HBVx基因真核表達載體的構建及對肝癌細胞惡性表型的影響

1、HBVx基因真核表達載體的構建及對肝癌細胞惡性表型的影響 作者：郭雙平王文亮翟宇強 【關鍵詞】 乙型肝炎病毒x基因 關鍵詞: 乙型肝炎病毒x基因;真核表達載體;肝癌細胞 摘 要:目的 構建乙型肝炎病毒x基因真核表達載體并在肝癌細胞中表達，以研究其對肝癌細胞惡性表型的影響. 方法 應用PCR、基因克隆等方法構建乙型肝炎病毒x基因真核表達載體pcDNA3.1-HBX，用基因轉染的方法將pcD-NA3.1-HBX轉染入肝癌細胞HCC-9204，篩選穩(wěn)定表達乙型肝炎病毒X蛋白的肝癌細胞.MTT比色實驗、平板集落形成實驗檢測肝癌細胞惡性表型. 結果 成功構建了乙型肝炎病毒x基因真核表達載體pcDNA3.

2、1-HBX并獲得了穩(wěn)定表達乙型肝炎病毒X蛋白的肝癌細胞系HCC-9204細胞克隆，且MTT比色實驗、平板克隆形成實驗顯示穩(wěn)定表達乙型肝炎病毒X蛋白的肝癌細胞惡性度增高. 結論 乙型肝炎病毒X蛋白具有生長因子樣作用，可刺激肝癌細胞生長，在肝癌細胞中穩(wěn)定表達乙型肝炎病毒X蛋白可增加肝癌細胞惡性表型. Keywords:HBV x gene;eukaryotic expression vector;hepa-tocellular carcinoma cell 1 / 18Abstract:AIM To construct and express the eukaryotic ex-pression

3、vector of HBV x gene and study its effect on the ma-lignant phenotype of hepatocellular carcinoma cells.METHODS Polymerase chain reaction（PCR）and other molecular biological methods were used to construct theeukaryotic expression vector of HBV x gene pcDNA3.1-HBX.Then gene transfection mediated by th

4、e lipofectamine was used to introduce the eukaryotic expression vector of HBV x gene into human hepatocellular carcinoma cell line HCC-9204.The selective medium containing G418was used to select the cell clones which express the X protein of HBV constantly.MTT colorimetric analysis experiment and ag

5、arose colony-forming were used to study the role of the X protein in the malignant phenotype and growth of hepatocel-lular carcinoma cells.RESULTS The eukaryotic expression vector of HBV x gene was successfully constructed.The cell clones which expressed the X protein constantly were ob-tained by th

6、e selective medium containing G418.Cells which constitutively expressed the X protein had a relatively higher malignant phenotype.CONCLUSION The X protein has growth factor-like activities and can stimulate the growth of hepatocellular carcinoma cells and enhance its malignant phe-notype. 0 引言 乙型肝炎病

7、毒（HBV）相關的原發(fā)性肝癌發(fā)病率和死亡率都很高，HBV與原發(fā)性肝癌之間存在著密切的關系.闡明二者的關系將對探討HBV相關的原發(fā)性肝癌的發(fā)生、發(fā)展、預防及治療具有重要意義.為此，本研究首先構建了HBV x基因真核表達載體，并通過基因轉染技術轉染至人HCC-9204肝癌細胞，經過藥物篩選獲得穩(wěn)定表達HBV X蛋白的細胞克隆，觀察肝癌細胞在轉染外源性HBV x基因后細胞惡性表型的變化. 1 材料和方法 1.1 材料 人肝癌細胞系HCC-9204為病理學教研室建株.肝癌細胞取自60歲男性肝癌患者手術標本，病理診斷為肝細胞肝癌級.MTT購自Sigma公司，Taq DNA聚合酶、G418購自Promeg

8、a公司，EcoR I，Kpn I，BamH I，T4 DNA連接酶為華美公司產品，兔抗HBx多克隆抗體購自美國Fox Chase癌癥中心，地高辛DNA隨機引物標記試劑盒購自德國寶靈曼公司，HBV x基因PCR引物由上海生工生物工程公司合成. 1.2 HBV x基因克隆及序列測定 1.2.1 PCR法從質粒pTTHK中擴增HBV x基因 模板為含HBV DNA的質粒pTTHK，分別在PCR引物的上游引物和下游引物的5端加上相應的限制性內切酶Kpn I和EcoR I酶切位點，引物順序如下:上游引物5ATCGGTACCATGGCTGC-TAGGCTG3;下游引物5GGAGAATTCAT-GATTAG

