細(xì)胞免疫熒光技術(shù)學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1第一頁(yè)，共17頁(yè)。實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)(shyn)目的目的掌握免疫掌握免疫(miny)熒光技術(shù)的熒光技術(shù)的基本原理基本原理熟悉細(xì)胞免疫熟悉細(xì)胞免疫(miny)熒光技熒光技術(shù)的方法術(shù)的方法了解在免疫了解在免疫(miny)細(xì)胞化學(xué)細(xì)胞化學(xué)技術(shù)中如何獲得好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果技術(shù)中如何獲得好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果第1頁(yè)/共17頁(yè)第二頁(yè)，共17頁(yè)。實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)(shyn)原理原理原位檢測(cè)原位檢測(cè)抗原抗體抗原抗體(kngt)特異反特異反應(yīng)應(yīng)間接法間接法 間接熒光(ynggung)抗體染色法示意圖抗抗原原抗抗體體熒光素標(biāo)記熒光素標(biāo)記的抗抗體的抗抗體激發(fā)光激發(fā)光顯示熒光顯示熒光Hela細(xì)胞細(xì)胞Vinculin第2頁(yè)/共17頁(yè)第三頁(yè)，共1

2、7頁(yè)。實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)(shyn)用品用品試劑試劑(shj)：固定液：固定液：4%PFA細(xì)胞通透：細(xì)胞通透：0.2%TritonX封閉試劑封閉試劑(shj)：10%正常山羊血清正常山羊血清一抗：小鼠源抗一抗：小鼠源抗Vinculin單克隆抗體單克隆抗體二抗二抗:Alexa Fluor555標(biāo)記的山羊抗小鼠標(biāo)記的山羊抗小鼠IgGDAPI（4,6-二脒基二脒基-2-苯基吲哚）苯基吲哚）PBS洗滌緩沖液：洗滌緩沖液：PH7.4材料：材料：Hela細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)皿細(xì)胞培養(yǎng)皿儀器儀器(yq)：熒光顯微鏡熒光顯微鏡第3頁(yè)/共17頁(yè)第四頁(yè)，共17頁(yè)。實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)(shyn)步驟步驟 一，細(xì)胞制備一，細(xì)胞制備(zhbi

3、)和細(xì)胞固和細(xì)胞固定定將細(xì)胞鋪在將細(xì)胞鋪在24孔板中孔板中將細(xì)胞培養(yǎng)將細(xì)胞培養(yǎng)至所需密度至所需密度加入加入4%PFA固定固定10min染色染色或保存或保存PBS洗洗滌滌PBS洗洗滌滌第4頁(yè)/共17頁(yè)第五頁(yè)，共17頁(yè)。實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)(shyn)步驟步驟 二，細(xì)胞二，細(xì)胞(xbo)免疫熒光免疫熒光ICC染染色色0.2%TritonX處理處理(chl)5min 封閉封閉室溫室溫30min4過(guò)夜過(guò)夜371-2小時(shí)小時(shí)375-10min熒光顯微鏡熒光顯微鏡觀(guān)察觀(guān)察加入一抗加入一抗加入二抗加入二抗加入加入DAPI復(fù)染復(fù)染PBS洗滌洗滌PBS洗滌洗滌PBS洗滌洗滌第5頁(yè)/共17頁(yè)第六頁(yè)，共17頁(yè)。實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)(shy

4、n)結(jié)果結(jié)果三，觀(guān)察三，觀(guān)察(gunch) human HeLa cells 第6頁(yè)/共17頁(yè)第七頁(yè)，共17頁(yè)。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意(zh y)的的問(wèn)題問(wèn)題 細(xì)胞不要鋪的過(guò)密細(xì)胞不要鋪的過(guò)密:60-70% 防止防止(fngzh)細(xì)胞污染細(xì)胞污染 固定時(shí)間不要太長(zhǎng)固定時(shí)間不要太長(zhǎng),一般一般10-30min TrionX處理時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，膜蛋白可不必處理處理時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，膜蛋白可不必處理 選擇合適的封閉液選擇合適的封閉液 二抗孵育后二抗孵育后,一定要洗干凈一定要洗干凈 必要時(shí)用恒溫?fù)u床搖洗必要時(shí)用恒溫?fù)u床搖洗第7頁(yè)/共17頁(yè)第八頁(yè)，共17頁(yè)。 1. 1. 免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)(jsh)(j

5、sh) 2. 2. 免疫酶技術(shù)免疫酶技術(shù)(jsh)(jsh) 3. 3. 免疫親和技術(shù)免疫親和技術(shù)(jsh)(jsh) 4. 4. 膠體金技術(shù)膠體金技術(shù)(jsh)(jsh) 標(biāo)記標(biāo)記(bioj)(bioj)物物 使抗體或抗使抗體或抗原原 抗體復(fù)合物抗體復(fù)合物在在 各種顯微鏡各種顯微鏡下下 可見(jiàn)的物質(zhì)可見(jiàn)的物質(zhì)免疫免疫(miny)細(xì)胞化學(xué)技術(shù)細(xì)胞化學(xué)技術(shù)第8頁(yè)/共17頁(yè)第九頁(yè)，共17頁(yè)。免疫細(xì)胞化學(xué)免疫細(xì)胞化學(xué)(huxu)技術(shù)注意事項(xiàng)技術(shù)注意事項(xiàng) 選擇合適的方法選擇合適的方法 材料要留好材料要留好 選擇抗體選擇抗體 選擇標(biāo)記選擇標(biāo)記(bioj)酶酶 封閉液的選擇封閉液的選擇 設(shè)定對(duì)照實(shí)驗(yàn)設(shè)定對(duì)照

