靶向表皮生長因子受體shRNA表達載體的構(gòu)建和鑒定

1、靶向表皮生長因子受體shRNA表達載體的構(gòu)建和鑒定【摘要】 目的 構(gòu)建靶向表皮生長因子受體(EGFR)的短發(fā)卡狀RNA(shRNA)質(zhì)粒表達載體并進行鑒定。方法 根據(jù)人類EGFR的mRNA序列，設(shè)計4條干擾片段，以PGPU6/GFP/Neo質(zhì)粒為載體，構(gòu)建shRNA重組體，轉(zhuǎn)化入DH5a大腸桿菌，提取質(zhì)粒，進行酶切和測序鑒定;采用脂質(zhì)體Lipofectamin 2000分別轉(zhuǎn)染人皮膚鱗狀細胞癌細胞株Colo-16細胞，用G418篩選陽性克隆。結(jié)果 經(jīng)酶切及測序鑒定，成功構(gòu)建了針對 EGFR的4個重組干擾質(zhì)粒;成功轉(zhuǎn)染Colo-16細胞，經(jīng)篩選后得到穩(wěn)定表達的細胞克隆。結(jié)論 利用 RNAi技術(shù)原

2、理成功構(gòu)建針對 EGFR的shRNA重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染入Colo-16細胞。 【關(guān)鍵詞】 表皮生長因子受體;RNA干擾;短發(fā)卡狀RNA;轉(zhuǎn)染Abstract： Objective To establish and identify the plasmid expression vector encoding short hairpin RNA (shRNA) targeting epidermal growth factor receptor (EGFR) of human gene. Methods Four short hairpin RNAs (shRNA) were designed a

3、ccording to the homo sapiens EGFR mRNA ID, and then recombinant shRNA was reconstructed, with PGPU6/GFP/Neo plasmids as vectors, respectively. The plasmids were transferred into E. coli DH5 for plasmid extraction and the subsequent identification by enzyme digesting and sequencing. 2 / 19Four recomb

4、inant plasmids were transfected into Colo-16 cells with lipofectamine 2000 and were screened for positive clones by G418. Results The results of enzyme-digestion sequencing confirmed that four plasmids containing shRNA were successfully constructed. Four recombinant plasmids were successfully transf

5、ected into Colo-16 cells and the cell clones with stable expression were obtained. Conclusion With RNAi technology, the recombinant shRNA plasmids targeting EGFR were successfully established and transfected into Colo-16 cells.Key words: epidermal growth factor receptor; RNA interference; small hair

6、pin RNA; transfection表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)屬于表皮生長因子家族1 (erbB家族)，為原癌基因C-erbB(HER-1)的表達產(chǎn)物，是一種細胞膜表面的糖蛋白受體，它與表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(transferring growth factor ,TGF)等配體結(jié)合，能激活酪氨酸激酶受體，導(dǎo)致酪氨酸殘基的磷酸化，促進細胞無節(jié)制地增殖分裂，導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生2。阻斷EGFR可抑制腫瘤生長，其作用機制可能與抑制細胞周期進程、加速細胞凋亡、抑制血管

7、生成、抑制浸潤和轉(zhuǎn)移、增強化、放療敏感性等有關(guān)3。小干擾RNA(siRNA)4與同源性mRNA結(jié)合, 可靶向切斷降解此mRNA, 在蛋白翻譯前抑制基因表達5。我們構(gòu)建編碼EGFR的短發(fā)卡狀RNA (shRNA) 質(zhì)粒表達載體,并對其進行鑒定,為皮膚鱗癌的靶向治療尋找新的途徑。1 材料和方法1.1 材料 空質(zhì)粒PGPU6/GFP/Neo為Genepharma公司產(chǎn)品。各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶為美國Promega公司產(chǎn)品。Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品。感受態(tài)菌DH5a購于博大泰克公司;質(zhì)粒抽提試劑盒購于Promega 公司;G418、卡那霉

8、素購于Sigma公司;人皮膚鱗狀細胞癌細胞株Colo-16細胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所周武慶教授惠贈;RPMI 1640培養(yǎng)基購于GIBCO公司。1.2 實驗方法1.2.1 EGFR siRNA轉(zhuǎn)錄模板DNA鏈的設(shè)計、合成 針對EGFR基因的siRNA寡核苷酸序列設(shè)計，通過在GenBank上比對6，分別選擇EGFR基因(NM 005228)CDs編碼序列中的第282300、63 81、402422、506526特異性序列為siRNA的正義鏈，按siRNA設(shè)計原則，由Ambion公司設(shè)計、合成1#、2#、3#、4# EGFR siRNA 4對，經(jīng)Blast Search檢索確認與EGFR以外