9、GCAGAGGTG3. 應用上述引物對模板DNA進行PCR，按下列條件在PCR自動擴增儀上進行PCR.945min591min741min，循環(huán)30次后，74延伸10min.陰性對照除不含模板DNA外，其他成分與實驗組相同. 1.2.2 PCR產物與克隆載體pT7Blue連接 先用EcoR V將克隆載體pT7Blue切成線性，然后將回收的PCR產物HBx DNA片段接于克隆載體pT7-Blue.取連接產物轉化感受態(tài)細菌DH5大腸桿菌，挑選單菌落，篩選重組體. 1.2.3 篩選重組體pT7Blue-HBX 取上述質粒用EcoRI和KpnI雙酶切鑒定. 1.2.4 序列測定 選擇酶切結果正確的細菌

10、菌落，提取質粒DNA并純化.用紫外分光光度計測定DNA濃度，將510g質粒DNA溶于三蒸水，用DNA自動測序儀進行序列測定. 1.2.5 真核表達載體pcDNA3.1-HBX的構建 將已經過序列測定的重組質粒pT7Blue-HBX及真核表達載體pcDNA3.1分別用EcoRI和KpnI雙酶切，用DNA回收試劑盒回收并純化HBx和pcDNA3.1片段，T4 DNA連接酶進行連接.EcoRI和KpnI雙酶切鑒定重組質粒pcDNA3.1-HBX. 1.3 基因轉染及篩選 用脂質體載體法將經聚乙二醇6000純化的pcDNA3.1-HBX和pcDNA3.1質粒分別轉染HCC-9204肝癌細胞，參照GIB

11、CORL說明書進行.接種細胞于選擇性培養(yǎng)液含G418700mg・L-1 ，培養(yǎng)1wk后換于含G418500mg・L-1 的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng).同時設對照，用選擇性培養(yǎng)液培養(yǎng)未進行基因轉染的親本細胞. 1.4 HBV x基因在肝癌細胞中的表達 原位雜交法檢測轉染pcDNA3.1-HBX質粒的第四代肝癌細胞中HBV x mRNA，探針用DNA隨機引物法進行標記.對照實驗:設未轉染肝癌細胞為陰性對照，不加探針的空白對照.免疫熒光法檢測經G418篩選的轉染pcDNA3.1-HBX或pcDNA3.1質粒的第四代 肝癌細胞中X蛋白.對照實驗:空白對照分別用PBS代替

12、一抗或二抗.陰性對照為未進行基因轉染的HCC-9204肝癌細胞爬片. 1.5 轉染pcDNA3.1HBX質粒對肝癌細胞惡性表型的影響 1.5.1 四唑鹽（MTT）比色試驗 將未進行基因轉染的HCC-9204肝癌細胞，轉染pcDNA3.1空載體的肝癌細胞及穩(wěn)定表達X蛋白的肝癌細胞，阿霉素誘導細胞凋亡.待細胞基本長滿培養(yǎng)孔底時，將培養(yǎng)板移入4冰箱放置1h，分別用200L濃度為5，10，20，40和80mol・L-1 阿霉素作用于細胞，每3孔為1組，濃度相同，37，5mL・L-1 CO2 及飽和濕度下培養(yǎng).3h后，吸棄藥液，培養(yǎng)液洗細胞2次，換新的完全培養(yǎng)

13、液200L繼續(xù)培養(yǎng)6h.每孔加新鮮配制的MTT（5g・L-1 ）20L作用4h，加二甲基亞砜（DMSO）150L，振蕩10min，酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔在490nm波長的吸光度，記錄結果. 1.5.2 平板集落形成實驗 取對數(shù)生長期的轉染pcDNA3.1-HBX，pcDNA3.1質粒的肝癌細胞及未進行基因轉染的親本細胞HCC-9204，制成單細胞懸液;按每個培養(yǎng)皿含2000個細胞的密度分別接種.將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計數(shù)細胞隆數(shù)，計算克隆形成率并進行2 檢驗. 2 結果 2.1 HBV x基因真核表達載體pcDNA3.1HBX的構建 2.1.1

