KRAS和EGFR檢測(cè)與臨床應(yīng)用ppt課件

1、整理課件KRAS和和EGFR檢測(cè)與臨床應(yīng)用檢測(cè)與臨床應(yīng)用整理課件匯報(bào)內(nèi)容匯報(bào)內(nèi)容KRAS和和EGFR的簡(jiǎn)介及臨床意義的簡(jiǎn)介及臨床意義ARMS-PCR的基本原理和技術(shù)特點(diǎn)的基本原理和技術(shù)特點(diǎn)等位特異性引物設(shè)計(jì)等位特異性引物設(shè)計(jì)KRAS試劑盒開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)介試劑盒開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)介整理課件KRAS和和EGFR的簡(jiǎn)介及臨床意義的簡(jiǎn)介及臨床意義整理課件KRAS背景背景KRAS是一種原癌基因，長(zhǎng)約是一種原癌基因，長(zhǎng)約35kb，位于，位于12號(hào)染色體，是號(hào)染色體，是RAS基因基因家族成員之一，編碼的蛋白主要參與家族成員之一，編碼的蛋白主要參與PI3K、PTEN、AKT和和RAF、MEK、ERK信號(hào)通路的調(diào)控；信號(hào)通路的調(diào)控

2、；EGFR在通路中位于在通路中位于KRAS上游，配體與之結(jié)合后可以激發(fā)其酪氨酸上游，配體與之結(jié)合后可以激發(fā)其酪氨酸激酶活性，導(dǎo)致激酶活性，導(dǎo)致KRAS的活化和通路中信號(hào)傳導(dǎo)；的活化和通路中信號(hào)傳導(dǎo)；KRAS是許多惡性腫瘤的常見(jiàn)突變基因：胰腺癌（是許多惡性腫瘤的常見(jiàn)突變基因：胰腺癌（65%-90%）、結(jié)直）、結(jié)直腸癌（腸癌（40%）、肺癌（）、肺癌（20%）、卵巢癌（）、卵巢癌（15%）。）。整理課件KRAS基因突變影響結(jié)直腸癌藥物療效基因突變影響結(jié)直腸癌藥物療效KRAS基因野生型的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者能從基因野生型的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者能從EGF抗體（抗體（西妥昔單抗西妥昔單抗、帕尼單抗、帕尼單抗

3、）治療中獲益，而基因突變的患者治療效果很差；）治療中獲益，而基因突變的患者治療效果很差；KRAS突變型患者對(duì)西妥昔單抗無(wú)應(yīng)答，其總體生存期明顯低于突變型患者對(duì)西妥昔單抗無(wú)應(yīng)答，其總體生存期明顯低于KRAS野生型患者野生型患者Karapetis CS, 2008, N Eng J Med整理課件結(jié)直腸癌患者檢測(cè)結(jié)直腸癌患者檢測(cè)KRAS突變相關(guān)指南突變相關(guān)指南歐洲藥品評(píng)估局（歐洲藥品評(píng)估局（EMEA，2008）指出：）指出：KRAS野生型的進(jìn)展期結(jié)直腸癌患者可能從野生型的進(jìn)展期結(jié)直腸癌患者可能從帕尼單抗中受益，而突變型患者受益較少。帕尼單抗中受益，而突變型患者受益較少。美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（美國(guó)臨床腫

4、瘤學(xué)會(huì)（ASCO，2009）推薦：）推薦：轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者應(yīng)檢測(cè)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者應(yīng)檢測(cè)KRAS突變，突變，如有如有KRAS12、13位突變，則不應(yīng)進(jìn)行位突變，則不應(yīng)進(jìn)行EGFR單克隆抗體治療；單克隆抗體治療；美國(guó)美國(guó)FDA指南推薦：在使用靶向藥物西妥昔單抗和帕尼單抗治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌前指南推薦：在使用靶向藥物西妥昔單抗和帕尼單抗治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌前必須檢測(cè)必須檢測(cè)KRAS基因的基因型；基因的基因型；2012年年7月月6日批準(zhǔn)第一個(gè)用于結(jié)直腸癌的基因檢測(cè)（日批準(zhǔn)第一個(gè)用于結(jié)直腸癌的基因檢測(cè)（Qiagen），以判斷西妥昔單抗是否有效；，以判斷西妥昔單抗是否有效；美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（美國(guó)國(guó)

