p57kip2在肝癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理因素、PCNA和p53的關(guān)系

1、p57kip2在肝癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理因素、PCNA和p53的關(guān)系 作者：郭卉，南克俊，阮之平，景昭，劉陜西 【關(guān)鍵詞】 原發(fā)性肝癌 【Abstract】 AIM: To investigate the expression of p57kip2 and its relationship with clinicopathology, PCNA and p53 in primary hepatocellular carcinoma (HCC). METHODS: Expression of p57kip2, PCNA and p53 in tumor tissues from 32 pa

2、tients with HCC and 10 liver tissues of normal persons was detected with Elivision immunohistochemical technique. RESULTS: p57kip2 protein positiveexpression rate in HCC was 56.2%，which was lower than that in normal tissues (100%) (P=0.011). The reduced expression of p57kip2 protein correlated signi

3、ficantly with moderate or lowdifferentiation of tumor cells (P=0.007), high clinical stage (P=0.041) and poor prognosis (P=0.036), but did not correlate significantly with metastasis, tumor size, level of AFP and age (P>0.05). PCNA positiveexpression rate was 56.2%, which was correlated signi

4、ficantly with the expression of p57kip2 (P=0.036) and p53 positiveexpression rate was 46.9%, which was not correlated significantly with the expression of p57kip2 (P>0.05). CONCLUSION: There is a marked loss or absence of p57kip2 expression and high expression of PCNA in HCC, which are involv

5、ed in the carcinogenesis and development of HCC. p57kip2 and p53 may induce apoptosis via different mechanisms. 2 / 18【Keywords】 p57kip2 gene; HCC; PCNA; p53 【摘要】 目的：檢測(cè)細(xì)胞周期抑制因子p57kip2在肝癌中的表達(dá)水平，探討它與臨床病理因素、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、p53的關(guān)系. 方法：用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)32例肝癌組織和10例正常肝臟組織中p57kip2, PCNA和p53的表達(dá)水平. 結(jié)果：p57kip2在肝癌組織中的陽(yáng)性

6、率56.2%，顯著低于正常肝臟組織（100%）（P=0.011），p57kip2的缺失表達(dá)與肝癌細(xì)胞的分化較差(P=0.007)、臨床分期較晚(P=0.041)及預(yù)后較差有關(guān)(P=0.036)，與年齡、AFP, 腫瘤大小及腫瘤侵犯轉(zhuǎn)移無(wú)顯著相關(guān)（P>0.05）；PCNA在肝癌組織中陽(yáng)性率為56.2%，與p57kip2的表達(dá)有關(guān)(P=0.036)；p53在肝癌組織中的陽(yáng)性率46.9%，與p57kip2表達(dá)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)相關(guān)性（P>0.05）. 結(jié)論：肝癌組織中存在p57kip2的表達(dá)缺失、PCNA的高表達(dá), 共同參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展，而p57kip2和p53可能通過(guò)不同

7、途徑來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡. 【關(guān)鍵詞】 p57kip2基因；原發(fā)性肝癌；增殖細(xì)胞核抗原；p53 0引言 細(xì)胞周期機(jī)制破壞是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、發(fā)展的核心機(jī)制. p57kip2基因最早由Matsuoka等1發(fā)現(xiàn)，定位于染色體11p11.5，屬于CIPKIP基因家族. 在結(jié)構(gòu)上與p21、p27有部分同源性，通過(guò)抑制多種CDK活性從而使細(xì)胞俘獲在G1期. 具有抑癌基因的活性1. 增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）的表達(dá)與細(xì)胞增殖狀態(tài)密切相關(guān)2. p53是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要基因，可間接反映細(xì)胞的凋亡情況3. 本試驗(yàn)旨在探討p57kip2在肝癌組織中的