14、 HBV x基因的克隆及序列測定 應用HBV x基因的引物，對含HBV DNA的質粒pTTHK模板進行PCR反應，電泳結果顯示僅在480bp處有單一條帶，陰性對照為陰性（Fig1）. 圖1 略 2.1.2 HBV x DNA與克隆載體pT7Blue的連接及重組體的鑒定 回收并純化480bp大小的HBV x DNA與克隆載體pT7Blue的連接復合物，擴增后提取質粒DNA，用EcoRI和KpnI雙酶切鑒定，結果表明HBV x DNA已克隆到pT7Blue載體，構建成重組體pT7Blue-HBX（Fig2）. 圖2 略 2.1.3 重組體pT7Blue-HBX序列測定 將已經酶切鑒定的pT7Blu

15、e-HBX重組質粒，經DNA自動測序儀進行序列分析，表明克隆到pT7Blue中的PCR產物是HBV x基因，屬adw2型. 2.1.4 HBV x基因真核表達載體的構建 取經過測序的重組質粒pT7Blue-HBX用EcoRI和KpnI雙酶切，將HBV x片段定向克隆于真核表達載體pcD-NA3.1，轉化宿主菌DH5大腸桿菌，篩選重組質粒，酶切鑒定，電泳結果見Fig3.表明HBV x基因已被定向克隆于真核表達載體，構建成了HBV x基因真核表達載體pcDNA3.1-HBX. 圖3 略 2.2 HBV x基因在肝癌細胞中的表達 2.2.1 基因轉染 用脂質體介導法分別將經聚乙二醇6000純化的pc

16、DNA3.1-HBX和pcDNA3.1質粒轉染人HCC-9204肝癌細胞，3d后用G418篩選抗 G418肝癌細胞，2wk后絕大多數(shù)細胞都死亡，僅殘留少數(shù)貼壁細胞.貼壁細胞逐漸呈克隆性生長（Fig4），待細胞生長至瓶底面積60%時，將部分細胞凍存，部分細胞擴大培養(yǎng).對照組結果，未轉染基因的肝癌細胞，經相同濃度G418作用2wk后，細胞全部死亡，初步說明基因轉染成功. 2.2.2 轉錄水平檢測肝癌細胞中HBV x基因的表達 原位雜交法檢測肝癌細胞中HBV X mRNA，按常規(guī)方法檢測轉染pcDNA3.1-HBX質粒的第四代肝癌細胞中HBV X mRNA，未轉染基因的肝癌細胞為陰性對照.在實驗組細

17、胞，結果可見藍紫色顆粒樣物位于細胞質中，細胞核中無陽性信號，對照組細胞質和細胞核中均無陽性信號（Fig5）.說明HBV x基因被轉染入肝癌細胞并轉錄成mRNA. 2.2.3 免疫熒光法檢測X蛋白在肝癌細胞中的表達 按常規(guī)方法檢測X蛋白在轉染pcDNA3.1-HBX質粒的第四代肝癌細胞中的表達，未進行基因轉染的肝癌細胞為陰性對照.熒光顯微鏡下觀察，在實驗組細胞胞質和細胞核中均可見黃綠色熒光，對照組細胞無黃綠色熒光.說明，轉染HBV x基因的肝癌細胞表達X蛋白. 2.3 轉染pcDNA3.1HBX對肝癌細胞惡性表型的影響 2.3.1 MTT比色試驗 取每組3個孔數(shù)據(jù)均數(shù)，進行方差分析，兩兩比較.5

18、，10和20mol・L-1 阿霉素作用各組細胞時，穩(wěn)定表達X蛋白肝癌細胞的A490nm 值顯著高于單獨轉染空載體及未進行基因轉染的肝癌細胞（P<0.05）.轉染空載體及未轉染基因的肝癌細胞比較，各個濃度阿霉素作用后，A490nm 值差異均無顯著性（P>0.05，Tab1）. 表1 阿霉素誘導HCC-9204細胞凋亡的MTT試驗結果略 2.3.2 平板集落形成實驗 將對數(shù)生長期的穩(wěn)定表達X蛋白的肝癌細胞，轉染空載體的肝癌細胞及未轉染基因的親本細胞各2000個/每皿，接種于培養(yǎng)皿，培養(yǎng)2wk后可見細胞集落形成，姬姆薩染色（Fig6，7），計算克隆形

