質(zhì)粒DNA的提取、酶切及其瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)報(bào)告(共7頁(yè))

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上實(shí)驗(yàn)序號(hào)實(shí)驗(yàn)名稱質(zhì)粒DNA的提取、酶切及其瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)時(shí)間是否小組合作是（） 否（ ）一實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)1實(shí)驗(yàn)?zāi)康模海?）通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)和掌握堿裂解法提取質(zhì)粒；（2）通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的方法和技術(shù)；2實(shí)驗(yàn)原理： 1）質(zhì)粒DNA的提取：（1）關(guān)于質(zhì)粒：質(zhì)粒是一類存在于幾乎所有細(xì)菌中染色體之外（細(xì)胞質(zhì)中）呈游離狀態(tài)的雙鏈、閉環(huán)的DNA分子。質(zhì)粒通常攜帶有染色體上所不存在的能夠表達(dá)產(chǎn)生抗生素、耐受重金屬等重要性狀的基因。細(xì)菌質(zhì)粒的大小范圍從1kb至200kb以上不等，且擁有自己的復(fù)制起始位點(diǎn)，可不依賴于染色體而進(jìn)行獨(dú)立自主復(fù)制。一些小的質(zhì)粒利用宿主細(xì)胞

2、的酶進(jìn)行復(fù)制，而較大的質(zhì)粒則自身攜有復(fù)制與編碼的有關(guān)酶。（2）一般分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個(gè)步驟：培養(yǎng)細(xì)菌，使質(zhì)粒DNA大量擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)菌；分離和純化質(zhì)粒DNA。分離制備質(zhì)粒DNA的方法很多，其中常用的方法有堿裂解法、煮沸法、SDS法、羥基磷灰石層析法等。在實(shí)際操作中可以根據(jù)宿主菌株類型、質(zhì)粒分子大小、堿基組成和結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)以及質(zhì)粒DNA的用途進(jìn)行選擇。（3）堿裂解法提取大腸桿菌質(zhì)粒DNA的原理：堿裂解法提取質(zhì)粒DNA是根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA和線性染色體DNA在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來(lái)分離質(zhì)粒DNA。在pH值介于12.012.5這個(gè)狹窄的范圍內(nèi)，線性的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)而變性，盡管在這樣

3、的條件下，共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA的氫鍵會(huì)被斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈彼此相互盤繞，仍會(huì)緊密地結(jié)合在一起。當(dāng)加入pH4.8乙酸鉀高鹽緩沖液恢復(fù)pH至中性時(shí)，共價(jià)閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA的兩條互補(bǔ)鏈仍保持在一起，因此復(fù)性迅速而準(zhǔn)確；而線性的染色體DNA的兩條互補(bǔ)鏈彼此已完全分開(kāi)，因復(fù)性較緩慢且不準(zhǔn)確而相互纏繞形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。而復(fù)性的質(zhì)粒DNA恢復(fù)原來(lái)構(gòu)型，保持可溶性狀態(tài)。通過(guò)離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)而被除去，最后用酚氯仿可以抽提純化上清液中的質(zhì)粒DNA。2）質(zhì)粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳：（1）關(guān)于電泳技術(shù)：電泳常用于分離和純化那些分子大小、電荷性狀或分個(gè)構(gòu)象有

4、所不同的生物大分子尤其是蛋白質(zhì)和核酸。正因?yàn)槿绱耍娪疽殉蔀樯锘瘜W(xué)和分子生物學(xué)中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)之一，其中在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中最為常用的是瓊脂糖凝膠電泳。瓊脂糖是一種海藻多糖，瓊脂糖膠分離范圍很大，但其分辨率卻相對(duì)較低。通過(guò)改變瓊脂糖凝膠的濃度，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的電泳技術(shù)可以分離200到50,000 bp 大小的 DNA 片斷。一般瓊脂糖膠濃度在0.5到4之間，且瓊脂糖凝膠濃度越大，凝膠就越硬。較高濃度的瓊脂糖膠有利于較小的DNA片斷分離，而較低濃度的瓊脂糖膠則可以分離較大的DNA片斷。（2）瓊脂糖凝膠電泳條帶的觀察：通過(guò)觀察示蹤染料的遷移距離可以判斷DNA的遷移距離。溴酚藍(lán)染料在瓊脂糖凝膠的遷移速