8、表達(dá)缺失情況及它與臨床病理因素、PCNA和p53的關(guān)系. 1材料和方法 1.1材料 1.1.1標(biāo)本西安交通大學(xué)第一臨床醫(yī)院2000/2002手術(shù)切除的肝癌標(biāo)本32(男26，女6)例. 全組患者年齡2672（49.2±12.3）歲， 所有患者術(shù)前未經(jīng)過(guò)化療和放療. 組織學(xué)分級(jí)32例中級(jí)3例，級(jí)14例，級(jí)11例，級(jí) 4例；TNM分期，期2例，期16例，期10例，期4例. AFP陽(yáng)性15例. 所有病例均經(jīng)病理學(xué)證實(shí). 所有標(biāo)本經(jīng)40 g/L甲醛固定，石蠟包埋，4 m切片，應(yīng)用多聚賴(lài)氨酸包被，用作免疫組化研究 . 對(duì)所有蠟塊HE染色觀察，選出組織學(xué)形態(tài)較好的切片進(jìn)行研究. 收集同時(shí)期意外死亡

9、健康成年男性正常肝臟組織標(biāo)本10例，經(jīng)HE染色診斷為正常肝組織，作為對(duì)照組. 1.1.2試劑抗鼠抗人p57kip2 mAb（57P06），抗鼠抗人PCNA mAb（PC10），抗鼠抗人p53抗體（MAB0226），Elivision二步法檢測(cè)試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司. 12方法 1.2.1p57kip2，PCNA，p53應(yīng)用免疫組化(Elivision法)染色切片常規(guī)脫蠟至水，30 mL/L雙氧水阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶20 min，將切片至于pH 6.0的檸檬酸緩沖液行高溫高壓抗原熱修復(fù)7 min，置冷，羊血清封閉37孵育20 min. 加p57kip2一抗（150），置于濕盒，4冰箱

10、過(guò)夜. PCNA和p53一抗均按150稀釋?zhuān)?7恒溫箱孵育1 h. 先后加Elivision二步法檢測(cè)試劑盒中試劑A、B各50 L，分別室溫孵育40 min. DAB顯色，蘇木素襯染，鹽酸乙醇分化，脫水透明后中性樹(shù)膠封固. 光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果. 以正常肝組織作p57kip2和p53的陽(yáng)性對(duì)照，以磷酸緩沖鹽溶液(PBS)代替一抗作陰性對(duì)照. 以正常肝組織作PCNA的陰性對(duì)照. 1.2.2結(jié)果判定p57kip2蛋白以胞核或胞質(zhì)染色為棕黃色顆粒為陽(yáng)性. 陽(yáng)性細(xì)胞百分比為計(jì)400倍顯微鏡下10個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞的平均數(shù)：0，<10%；1，10%25%；2，25%50%；3，50%75%;

11、4，>75%. 陽(yáng)性強(qiáng)度以著色程度進(jìn)行計(jì)分: 0，不著色；1，淡黃；2，棕黃；3，棕褐. 兩分相乘: 02為陰性，35為弱陽(yáng)性，68為陽(yáng)性，912為強(qiáng)陽(yáng)性. PCNA及p53以胞核染色為棕黃色顆粒>50%為陽(yáng)性細(xì)胞. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理. 采用Fisher確切概率法及Spearman相關(guān)分析. P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義. 2結(jié)果 2.1p57kip2的表達(dá)在32例原發(fā)性肝癌(HCC)組織中，p57kip2陽(yáng)性表達(dá)18例，表達(dá)率56.25%，所有正常肝組織均為陽(yáng)性表達(dá)（Fig 1），表達(dá)率為100%，肝癌組織p

12、57kip2的表達(dá)率顯著低于正常組織（P=0.011）. 表達(dá)p57kip2的高分化肝癌組織中，胞質(zhì)和胞核呈棕黃色顆粒(Fig 2). p57kip2在低分化肝癌組織中，與周?chē)?yáng)性癌旁組織相比，癌灶陽(yáng)性細(xì)胞著色淺，數(shù)量少，細(xì)胞排列不一，形態(tài)紊亂(Fig 3). 2.2p57kip2表達(dá)與肝癌的病理分級(jí)、臨床分期、及生存期等的關(guān)系p57kip2表達(dá)與肝癌的病理分級(jí)、臨床分期、及生存期有關(guān)，與年齡、AFP, 最大瘤徑及肝被膜轉(zhuǎn)移和局部侵犯無(wú)關(guān). 32例分化程度不同的肝癌標(biāo)本中，癌細(xì)胞分化越差，p57kip2蛋白的表達(dá)率越低. p57kip2蛋白在級(jí)的陽(yáng)性率（88.2%）顯著 級(jí)陽(yáng)性率（20.0%,