19、成率，分別為75.6%，38.9%和41.7%.2 檢驗顯示，穩(wěn)定表達X蛋白的肝癌細胞克隆形成率較其他兩種細胞高，并且差異有顯著性（P<0.05），轉染空載體的肝癌細胞克隆形成率與親本細胞克隆形成率相近，差異無顯著性（P>0.05）. 圖4 圖7 略 3 討論 原發(fā)性肝癌的發(fā)生和HBV感染密切相關，是最常見的惡性腫瘤之一.研究表明，HBV感染與原發(fā)性肝癌之間存在著密切的關系，特別是HBV x基因編碼的X蛋白具有反式激活作用，可激活病毒和細胞基因，調控其轉錄，與病毒復制和慢性感染狀態(tài)的維持相關，在HCC的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用1 .為研究X蛋白的功能，已建立了不少

20、HBV x基因表達體系，有在大腸桿菌表達融合蛋白的，有在昆蟲細胞中表達的，也有在人和哺乳動物細胞表達的.不論那種表達體系和檢測形式X蛋白均具有活性，說明X蛋白功能域穩(wěn)定，在各種細胞內其活性均不受影響.為研究X蛋白對肝癌細胞惡性表型的影響，本研究首先構建了HBV x基因真核表達載體，用脂質體介導法將其轉入肝癌細胞HCC-9204，并經G418篩選獲得穩(wěn)定表達X蛋白的肝癌細胞克隆.MTT比色試驗、平板集落形成試驗表明穩(wěn)定表達X蛋白的肝癌細胞惡性程度增高，克隆形成率高于未轉染基因的親本細胞.細胞生長力旺盛、分裂相極多見，完全失去接觸性抑制呈多層生長.表明X蛋白具有生長調控蛋白樣作用，可促進肝癌細胞生

21、長，使肝癌細胞惡性程度增高. X蛋白屬于核蛋白，但在轉染的肝癌細胞中定位于細胞質和細胞核.這與一些研究報道一致，在HBV急慢性感染的肝組織和肝癌組織中，X蛋白共存于細胞質和細胞核2 .X蛋白在細胞中的位置與細胞種類，狀態(tài)及X蛋白的作用狀態(tài)有關，細胞中不同的X結合蛋白決定了X蛋白在細胞中的定位，而且不同定位的X蛋白在細胞中發(fā)揮的作用不同.細胞質中的X蛋白可影響細胞信號轉導，已發(fā)現(xiàn)X蛋白可影響細胞Ras/Raf/MAPK信號轉導途徑3，4 ，X蛋白可激活轉錄因子NF-B5，6 ，還可與p53形成蛋白質-蛋白質復合體7，8 ，影響p53介導的信號轉導9 .X蛋白具有生長調控蛋白樣作用，不恰當?shù)丶せ钚?/p>

22、號轉導途徑，刺激細胞生長10 . 在HBV相關的原發(fā)性肝癌發(fā)生過程中，HBV x基因最常被整合入宿主細胞基因組，并且整合的x基因可編碼在體內外都具有反式激活作用的X蛋白8 .隨著HBV復制，表達病毒膜抗原的肝細胞被機體免疫反應識別并清除，而含有整合型病毒基因的肝細胞，由于病毒基因的缺陷可逃逸機體免疫反應，并隨著肝細胞再生而呈克隆性增生，成為優(yōu)勢細胞 11 .在其他致癌因素協(xié)同作用下促進細胞惡性轉化，這可能是HBV相關的原發(fā)性肝癌發(fā)生的重要機制之一. 參考文獻: 1Seifer M，Hohne M，Schaefer S，Hoeijmakers JH，Curtis CH.In vitro tumo

23、rigenicity of hepatitis B virus DNA and HBx pro-tein J.J Hepatol，1991;13（4）:561-565. 2Wang WL，London WT，F(xiàn)eitelson MA.Hepatitis B x antigen in hepatitis B virus carrier patients with liver cancer J.Cancer Res，1991;51:4971-4977. 3Benn J，Schneider RJ.HBV X protein activates ras-GTP com-plex formation a

24、nd establishes a ras，raf MAP kinase signaling cascade J.Proc Natl Acad Sci USA，1994;91:10350-10354. 4Benn J，Schneider RJ.Hepatitis B virus HBx protein deregulates cell cycle checkpoint controls J.Proc Natl Acad Sci USA，1995;92:11215-11219. 5Kekule AS，Laure U，Weiss L，Luber B，Hofschneider PH.HBV transactivator HBx uses a tumour promoter signalling pathway J.Nature，1993;361:742-745. 6Marakami S，Cheong JH，Ohno S，Tab S，Hotta Y.Transacti-vation of human HBV X protein，HBx operates through mecha-nism distinct from protein kinase C and okadaic acid