9、的人類已知基因序列無同源性。序列如下： 1#siRNA正義鏈5-CACAGTGGAGCGAATTCCT-3，反義鏈 5-GTGTCACCTCGCTTAAGGA-3。2#siRNA正義鏈5-GAGTCGGGCTCTGGAGGAA-3; 反義鏈 5-CTCAGCCCGAGACCTCCTT-3。3#siRNA正義鏈5-GCTGCCCATGAGAAATTTACA-3;反義鏈 5-CGACGGGTACTCTTTAAATGT-3。4#siRNA正義鏈5-GCAGTGACTTTCTCAGCAACA-3; 反義鏈 5-CGTCACTGAAAGAGTCGTTGT-3。根據(jù)1#siRNA、2#siRNA 、3#s

10、iRNA、4#siRNA序列，設(shè)計模板DNA鏈4條，由Invitrogen公司合成。其構(gòu)建順序為Bbs酶切位點、正義序列、9nt loop接頭序列、反義序列、 RNA聚合酶終止子(6個T)、BamH酶切位點。將寡核苷酸序列克隆到載體上。1.2.2 表達質(zhì)粒PGPU6/GFP/Neo-EGFR shRNA的構(gòu)建 分別將4對模板鏈褪火連接,用T4DNA連接酶將其定向插入到 BamH和Bbs雙酶切的PGPU6/GFP/Neo空載體中,構(gòu)建成重組體質(zhì)粒。將重組體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a,卡那霉素抗性篩選陽性克隆,命名為PGPU6/GFP/Neo-EGFR-282、PGPU6/GFP/Neo-EGFR

11、-63、PGPU6/GFP/Neo-EGFR-402、PGPU6/GFP/Neo。1.2.3 質(zhì)粒表達載體的鑒定 所得質(zhì)粒用BamH, Pst分別酶切鑒定(圖2)。陽性重組載體應(yīng)該可以被BamH切開，而不能被Pst切開。電泳觀察插入子及載體片段的相對分子質(zhì)量，PGPU6/GFP/Neo-EGFR序列測定由上海Invitrogen公司完成。1.2.4 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 Colo-16細胞在含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置5% CO2、37°飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每天記錄細胞的生長狀態(tài)，適時換液、傳代。實驗所用的細

12、胞均處于對數(shù)生長期，且存活細胞百分率均在95%以上。轉(zhuǎn)染時用0.25%胰酶消化后鋪6孔板，使其在轉(zhuǎn)染日融合度為80%90%,用OPTIMEMI無血清培養(yǎng)基250 l稀釋45 g質(zhì)粒載體和10 g脂質(zhì)體Lipofectamine 2000進行轉(zhuǎn)染, 46 h后更換完全培養(yǎng)基。24 h后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況。2 結(jié) 果2.1 重組質(zhì)粒鑒定 PGPU6/GFP/Neo-EGFR經(jīng)酶切后電泳，可觀察到在5 000 bp和100 bp左右各有1條帶，符合PGPU6/GFP/Neo質(zhì)粒(5 117 bp)及插入的siRNA片段(55/54/58/58 bp)的特征(見圖1)。測序證實與設(shè)計的siRNA

13、轉(zhuǎn)錄模板序列相同，表明所構(gòu)建的重組質(zhì)粒含有設(shè)計的目的序列(圖2)。圖1 重組載體的酶切鑒定M: lamda/Eco130I;最左上側(cè)1-5為EGFR-282 (1-5) Pst酶切結(jié)果，其右側(cè)1-5為EGFR-63 (1-5) Pst酶切結(jié)果;其右側(cè)1-5為EGFR-282 (1-5) BamH酶切結(jié)果，最右側(cè)1-5為EGFR-63 (1-5) BamH酶切結(jié)果;最左下側(cè)1-5為EGFR-402 (1-5) Pst酶切結(jié)果，右側(cè)1-5為EGFR-506 (1-5 Pst酶切結(jié)果;右側(cè)1-5為EGFR-402 (1-5) BamH酶切結(jié)果，最右側(cè)1-5為EGFR-506 (1-5) BamH酶切

14、結(jié)果2.2 成功轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定篩選 shRNA表達載體編碼shRNA的帶綠色熒光蛋白的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入Colo-16細胞后在藍色熒光激發(fā)波長下細胞應(yīng)顯示為綠色, 轉(zhuǎn)染后24 h熒光顯微鏡攝片證實轉(zhuǎn)染成功(圖3), G418穩(wěn)定篩選出陽性克隆。圖2 測序結(jié)果A.PGPU6/GFP/Neo-EGFR-63;B.PGPU6/GFP/Neo-EGFR-282;C.PGPU6/GFP/Neo-EGFR-402;D.PGPU6/GFP/Neo-EGFR-506圖3 轉(zhuǎn)染24 h同視野細胞照片(×400)A.常光照片;B.熒光照片3 討 論EGFR過表達可以促進腫瘤細胞形成、增殖、黏附、轉(zhuǎn)移和血管形成。在