5、立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN，2014）指南說(shuō)：）指南說(shuō)：轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者均應(yīng)進(jìn)行轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者均應(yīng)進(jìn)行RAS突變檢測(cè)（突變檢測(cè)（KRAS和和NRAS），至少應(yīng)檢測(cè)），至少應(yīng)檢測(cè)KRAS第二外顯子的突變情況第二外顯子的突變情況。KRAS或或NRAS突變型的病人不應(yīng)采取西妥昔單抗或帕尼單抗治療。突變型的病人不應(yīng)采取西妥昔單抗或帕尼單抗治療。中國(guó)衛(wèi)生部于中國(guó)衛(wèi)生部于2010年年10月月14日發(fā)表了結(jié)直腸癌診療規(guī)范（日發(fā)表了結(jié)直腸癌診療規(guī)范（2010版）版） 。明確指出。明確指出在患者確定為復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌接受在患者確定為復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌接受西妥昔單抗西妥昔單抗、帕尼單抗時(shí)，必須檢測(cè)腫瘤組

6、、帕尼單抗時(shí)，必須檢測(cè)腫瘤組織的織的K-ras基因狀態(tài)。在晚期基因狀態(tài)。在晚期/轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌化療中，在治療前檢測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌化療中，在治療前檢測(cè)腫瘤 K-ras 基因基因狀態(tài)，狀態(tài)，EGFR不推薦作為常規(guī)檢查項(xiàng)目。不推薦作為常規(guī)檢查項(xiàng)目。整理課件KRAS基因突變影響非小細(xì)胞肺癌基因突變影響非小細(xì)胞肺癌藥物療效藥物療效KRAS基因野生型的非小細(xì)胞肺癌患者能從小分子酪氨酸激酶抑制劑（基因野生型的非小細(xì)胞肺癌患者能從小分子酪氨酸激酶抑制劑（TKI，如，如吉吉非替尼、厄洛替尼非替尼、厄洛替尼）治療中獲益，而基因突變的患者易發(fā)生抵抗；）治療中獲益，而基因突變的患者易發(fā)生抵抗； KRASKRAS突

7、變型患者使用厄洛替尼聯(lián)合化療后，其無(wú)癥狀生存期和總生存期明顯低于野生型患者（圖中突變型患者使用厄洛替尼聯(lián)合化療后，其無(wú)癥狀生存期和總生存期明顯低于野生型患者（圖中紅線所示）紅線所示）Anderson SM, 2011, Expert Rev. Mol. Diagn Eberhard DA, 2005, J Clin Oncol 整理課件非小細(xì)胞肺癌患者檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者檢測(cè)KRAS突變突變相關(guān)指南相關(guān)指南美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN，2009）指出，）指出，KRAS突變與非小細(xì)突變與非小細(xì)胞肺癌患者胞肺癌患者TKI抵抗有關(guān)，抵抗有關(guān)，KRAS基因測(cè)序有助于確定哪些病人

8、適合基因測(cè)序有助于確定哪些病人適合TKI治療。治療。當(dāng)當(dāng)KRAS基因發(fā)生了突變，則不建議病人使用厄洛替尼進(jìn)基因發(fā)生了突變，則不建議病人使用厄洛替尼進(jìn)行分子靶向治療。行分子靶向治療。整理課件KRAS主要突變位點(diǎn)主要突變位點(diǎn)在結(jié)直腸癌中，在結(jié)直腸癌中，KRAS突變主要發(fā)生于突變主要發(fā)生于codon12 (80%)、codon13 (15-20%)、codon61和和146 (C6239G719S182155GA6252G719C182155GT6253E746-A750del(1)192235-2249del156223E746-A750del(2)192236-2250del156225L747

9、-P753S192240-2257del1812370E746-A750I192235-2252AAT(complex)13551E746-A750del192235-2253del1812728E746-A750A192237-2251 del1512678E746-S752A192237-2254 del1812367E746-S752V192237-2250 T(complex)12384E746-S752D192238-2255 del186220L747-A750P192238-2248 GC(complex)12422L747-T751Q192238-2252 GCA(comple

10、x)12419L747-E749del192239-2247del96218L747-T751del192239-2253del156254L747-S752del192239-2256del186255L747-A750P192239-2248TTAAGAGAAG C12382L747-P753Q192239-2258CA(complex)12387L747-T751S192240-2251del126210L747-T751del192240-2254del1512369L747-T751P192239-2251 C(complex)12383T790M202369C T6240S768I

11、202303GT6241V769-D770insASV202307-2308 ins GCCAGCGTG12376H773-V774insH202319-2320 ins CAC12377D770-N771insG202310-2311 ins GGT12378L858R212573TG6224L861Q212582TA6213整理課件EGFR突變與突變與EGFR-TKI藥物療效關(guān)藥物療效關(guān)系系所在外顯子所在外顯子突變類型突變類型與與EGFR-TKI療效關(guān)系療效關(guān)系18G719A(S/C)3種點(diǎn)突變種點(diǎn)突變藥敏突變藥敏突變1919種缺失突變種缺失突變藥敏突變藥敏突變20點(diǎn)突變點(diǎn)突變S768I藥

