基因操作原理

1、?基因操作原理?課程教學(xué)大綱課程編碼：13019課程名稱：基因操作原理課程英文名稱：Princeples of Gene Manipulation先修課程：生物化學(xué)、遺傳學(xué)、 分子生物學(xué)等適用專業(yè)：生物技術(shù) 生物科學(xué)總學(xué)時：56 講課學(xué)時 56 實驗學(xué)時 0 實習(xí)學(xué)時 0總學(xué)分一、課程性質(zhì)、地位和任務(wù)“基因操作原理是伴隨著生物學(xué)尤其是分子生物學(xué)的飛速開展而興起的一門新學(xué)科。重點介紹基因操作中的工具酶及其種類、活性和用途；質(zhì)粒載體、噬菌體載體和表達(dá)載體等的根本構(gòu)成、種類和用途；重組DNA導(dǎo)入細(xì)菌和真核細(xì)胞的方法；DNA、RNA和蛋白質(zhì)的別離及檢測技術(shù)；定點誘變技術(shù)； PCR技術(shù)原理及其應(yīng)用；cD

2、NA文庫和基因組文庫的構(gòu)建；分子雜交原理和技術(shù)； DNA序列分析的原理，通過Internet進(jìn)行序列分析處理以及數(shù)據(jù)的獲取。本門課程開設(shè)的指導(dǎo)思想在于使學(xué)生在掌握一般生物學(xué)以及分子生物學(xué)知識的根底上，掌握DNA重組，轉(zhuǎn)移、表達(dá)和檢測等技術(shù)的根本概念和根本原理，為日后從事基因工程和分子生物學(xué)研究打下技術(shù)操作方面的理論根底。分子克隆技術(shù)是與本課程配套的實驗課程。二、課程根本要求能對以基因克隆和表達(dá)為主線的基因操作自行設(shè)計技術(shù)路線， 要求學(xué)生隨著科學(xué)研究和技術(shù)的開展，及時掌握新的知識和方法。本課程涉及到生物學(xué)的一些重要課程，如：普通生物學(xué)、生物化學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)，因此要學(xué)生選修這些課

3、程之后，再選修本課程。如果能做到理論與實驗并至，將能穩(wěn)固所學(xué)知識。重點要求學(xué)生掌握在核酸水平上進(jìn)行研究的根本方法。三、教學(xué)內(nèi)容及安排緒論：基因操作的理論根底2學(xué)時 本章重點與難點: 掌握與基因操作有關(guān)的根本概念0 什么是基因 基因的重疊與可變性啟動子 SD序列 轉(zhuǎn)錄終止區(qū) 其它 根本步驟 亞克隆第1章 基因操作工具酶 (10學(xué)時) 本章重點與難點: 要求掌握和了解限制酶與常用工具酶的種類活性和用途, 讓學(xué)生知道“基因操作原理是靠什么“工具來完成的。1.1 限制酶 1.1.1.1 現(xiàn)象 1.1.1.2 限制酶的發(fā)現(xiàn)及其命名 1.1.1.3 限制與修飾系統(tǒng)的種類 限制酶產(chǎn)生的末端 / 時間DNA的

4、切割(酶切水平) 影響活性的因素 酶切位點在基因組中分布不均一性dam/dcm甲基化酶 EcoRI甲基化酶 SssI甲基化酶 1.3 DNA聚合酶DNA聚合酶1.3.2 Klenow 酶1.3.3 T4噬菌體DNA聚合酶1.3.4 T7噬菌體DNA聚合酶1.3.5 耐熱DNA聚合酶(第7章中詳細(xì)介紹)1.4.1 RNA聚合酶1.4.2 連接酶1.4.2.1 T4 DNA連接酶 1.4.2.3 Taq DNA連接酶 1.4.2.4 T4 RNA連接酶1.4.3 T4多核苷酸酶1.4.5.1 DNA酶 1.4.5.2 RNA酶1.4.6 RNA酶抑制劑1.4.8 DNA單鏈結(jié)合蛋白第2章 分子克隆

