)生化機制。結(jié)果顯示，慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激結(jié)合單籠喂養(yǎng)21d后，大鼠的自主行為明顯減少，表明大鼠已出現(xiàn)行為性抑郁，同時其腦橋NETmRNA表達(dá)明顯降低。在對大鼠反復(fù)的束縛應(yīng)激后，發(fā)現(xiàn)NET結(jié)合位點在藍(lán)斑處明顯減少7。Rusnak等8對大鼠經(jīng)過40d的慢性應(yīng)激后，用原位雜交法檢測NETmRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)明顯下降。我們使用慢性不可預(yù)見性應(yīng)激的大鼠模型，研究結(jié)果與其一致，提示腦橋NET表達(dá)的變化與慢性應(yīng)激所致抑郁的發(fā)

16、生密切相關(guān)。慢性不可預(yù)見性應(yīng)激抑郁大鼠腦橋NET下降的機制目前并不清楚。Cubells等9給予大鼠利血平以耗竭NE、5_HT，24h后NETmRNA表達(dá)在藍(lán)斑核處明顯下調(diào)?？煅蹌铀邉儕Z(REMSD)作為治療抑郁障礙的一種快速方法，有可能通過改變NET的表達(dá)起效。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)正常大鼠進行REMSD 72h后，NETmRNA表達(dá)明顯增加10。Lee等11給予大鼠18d單胺氧化酶抑制劑，提高了突觸間的NE濃度，NET的表達(dá)也隨之增加。以上研究表明，NETmRNA在腦橋處表達(dá)降低也許是對突觸間隙NE濃度低的一種代償性適應(yīng)，慢性應(yīng)激抑郁大鼠腦內(nèi)NET基因表達(dá)降低可被看作是去甲腎上腺素能神經(jīng)元的“自我抗抑

17、郁效應(yīng)”，以便盡可能維持去甲腎上腺素能的神經(jīng)傳遞。應(yīng)用慢性不可預(yù)見性應(yīng)激的抑郁模型，我們先前的研究顯示大鼠的自主活動量與海馬5_HT含量呈平行關(guān)系，大鼠的抑郁樣行為出現(xiàn)伴隨著海馬5_HT含量明顯減少。而本實驗也顯示行為性抑郁大鼠腦橋的NET mRNA表達(dá)明顯降低，這進一步表明慢性不可預(yù)見性應(yīng)激的抑郁模型動物具有生物學(xué)基礎(chǔ)，對抑郁障礙研究是一種理想的動物模型。參考文獻：1Benmansour S，Altamirano AV，Jones DJ，et al. Regulation of the norepinephrine transporter by chronic administration

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20、 new concepts in axonal transportJ. Curr Opin Neurobiol， 2001，11：550-557.7Zafar HM，Pare WP，Tejani SM. Effect of acute or repeated stress on behavior and brain norepinephrine system in Wistar_Kyoto(WKY)ratsJ. Brain Res Bull，1997，44：289-295.8Rusnak M，Kvetnansky R，Jelokova J，et al. Effect of novel stressors on gene expression of tyrosine hydroxylase and m