12、敏突變藥敏突變20點(diǎn)突變點(diǎn)突變T790M耐藥突變耐藥突變*203種插入突變種插入突變耐藥突變耐藥突變*21點(diǎn)突變點(diǎn)突變L858R藥敏突變藥敏突變21點(diǎn)突變點(diǎn)突變L861Q藥敏突變藥敏突變整理課件ADx EGFR試劑盒突變結(jié)果檢測(cè)試劑盒突變結(jié)果檢測(cè)組別組別突變類型突變類型所占比例所占比例對(duì)吉非替尼對(duì)吉非替尼敏感性敏感性證據(jù)證據(jù) 1Exon 19 deletions; L858R 90%充分充分2T790M/deletion; T790M/L858R; G719X; L861Q; S768I 7%有限有限3T790M alone; Exon 20 insertions; other mutatio

13、ns 3%無(wú)無(wú)整理課件ARMS-PCR的基本原理和技術(shù)特點(diǎn)的基本原理和技術(shù)特點(diǎn)整理課件ARMS-PCR原理原理ARMS是是Amplification Refractory Mutation System (擴(kuò)增阻礙突擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)變系統(tǒng))的縮寫(xiě)。的縮寫(xiě)。根據(jù)根據(jù) PCR過(guò)程中要求引物和模板間的嚴(yán)格互補(bǔ)配對(duì)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)突變位過(guò)程中要求引物和模板間的嚴(yán)格互補(bǔ)配對(duì)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)突變位點(diǎn)的檢測(cè)點(diǎn)的檢測(cè), 當(dāng)引物當(dāng)引物 3 末端出現(xiàn)錯(cuò)配時(shí)末端出現(xiàn)錯(cuò)配時(shí), 產(chǎn)物將不能延伸。產(chǎn)物將不能延伸。因此設(shè)計(jì)兩條上游（或下游）引物，因此設(shè)計(jì)兩條上游（或下游）引物，使其使其3末端分別與突變位點(diǎn)堿基末端分別與突變位點(diǎn)堿基匹配和錯(cuò)

14、配匹配和錯(cuò)配，共用下游（或上游）引物，分別擴(kuò)增野生型和突變型目，共用下游（或上游）引物，分別擴(kuò)增野生型和突變型目的片斷。的片斷。整理課件ARMS-PCR原理原理Two Allele-Specific (AS) primers, one for each allele of a SNP are designed. The AS primers contain one of two polymorphic nucleotides at the primer 3 end. Two sets of primers, either forward or reverse primers can be de

15、signed. If a common reverse or forward primer is used in a PCR reaction, the reaction is called allele-specific PCR (AS-PCR). You F. M. 2008, BMC Bioinformatics整理課件PCR產(chǎn)物檢測(cè)產(chǎn)物檢測(cè)-Real time PCR每個(gè)每個(gè)PCR循環(huán)循環(huán)檢測(cè)熒光信號(hào)檢測(cè)熒光信號(hào)，不同不同PCR產(chǎn)物，不同熒光信號(hào)產(chǎn)物，不同熒光信號(hào)相比凝膠電泳：更快，可定量，無(wú)相比凝膠電泳：更快，可定量，無(wú)PCR產(chǎn)物污染產(chǎn)物污染信號(hào)產(chǎn)生方法：信號(hào)產(chǎn)生方法：Scorpio

16、n (Qiagen)，雙環(huán)探針，雙環(huán)探針(廈門(mén)艾德廈門(mén)艾德)，Taqman，Molecular beacons，Sybr green，Yo-proFigure 2 The sensitivity of QuanTAS-PCR for quantifying JAK2 mutant alleles.Zapparoli G. V. 2013, BMC Cancer整理課件應(yīng)用于應(yīng)用于Real time-PCR的的ARMS-PCRGCATGAAGG alleleA allele55553333AS primerAS primerMismatchMismatchReverse primerRevers

17、e primerFAM-53-BHQ1FAM-53-BHQ1ProbeProbe整理課件ARMS技術(shù)特點(diǎn)技術(shù)特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高靈敏度高（0.1-1%）操作簡(jiǎn)便操作簡(jiǎn)便周期短周期短不產(chǎn)生不產(chǎn)生PCR產(chǎn)物污染產(chǎn)物污染適用樣本類型多適用樣本類型多（如（如FFPE）精確突變類型精確突變類型缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：方法建立需時(shí)較長(zhǎng)方法建立需時(shí)較長(zhǎng)僅能檢測(cè)已知突變僅能檢測(cè)已知突變整理課件測(cè)序法與測(cè)序法與ARMS法相比較法相比較Sanger測(cè)序法測(cè)序法焦磷酸測(cè)序焦磷酸測(cè)序ARMS敏感度敏感度10-20%5-10%1%FFPE標(biāo)本成功率標(biāo)本成功率 低低較高較高高高商用試劑盒商用試劑盒無(wú)無(wú)有有有有流程與速度流程與速度