13、 P=0.007）. p57kip2蛋白表達(dá)在早期HCC患者（72.2%）及生存期1 a的患者（78.6%）顯著高于晚期HCC患者（35.7%, P=0.041）及生存期1 a患者（27.8%, P=0.036）. 以血清甲胎蛋白(AFP)400 g/L為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，p57kip2蛋白在AFP陽(yáng)性的HCC患者中表達(dá)率（36.4%）低于AFP陰性的HCC患者（66.7%），但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無(wú)顯著性差異（P=0.142）. p57kip2蛋白與腫瘤大小、年齡、肝被膜轉(zhuǎn)移和局部侵犯無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)（P>0.05, Tab 1）.表1p57kip2與肝癌各項(xiàng)病理指標(biāo)之間的關(guān)系（略） 2.3PCNA

14、和p53在肝癌組織中的表達(dá)癌巢中絕大多數(shù)癌細(xì)胞PCNA陽(yáng)性，而癌旁組織陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量很少（Fig 4）. p53在肝癌組織中的表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞核圓形，成棕黃色顆粒，大小不一（Fig 5）. 2.4肝癌組織中p57kip2和PCNA及與p53的表達(dá)的相關(guān)性PCNA與p57kip2的表達(dá)程度之間有顯著負(fù)相關(guān)性(rs=-0.397, P=0.025, Tab 2)，而p53與p57kip2的表達(dá)程度之間無(wú)顯著性相關(guān)(rs=0.197, P=0.279, Tab 2).表2p57kip2與PCNA，p53在原發(fā)性肝癌組織表達(dá)中的相關(guān)性（略） 3討論 細(xì)胞周期G1期的調(diào)控是有多種細(xì)胞周期調(diào)控因子參與的復(fù)雜過(guò)

15、程，細(xì)胞周期G1期調(diào)控異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)4. p57kip2基因定位于染色體11P11.5，編碼316個(gè)氨基酸殘基的多肽，Mr 57 000. p57kip2基因的表達(dá)產(chǎn)物屬于CIP/KIP家族與p21, p27部分同源，包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域：一個(gè)與CDK抑制物p21及p27同源的N末端區(qū)域；一個(gè)中央脯氨酸富集域及一個(gè)與p27相同的C末端區(qū)（QT域）. 脯氨酸富集域含有一些PAPA重復(fù)序列（脯氨酸丙氨酸殘基組成），它們被認(rèn)為可以介導(dǎo)特異的蛋白蛋白相互作用，從而實(shí)現(xiàn)p57kip2功能5, 6. 其抑癌機(jī)制是通過(guò)p57kip2蛋白與CyclinCDK復(fù)合物(ECDK2、D2CDK2和ACDK2

16、)結(jié)合，阻滯細(xì)胞增生，從而使細(xì)胞周期停滯在G1期而實(shí)現(xiàn)的7. 在眾多CDKIs中，只有p57kip2是胚胎形成所必需的，在增殖、運(yùn)動(dòng)、變形、分化等一系列復(fù)雜過(guò)程中都起重要作用8. p57kip2基因敲除的小鼠常出現(xiàn)臍疝、軟骨軟化缺陷、腎髓質(zhì)發(fā)育不良、腎上腺皮質(zhì)增生異常，腫瘤發(fā)生率增高；同時(shí)該類(lèi)小鼠大多數(shù)在24 h死亡，僅有10%的小鼠存活，卻呈現(xiàn)嚴(yán)重的生長(zhǎng)遲緩，提示p57kip2可能參與了細(xì)胞增殖和啟動(dòng)細(xì)胞分化的作用9. p57kip2基因在正常人類(lèi)是被印記的，這是第一個(gè)用該機(jī)制調(diào)控的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白. 在正常情況下，p57kip2基因的父源基因被印記，母源基因表達(dá). 在一些腫瘤中存在p57k