5、載體(14學(xué)時) 本章重點與難點: 重點掌握質(zhì)粒、噬菌體、粘粒和M13噬菌體的組成結(jié)構(gòu)和用作基因克隆的工作原理，了解其它克隆載體，表達(dá)載體和其它功能性載體的種類及其工作的根本原理。 質(zhì)粒的根本特性 2 概念 2.1.1.2 質(zhì)粒的復(fù)制和不相容性 2.1.1.3 轉(zhuǎn)移性2.1.2 標(biāo)記基因 -互補2.1.3 質(zhì)粒載體的種類 噬菌體載體噬菌體的分子生物學(xué) 噬菌體載體的選擇標(biāo)記 代表性噬菌體載體 用途 粘粒克隆載體-cos位點粘粒載體 cos位點的粘粒載體 charomid卡隆粒9載體系列3.1.1 克隆中常見的問題 M13噬菌體的生物學(xué) 2.4.2 M13噬菌體載體2.4.2.1 插入?yún)^(qū)域 2.4

6、.2.2 M13mp載體 2.4.2.3 宿主菌 2.4.2.4 用途 2.4.2.5 克隆中常見的問題 噬菌粒 M13KO7 酵母生物學(xué)簡介 酵母人工染色體 2.5.3 細(xì)菌人工染色體2.5.3.1 F質(zhì)粒生物學(xué)2.5.3.2 載體的必需成分2.5.3.3 工作原理2.5.3.4 用pBeloBAC11構(gòu)建蘇云金芽胞桿菌YBT1520全基因組文庫2.5.4 PAC載體2.5.4.1 P1噬菌體2.5.4.2 P1載體和 PAC載體Lac啟動子系列 Trp/tac 啟動子系列 GST 基因融合蛋白載體 A融合蛋白載體 His融合蛋白載體 2.7.1 穿梭載體 2.7.1.1 /gram+ 2.

7、7.1.2 /yeast 2.7.1.3 /plant cell 2.7.1.4 /Mammalian 2.7.4.1 無復(fù)制子整合載體 2.7.4.2 溫度敏感復(fù)制子整合載體 轉(zhuǎn)座子載體第3章 基因操作中的別離與分析技術(shù)(6學(xué)時) 本章重點與難點: 重點掌握大腸桿菌質(zhì)粒DNA別離純化,瓊脂糖凝膠電泳和DNA片段回收的方法性原理以及RNA別離純化的考前須知和別離及電泳方法。要求掌握印跡分析的種類、原理和方法，特別要求掌握這些方法的運用對象，到達(dá)能靈活運用這些方法的目的。3.1 DNA的別離DNA的別離純化 DNA的別離純化DNA 3.1.3.3脈沖電場電泳3.1.4 DNA的回收 3.1.4.

8、3 Glass milk 3.1.4.4 Qiagen 柱 3.2 RNA的別離3.2.1 RNA的別離純化 3.3 染色體DNA的別離3.4 探針制備3.5 印跡分析雜交3.5.1 Southern雜交DNA的轉(zhuǎn)移 Northern 雜交 RNA的提取和電泳 RNA的轉(zhuǎn)移 3.5.3 Western“雜交 SDS-PAGE 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至固相支持體 靶蛋白的檢測3.6 基因芯片3.6.2.1 Array3.6.2.2 Microarray3.6.2.3 DNA chip3.6.2.4 Lab on a chip 3.6.3.1 DNA分子在剛性外表的固定 3.6.3.2 探針的標(biāo)記3.6.3.

9、3 雜交3.6.5 DNA芯片的應(yīng)用3.6.5.1 RNA 表達(dá)分析 3.6.5.3單核苷酸多態(tài)性SNP分析第4章 PCR技術(shù)及應(yīng)用(6學(xué)時) 本章重點與難點: 要求重點掌握PCR技術(shù)的根本原理、根本操作程序以及引物設(shè)計方法，了解利用PCR技術(shù)原理所衍生出來的技術(shù)方法的種類和工作原理，到達(dá)能夠自覺合理地利用PCR技術(shù)為研究和應(yīng)用效勞。 PCR的根本原理4.1.1 PCR運行的根本原理 熱穩(wěn)定DNA聚合酶的種類和用途 Taq DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶4.1.3 引物的設(shè)計 .1 長短 4.1.3.2 Tm值 4.1.3.3 其它4.1.4 運行程序 4.1.4.1 溫度 4.1.