18、1-2天天2-3天天AGTGly13SerGGCAGCGly12ArgGGTCGTGly13ArgGGCCGCGly12CysGGTTGTGly13CysGGCTGCGly12AspGGTGATGly13AspGGCGACGly12AlaGGTGCTGly13AlaGGCGCCGly12ValGGTGTTGly13ValGGCGTC整理課件三引物設(shè)計(jì)原理三引物設(shè)計(jì)原理You F. M. 2008, BMC Bioinformatics整理課件三引物設(shè)計(jì)三引物設(shè)計(jì)ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGC

19、TAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG野生型引物（野生型引物（F）5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTG-3 19nt，51突變型引物（突變型引物（F）5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTA-319nt，49下游引物（下游引物（R）5-CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-325nt，54整理課件三引物設(shè)計(jì)三引物設(shè)計(jì)下游引物設(shè)計(jì)下游引物設(shè)計(jì)ATGACTGAATATAAACTT

20、GTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG選擇序列選擇序列： 5-GACGAATATGATCCAACAATAGAGG-3互補(bǔ)鏈：互補(bǔ)鏈：3- CTGCTTATACTAGGTTGTTATCTCC-5下游引物：下游引物：5- CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC -3整理課件3端增加錯(cuò)配端增加錯(cuò)

21、配如果如果3端是弱錯(cuò)配（端是弱錯(cuò)配（C/A或或G/T）則需要引入強(qiáng)的錯(cuò)配（）則需要引入強(qiáng)的錯(cuò)配（A/G或或C/T）才可阻斷才可阻斷3端的擴(kuò)增；端的擴(kuò)增；如果如果3端是強(qiáng)錯(cuò)配（端是強(qiáng)錯(cuò)配（A/G或或C/T）則需要引入弱的錯(cuò)配（）則需要引入弱的錯(cuò)配（C/A或或G/T）或不需引入錯(cuò)配即可阻斷或不需引入錯(cuò)配即可阻斷3端的擴(kuò)增；端的擴(kuò)增；當(dāng)當(dāng)3端是中度錯(cuò)配（端是中度錯(cuò)配（A/A，C/C，G/G 或或T/T）則需要引入中度的錯(cuò)配）則需要引入中度的錯(cuò)配。野生型引物（野生型引物（F）5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTG-3 突變型引物（突變型引物（F）5-CTTGTGGTAGTTGGAGCCT-3下游引

22、物（下游引物（R）5-CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-3整理課件四引物設(shè)計(jì)四引物設(shè)計(jì)整理課件四引物設(shè)計(jì)四引物設(shè)計(jì)ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG內(nèi)引物（內(nèi)引物（F）5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTA-3 內(nèi)引物（內(nèi)引物（R）5-AC

23、TCTTGCCTACGCCACC-3外引物（外引物（F）5-ATGACTGAATATAAACT-3外引物（外引物（R）5-CTCTTGACCTGCTGTGTCG-3整理課件KRAS試劑盒開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)介試劑盒開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)介整理課件KRAS突變探針和引物設(shè)計(jì)突變探針和引物設(shè)計(jì)KRAS序列：序列：ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGG

24、ATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG1. 5-CTT GTG GTA GTT GGA GCT TA-3 12GGT GAT 2. 5- AAA CTT GTG GTA GTT GGA GCG GT-3 12GGT GTT3. 5- AA CTT GTG GTA GTT GGA GCT GC-3 12GGT GCT4. 5- ATAAA CTT GTG GTA GTT GGA GCT A-3 12GGT AGT5. 5- AA CTT GTG GTA GTT GGA GCG T-3 12GGT TGT6. 5- ATAAA CTT GTG GTA GTT GGA GCC C-3

25、12GGT CGT7. 5- GTG GTA GTT GGA GCT GGT AA-3 13GGC GAC8. 參照引物：參照引物：5-CT GAA TAT AAA CTT GTG GTA GTT-39. 下游引物：下游引物：5-ACCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-3 TaqMan探針：探針：5-FAM-TCTGAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-BHQ1-3鎖核酸阻滯探針鎖核酸阻滯探針(野生型野生型)： 5-T GGA GCT GGT GGC GTA GGC-P04-3浙江大學(xué)，浙江大學(xué)，CN 102367478 B整理課件反應(yīng)體系反應(yīng)體系 引物終濃度：引物終濃度：0.3 M Taqman探針終濃度：探針終濃度：0.1 M LNA阻滯探針終濃度：阻滯探針終濃度：0.9 M Goldstarbest Taq酶終濃度：酶終濃度：0.05 U/l 模板模板DNA終濃度：終濃度：10-300 ng/