6、實(shí)驗(yàn)第9頁(yè)/共17頁(yè)第十頁(yè)，共17頁(yè)。思考題思考題檢測(cè)檢測(cè)Hela細(xì)胞中蛋白細(xì)胞中蛋白A定位情況定位情況(qngkung)，思考應(yīng)選擇什么方法，思考應(yīng)選擇什么方法，用什么儀器觀(guān)察？用什么儀器觀(guān)察？A第10頁(yè)/共17頁(yè)第十一頁(yè)，共17頁(yè)。疑難解答疑難解答一，缺乏一，缺乏(quf)染色染色 可能的原因可能的原因 無(wú)抗原無(wú)抗原 抗體失效抗體失效 固定不充分固定不充分 過(guò)度固定過(guò)度固定 抗原修復(fù)無(wú)效抗原修復(fù)無(wú)效 不兼容的二抗和一抗不兼容的二抗和一抗 漏用試劑或未按正確的順序漏用試劑或未按正確的順序 加入試劑加入試劑相應(yīng)的措施相應(yīng)的措施 用原位雜交方法檢測(cè)蛋白表達(dá)用原位雜交方法檢測(cè)蛋白表達(dá) 按說(shuō)明書(shū)儲(chǔ)存

7、抗體按說(shuō)明書(shū)儲(chǔ)存抗體;分裝抗體分裝抗體;避免反復(fù)凍融避免反復(fù)凍融 增加固定時(shí)間或改用不同的固定劑增加固定時(shí)間或改用不同的固定劑 減少固定時(shí)間減少固定時(shí)間;抗原修復(fù)抗原修復(fù) 增加修復(fù)時(shí)間或更換修復(fù)液增加修復(fù)時(shí)間或更換修復(fù)液 使用可以與一抗結(jié)合的二抗使用可以與一抗結(jié)合的二抗 重復(fù)染色并確定使用的試劑和加入的順序重復(fù)染色并確定使用的試劑和加入的順序第11頁(yè)/共17頁(yè)第十二頁(yè)，共17頁(yè)。二，高背景二，高背景(bijng)第12頁(yè)/共17頁(yè)第十三頁(yè)，共17頁(yè)。 可能的原因可能的原因 一抗或二抗的濃度過(guò)高一抗或二抗的濃度過(guò)高 一抗和一抗和/或二抗與組織的或二抗與組織的 非特異性結(jié)合非特異性結(jié)合 組織過(guò)于干

8、燥組織過(guò)于干燥 試劑粘附在舊的試劑粘附在舊的 或未制備好的玻片上或未制備好的玻片上相應(yīng)的措施相應(yīng)的措施預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索最佳濃度預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索最佳濃度一抗孵育前封閉一抗孵育前封閉 (最好是二抗來(lái)源的血清最好是二抗來(lái)源的血清)在染色過(guò)程中避免組織干燥在染色過(guò)程中避免組織干燥用新鮮制備或購(gòu)買(mǎi)的玻片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)用新鮮制備或購(gòu)買(mǎi)的玻片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)第13頁(yè)/共17頁(yè)第十四頁(yè)，共17頁(yè)。三，細(xì)胞三，細(xì)胞/組織的形態(tài)組織的形態(tài)(xngti)被被破壞破壞第14頁(yè)/共17頁(yè)第十五頁(yè)，共17頁(yè)。 可能的原因可能的原因 抗原修復(fù)方法過(guò)于劇烈抗原修復(fù)方法過(guò)于劇烈 組織切片從玻片上脫落組織切片從玻片上脫落 組織切片撕裂或褶皺組織切片撕裂或

9、褶皺,切片下有氣泡切片下有氣泡 組織形態(tài)難以分辨組織形態(tài)難以分辨 組織固定不充分組織固定不充分,自發(fā)裂解自發(fā)裂解 相應(yīng)的措施相應(yīng)的措施 預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索合適的修復(fù)條件預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索合適的修復(fù)條件 增加固定時(shí)間增加固定時(shí)間;烤片烤片; 使用新鮮準(zhǔn)備的帶有充足電荷的玻片使用新鮮準(zhǔn)備的帶有充足電荷的玻片 使用鋒利的刀片使用鋒利的刀片;分析時(shí)避開(kāi)受損的區(qū)域分析時(shí)避開(kāi)受損的區(qū)域 切片薄一些切片薄一些;冰凍過(guò)程形成冰晶冰凍過(guò)程形成冰晶,蔗糖脫水蔗糖脫水 及時(shí)固定及時(shí)固定;增加固定時(shí)間增加固定時(shí)間; 提高固定劑提高固定劑/組織的比例組織的比例; 將組織切得較小將組織切得較小第15頁(yè)/共17頁(yè)第十六頁(yè)，共17頁(yè)。四，染色四，染色(rns)不正確不正確 可能的原因可能的原因 固定方法對(duì)于抗原不合適固定方法對(duì)于抗原不合適 抗原修復(fù)方法不合適抗原修復(fù)方法不合適 沒(méi)有及時(shí)固定引起抗原的擴(kuò)散沒(méi)有