10、4.2 時間4.1.4.3 平臺效應(yīng) 4.2 PCR技術(shù)的應(yīng)用4.2.1 PCR克隆 4.2.1.1 AT克隆 4. 2.1.2 平末端克隆 4.2.1.3 反向PCR4.2.2 反轉(zhuǎn)錄相關(guān)PCR 4.2.2.1 反轉(zhuǎn)錄PCR 4.2.2.2 5RACE 4.2.2.3 3RACE4.2.3 PCR鑒定和多態(tài)性 PCR鑒定 RAPD AFLP 實時熒光定量PCR原理4.2.4.2 檢測模式PCR方式 略 PCR介導(dǎo)的誘變 (詳見后文)4.2.5.2 PCR介導(dǎo)的DNA序列測定(詳見后文)第5章 DNA序列分析(4學(xué)時) 本章重點與難點: 要求掌握DNA序列分析的根本原理和根本步驟, 能夠做到自

11、行設(shè)計和按排測序工作；同時要求能對所測得的序列進(jìn)行常規(guī)分析, 了解如何利用因特網(wǎng)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。 5.1 Maxam-Gilbert 化學(xué)降解法5.1.1 根本原理5.1.2 優(yōu)缺點 5.2 Sanger雙脫氧終止法5.2.1 測序策略 5.2.1.1 亞克隆 5.2.1.2 嵌套缺失克隆 5.2.1.3 “引物步進(jìn)5.2.2 根本原理和步驟 5.2.2.1 原理 5.2.2.2 步驟 5.2.2.3 雙鏈模板5.2.3 PCR自動測序 5.2.3.1 PCR反響 5.2.3.2 自動測序和分析 5.3 DNA序列的數(shù)據(jù)分析5.3.1 目標(biāo)序列的特征分析 5.3.1.1 酶切位點 5.3.

12、1.2 ORF查找/ORF的特征 5.3.1.3 其它(二級結(jié)構(gòu), 啟動子, SD序列等)5.3.2 目標(biāo)序列的網(wǎng)絡(luò)分析 5.3.2.1 同源性分析 5.3.2.2 注冊登記 5.3.2.3 基因序列的獲得 5.3.2.4 兩個或多個序列的同源性比擬(5.3將采用多媒體網(wǎng)絡(luò)化演示教學(xué))第6章 DNA文庫的構(gòu)建5學(xué)時 本章重點與難點：要求結(jié)合前面所學(xué)的內(nèi)容，重點掌握基因文庫構(gòu)建的根本原理和步驟，并由此掌握基因文庫構(gòu)建的方法和類型，可自行設(shè)計和選擇構(gòu)建基因文庫的步驟和方法。6.1 基因文庫 概念6.1.2 重組子數(shù) 注意的問題6.2 cDNA文庫 cDNA克隆的策略 cDNA第一鏈的合成 cDNA

13、第二鏈的合成 雙鏈cDNA的分子克隆DNA接頭和銜接頭cDNA的方法6.2.5 DNA克隆的噬菌體載體gt10和gt11 基因組文庫 DNA的處理Southern分析 cDNA文庫6.4 基因文庫的篩選 菌落(噬斑)雜交 篩選的策略 文庫的保存第7章 DNA定點誘變(4學(xué)時) 本章重點與難點: 要求學(xué)生掌握對DNA進(jìn)行定點誘變所使用的方法和種類及其用途, 重點掌握利用寡核苷酸進(jìn)行定點誘變的方法和原理。 7.1 缺失與插入的形式7.1.1 簡單的缺失或插入7.1.2 系統(tǒng)缺失和插入 7.1.2.1 插入接頭的誘變 7.1.2.2 假設(shè)干套嵌套的缺失突變體的產(chǎn)生 7.1.2.3 接頭分區(qū)誘變 7.

14、2 寡核苷酸介導(dǎo)的誘變7.2.1 誘變寡核苷酸的設(shè)計和挑選7.2.2 誘變方法7.2.2.1 雙引物誘變法 7.2.2.2 Kunke法 7.2.2.3 PCR法7.2.3 通過誘變研究蛋白質(zhì) 7.2.3.1 在編碼區(qū)插入六聚體接頭 7.2.3.2 在特定區(qū)域上產(chǎn)生許多突變第8章 重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方式2學(xué)時本章重點與難點:掌握大腸桿菌的轉(zhuǎn)化方法以及電轉(zhuǎn)化的原理及應(yīng)用對象,了解DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方式。8.1. 大腸桿菌的轉(zhuǎn)化 8.1.1 常規(guī)轉(zhuǎn)化方法(CaCl2法) 8.1.2 電轉(zhuǎn)化法 8.1.3 其它方法 芽胞桿菌的轉(zhuǎn)化 8.2.1 原生質(zhì)體融合 8.2.2 電轉(zhuǎn)化法 酵母 植物細(xì)胞 哺乳動物細(xì)胞課程綜合報告 2學(xué)時 報告目的：通過對科學(xué)研究實例的分析，細(xì)化學(xué)生對概念的認(rèn)識，深化學(xué)生對理論的