17、ip2基因印記缺失（Lose of Imprint）或印記錯(cuò)誤，導(dǎo)致基因表達(dá)下降，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展10. p57kip2作為腫瘤抑制因子和生長(zhǎng)調(diào)控因子，它這種單個(gè)等位基因的表達(dá)方式增加了畸形和癌變的危險(xiǎn)11. 現(xiàn)已證實(shí)p57kip2在食管癌、胃癌、大腸癌、卵巢癌、乳腺癌、甲狀腺癌、胰腺癌等腫瘤組織均有表達(dá)12-14，但p57kip2表達(dá)與肝癌的關(guān)系報(bào)道較少. 本試驗(yàn)結(jié)果表明，p57kip2在肝癌組織中的表達(dá)率明顯低于正常肝組織，并與組織分級(jí)、臨床分期及預(yù)后有關(guān)，提示p57kip2表達(dá)陰性者細(xì)胞增殖活性高，發(fā)展較快，預(yù)后較差. 證明了p57kip2有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用. PCNA是DNA聚

18、合酶的輔助因子，不僅參與DNA的生物合成，而且與Cyclin, CDK, p21形成四聚體，調(diào)控細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖. 其表達(dá)與細(xì)胞的增殖情況有關(guān)，因此可作為評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖的指標(biāo)15, 且PCNA的過(guò)度表達(dá)與消化系統(tǒng)腫瘤有關(guān). 本結(jié)果表明，PCNA在肝癌組織中的表達(dá)（56.2%）明顯高于正常組織（30.0%），且p57kip2在PCNA陽(yáng)性的組織中表達(dá)明顯低于PCNA陰性者. PCNA與p57kip2的表達(dá)程度之間有顯著相關(guān)性(P<0.05). 說(shuō)明p57kip2和PCNA可能存在協(xié)同作用，通過(guò)對(duì)PCNA的抑制，阻滯正在進(jìn)行DNA復(fù)制的細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的DNA復(fù)制，從而實(shí)現(xiàn)抑癌作用.

19、p53是重要的凋亡活化基因. p53基因的突變，導(dǎo)致細(xì)胞周期監(jiān)控機(jī)制的破壞，人類(lèi)50%的腫瘤都是由于p53基因突變，使DNA監(jiān)測(cè)點(diǎn)異常，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展16. 但DNA損傷的監(jiān)測(cè)還存在非p53依賴(lài)機(jī)制17. 本結(jié)果表明，p53在肝癌組織中的表達(dá)率（46.9%）明顯低于正常組織（80%）；p57kip2陽(yáng)性的肝癌組織中，p53的陽(yáng)性率也高，但p53與p57kip2的表達(dá)程度之間無(wú)顯著性相關(guān)(P>0.05). 這恰恰說(shuō)明p57可能是通過(guò)p53非依賴(lài)性機(jī)制，直接與CDKCyclins復(fù)合物結(jié)合，抑制它們激活參與細(xì)胞的增殖和凋亡調(diào)控，而不是像p21那樣通過(guò)p53p21CDKsCycli

20、ns途徑阻滯細(xì)胞周期. 綜上所述，p57kip2蛋白的缺失及PCNA的高表達(dá)有助于肝癌的發(fā)生、發(fā)展，而p57kip2與p53可能通過(guò)不同的途徑發(fā)揮細(xì)胞周期調(diào)控作用. 【參考文獻(xiàn)】 1 Matsuoka S, Edwards MC, Bai C, et al. p57KIP2, a structurally distinct member of the P21cipl CDK inhibitor family, is a candi2 date tumor suppressor gene1J. Gene Dev, 1995; 9(6):650. 2 Yue H, Na YL, Feng XL,

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