急性毒性試驗(yàn)(改進(jìn)寇氏法)

1、實(shí)驗(yàn)一 急性毒性試驗(yàn)（改進(jìn)寇氏法）一、目的與要求1、學(xué)習(xí)急性毒性試驗(yàn)的方法，掌握 LD50的測(cè)定方法。2、觀察馬錢子的毒性反應(yīng)。二、實(shí)驗(yàn)原理急性毒性試驗(yàn)是指受試動(dòng)物在一次大劑量給藥后所產(chǎn)生的毒性反 應(yīng)和死亡情況。藥物毒性的大小，常用動(dòng)物的致死量來表示，因?yàn)閯?dòng)物 生與死的生理指標(biāo)較其他指標(biāo)明顯、客觀、容易掌握。致死量的測(cè)定也 較準(zhǔn)確。 在測(cè)定致死量的同時(shí)， 還應(yīng)仔細(xì)觀察動(dòng)物是否出現(xiàn)聳毛、 倦臥、 耳殼蒼白或充血、突眼、步履蹣跚、肌肉癱瘓、呼吸困難、昏迷、驚厥、 大小便失禁等不良反應(yīng)。致死量的測(cè)定常以半數(shù)致死量為標(biāo)準(zhǔn)。 半數(shù)致死量是指能夠引起試 驗(yàn)動(dòng)物一半死亡的劑量，媽藥物致死量對(duì)數(shù)值，用符號(hào)LD

2、50表示。由于LD50的測(cè)定較簡(jiǎn)便、可靠，而且穩(wěn)定，現(xiàn)已成為標(biāo)志動(dòng)物急性中毒 程度的重要常數(shù)。LD50測(cè)定的方法有多種，如 Bliss法、改進(jìn)寇氏法、 簡(jiǎn)化機(jī)率單位法、累積插值法、機(jī)率單位 - 加權(quán)直線加歸法等等。以上 方法雖各有特點(diǎn)，但都有共同的要求：（1）動(dòng)物：均選用體重 仃22克健康小鼠（同次試驗(yàn)體重相差不 得超過4克），或選用體重120150克（同次試驗(yàn)體重相差不得超過 1 0 克）健康大鼠作實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。性別相同或雌雄各半。（2）給藥途徑：要求采用兩種給藥途徑，其中必須有一種與臨床 所采用的相同。溶于水的藥物沿須測(cè)定靜脈注射的 LD50值得提出的是, 臨床上雖然不用腹腔注射， 但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

3、因腹腔注射給藥方便， 吸收迅速， 頗為常用。若供試藥物在腹腔內(nèi)不引起強(qiáng)烈刺激或局部變化（如纖維性 病變等），那么嚙齒類動(dòng)物腹腔注射的 LD50,參數(shù)很接近于靜脈給藥的 LD5Q 口服制劑無法通過注射給藥途徑時(shí)，可只用胃腸給藥。（3）試驗(yàn)周期和觀察指標(biāo)：給藥后至少觀察 7 天。觀察期間應(yīng)逐日 記錄動(dòng)物的毒性反應(yīng)情況和死亡動(dòng)物的分布。（4）正式試驗(yàn)前，均須先用少量動(dòng)物進(jìn)行預(yù)試試驗(yàn)，大致測(cè)出受試藥物引起 0%和 100%死亡率的致死量范圍，然后安排正式試驗(yàn)。正式 試驗(yàn)組數(shù)不得少于三個(gè)劑量組，一般選用45個(gè)劑量組，每組動(dòng)物數(shù)為1020只。（5）報(bào)告LD50時(shí)需注明實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種屬及品系、 性別、體重范圍

4、、 給藥途徑及每個(gè)劑量組動(dòng)物數(shù)等，還需注明受試藥物的配制方法、給藥 劑量、各組劑量間的比值（一般以 0.65 0.85 為宜）、給藥容積、觀 察時(shí)間及計(jì)算方法。還須標(biāo)出 LD50的95痢信限。三、實(shí)驗(yàn)材料和試劑動(dòng)物：小鼠藥品：馬錢子水煎液器材：注射器、灌胃針頭、鼠籠 四、操作方法1、預(yù)試實(shí)驗(yàn)：預(yù)試實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菫榱苏页鲆饎?dòng)物0%(Dn)和100%(Dr)死亡的劑量，以便安排正式實(shí)驗(yàn)。預(yù)試實(shí)驗(yàn)一般采用少量動(dòng)物(6 9只小鼠)進(jìn)行，將動(dòng)物隨機(jī)分為 3 組，組間劑量比值一般以 1： 0.5 或 1： 0.7 為宜。灌服或腹腔注射量以 0.2ml/10g 體重為度。預(yù)試實(shí)驗(yàn) 應(yīng)進(jìn)行到找出Dn和DmW方可

5、安排正式實(shí)驗(yàn)。2、正式實(shí)驗(yàn)：在預(yù)試實(shí)驗(yàn)測(cè)得 Dn和Dm的劑量范圍內(nèi)設(shè)46個(gè)劑 量組，最多10組。最理想的結(jié)果是使 LD50的上下各有23組。組數(shù) 愈少，準(zhǔn)確性愈差。各劑量組的動(dòng)物要求相等，至少 10只動(dòng)物(分組 時(shí)應(yīng)注意分層隨機(jī)均勻化的原則) 。本實(shí)驗(yàn)要求最大反應(yīng)率為 100%，最 小反應(yīng)率為 0%， 或至少反應(yīng)率接近 100%或 0%。組間劑量比值 ( 1 ： K)， 常用 1： 0.8 或 1： 0.75。如實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)相鄰劑量有重復(fù)的 100%和 0%反 應(yīng)率時(shí)，應(yīng)將靠邊的組棄去不計(jì)，使大劑量組只有一個(gè)100%的反應(yīng)率，小劑量組也只有一個(gè) 0%的反應(yīng)率。分組完畢和各組劑量算出后，分組灌服或

6、注射不同劑量的受試藥 物。為能得到理想的結(jié)果，實(shí)驗(yàn)最好從中間劑量開始，以便從最初幾個(gè) 劑量組動(dòng)物接受藥物后的反應(yīng)來判斷兩端劑量是否合適， 便于調(diào)整劑量 和組數(shù)。為了提高實(shí)驗(yàn)的精確度和節(jié)省藥物，受試藥物可按“低比稀釋 法”配置。即使每只動(dòng)物的用藥體積相等( 0.2ml/10g )，而溶質(zhì)不等。 給藥后逐日觀察并記錄中毒反應(yīng)、死亡率和死亡情況。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄與計(jì)算馬錢子水煎液對(duì)小鼠死亡率的影響組別 劑量 Logd(X) 死亡數(shù) 死亡率(P)P2P-P2g/kg(d)1234公式 1:(logLD50)X 50=Xm-i(藝 P-05)則 LD50=log -1 X50公式 2: Sx 50=i*(' P-為 p2) / (n -1)公式 3: LD50 的 95%T信限=lg -1 (X50± 1.96S X50)LD50的平均可信限=LD50±( LD50高限-LD50低限)/2Xm最大劑量組劑