15、頭頸部腫瘤、肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、腦膠質(zhì)細胞瘤等均有 EGFR過表達現(xiàn)象 ,而且在分化低、有轉(zhuǎn)移的病例 EGFR 的陽性率明顯增高7-9。EGFR是原癌基因 C-erbB1 (HER-1) 的表達產(chǎn)物,人類 EGFR/C-erbB1基因定位于7p12.113.2 ,編碼的蛋白質(zhì)為型跨膜酪氨酸蛋白激酶生長因子受體 ,當(dāng)體內(nèi)外某些刺激因素使EGFR過度表達時,則持續(xù)向細胞內(nèi)傳遞分裂、增殖信號,導(dǎo)致DNA合成增加,刺激各種細胞持續(xù)生長和增殖,發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變。EGFR在頭頸部鱗癌中存在過度表達,并與鱗癌發(fā)病、病理分化程度、轉(zhuǎn)移及病灶復(fù)發(fā)等密切相關(guān)。RNAi是近年來科學(xué)界的重要發(fā)現(xiàn) ,

16、 其作為一種新興的基因敲除技術(shù)，被廣泛用于基因功能研究。RNAi的發(fā)現(xiàn)提供了特異性阻斷基因表達的新策略，這在因某個基因表達異常增高引起的疾病中非常有用，小干擾RNA (small interfering RNA,siRNA) 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默,具有高效、特異的特點10。雙鏈RNA(double stranded RNA,dsRNA)進入細胞后被Dicer酶識別并切割成2123個核苷酸的siRNA。siRNA與RNA介導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA induced silencing complex,RISC) 結(jié)合,識別并降解同源基因mRNA,進而抑制目的基因表達6。關(guān)于EGFR的研究開展得已經(jīng)非

17、常廣泛，但運用RNAi技術(shù)來抑制腫瘤細胞EGFR表達的報道卻很少。Nagy等11利用EGFR siRNA成功將表皮樣癌細胞A431 erbB1表達水平下降90%，這是對EGFR進行RNAi的首次報道。Zhang等12運用在體外化學(xué)合成的EGFR序列特異性dsRNA，針對肺癌細胞A549細胞的EGFR基因瞬時沉默，使A549細胞生長和侵襲能力明顯降低，但是這種方式進入細胞內(nèi)的siRNA易被降解而無法持久地沉默EGFR表達。為獲得持久沉默EGFR的效果，可以通過質(zhì)粒把shRNA轉(zhuǎn)染入細胞并使得shRNA融入人細胞基因組，利用細胞基因組的復(fù)制而復(fù)制，持續(xù)產(chǎn)生siRNA，長久地降解EGFR的mRNA。

18、利用質(zhì)粒或病毒作為載體、借助 RNA 聚合酶 啟動子 (如U6 、H1) 啟動外源 DNA 在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄表達 shRNA ,進一步切割產(chǎn)生 siRNA 。質(zhì)粒介導(dǎo)的 shRNA表達法操作簡便 ,可穩(wěn)定而持久地抑制靶基因表達。質(zhì)粒介導(dǎo)的細胞轉(zhuǎn)染效率較病毒介導(dǎo)的低 ,可能會影響基因沉默效果 ,但采用篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞克隆則可克服質(zhì)粒介導(dǎo)的細胞轉(zhuǎn)染效率相對較低的問題。本實驗采用空載體PGPU6/GFP/Neo，這種質(zhì)粒專門用于RNAi實驗，它帶有的U6啟動子有強大的功能，在U6 啟動子的作用下，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生shRNA, 其發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu)被切除后產(chǎn)生的siRNA,具有表達量多、持續(xù)時間久的優(yōu)點;并且經(jīng)證實以9個

19、核苷酸序列環(huán)為發(fā)卡的shRNA產(chǎn)生的抑制效應(yīng)最強;通過抗性輔助篩選,重組體被整合到宿主細胞基因組后,RNA干擾效應(yīng)可以傳代。另外，帶有卡那霉素抗性基因，可用于真核細胞轉(zhuǎn)染后篩選單克隆細胞。Bai等13運用質(zhì)粒載體介導(dǎo)的shRNA靶向干擾EGFR來治療肺腺癌已經(jīng)取得滿意效果。表達載體顯著下調(diào)EGFR表達，被干擾的腫瘤細胞出現(xiàn)G1期阻滯、生長抑制及凋亡增加的現(xiàn)象。認為siRNA介導(dǎo)的EGFR表達抑制可能成為治療腫瘤的一種有效方法。本實驗成功構(gòu)建了4條針對EGFR的shRNA真核表達載體，4條干擾片段能保證至少1條有較高的干擾效率，并分別用脂體質(zhì)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染Colo-16

20、細胞，用卡那霉素篩選得到穩(wěn)定生長的單細胞克隆，為下一步觀察其沉默EGFR的表達及抑制腫瘤細胞增殖等打下穩(wěn)固的基礎(chǔ)。本研究結(jié)果也證實了我們構(gòu)建的表達載體可以進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,重組體可以整合到Colo-16細胞，為皮膚鱗狀細胞癌的基因治療提供新的途徑?！緟⒖嘉墨I】 1 Gao J, Li J, Ma L. Regulation of EGF-induced ERK/MAPK activation and EGFR internalization by G protein-coupled receptor kinase 2J. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai), 2

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