5、率大小與300和4000bp大小的雙鏈DNA片斷相同。當(dāng)遷移足夠距離后，就可以通過(guò)Gelview染色來(lái)觀察DNA片斷。Gelview是一種熒光染料。它可以在做膠時(shí)混入其中在電泳時(shí)進(jìn)行染色，也可以待電泳完成后將凝膠浸泡在稀釋的Gelview 溶液中進(jìn)行染色 。但必須將凝膠置于紫外透射儀中才可以對(duì)凝膠中的DNA或RNA進(jìn)行觀察。（3）質(zhì)粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳分離：DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液環(huán)境中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)，由于磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以相同的速度向正極移動(dòng)。在一定

6、的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的構(gòu)型和大小。具有不同分子質(zhì)量或者不同構(gòu)型的DNA分子泳動(dòng)速率不一樣，可以進(jìn)行分離。未切割的質(zhì)粒DNA在其泳道上也許會(huì)出現(xiàn)幾個(gè)條帶，之所以這樣是由于質(zhì)粒DNA在瓊脂糖凝膠中的遷移距離是由其分子構(gòu)象及其堿基對(duì)大小所決定的。質(zhì)粒DNA以下列三種主要構(gòu)象中的任何一種形式存在： 超螺旋DNA：盡管質(zhì)粒通常以開(kāi)環(huán)的形式進(jìn)行描述，然而在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)DNA鏈即是盤繞在組蛋白周圍形成一種致密的結(jié)構(gòu)。這就是所謂超螺旋結(jié)構(gòu)，由于其結(jié)構(gòu)致密，它在凝膠中的泳動(dòng)速度最快。 線性DNA：當(dāng)DNA損傷在DNA雙鏈相對(duì)應(yīng)的兩條鏈上同時(shí)產(chǎn)生切口時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)線性質(zhì)

7、粒DNA，這種DNA的泳動(dòng)速率介于超螺旋與切口質(zhì)粒DNA之間。開(kāi)環(huán)DNA：在質(zhì)粒DNA復(fù)制過(guò)程中，拓?fù)洚悩?gòu)酶I會(huì)在DNA雙螺旋中的一條鏈中引入一個(gè)切口，解開(kāi)質(zhì)粒的超螺旋。在質(zhì)粒分離過(guò)程中由于物理剪切和酶的切割作用同樣也會(huì)在超螺旋質(zhì)粒中引入切口從而產(chǎn)生松散的開(kāi)環(huán)結(jié)構(gòu)。這種形式的質(zhì)粒遷移速率最慢，其“松散”的分子形式阻礙了它在瓊脂糖凝膠中的運(yùn)動(dòng)。3 實(shí)驗(yàn)器材：（1）實(shí)驗(yàn)儀器（apparatus）：恒溫培養(yǎng)箱（Constant temperature incubator）、恒溫?fù)u床（Constant temperature shaking table）、高速離心機(jī)（High speed centri

8、fuge）、漩渦振蕩器（Vortex mixer）、超凈工作臺(tái)（Bechtop）、高壓滅菌鍋（Autoclave）、微量加樣器（Pipettes）、燒杯（ beaker）、量筒 （graduated cylinder）、 玻璃棒（stir bar）、 微波爐（microwave）、 天平（Pan balance）、電泳梳子（ comb）、電泳槽 （electrophoresis tank）、 電泳器 （Electro-phoresis System）、 紫外燈（Ultraviolet transilluminator ）3）、材料與試劑（Reagents）：溶液I（Solution ）：50m

9、mol/L 葡萄糖；25mmol/L 三羥基甲基氨基甲烷（Tris）Tris-HCl（pH8.0）；10mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA） pH8.0溶液I可成批配制，每瓶約100ml，10磅高壓蒸氣滅菌15分鐘，貯存于4。溶液（Solution ）：新鮮配制，等體積混合0.2mol/L NaOH（臨用前用10mol/L貯存液現(xiàn)用現(xiàn)稀釋）；1% SDS （可用10貯存液稀釋配制）注意：SDS易產(chǎn)生氣泡，不要?jiǎng)×覕嚢?。溶液III （Solution ，100mL)：加上后混勻會(huì)形成絮狀沉淀60mL 5mol/L KAc，11.5mL 冰醋酸，28.5mL H2O （該溶液鉀離子濃度為3mol

10、/L，醋酸根離子濃度為5mol/L）TE液緩沖液：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）；1 mmol/L EDTA（pH8.0）70% 乙醇；平衡酚：氯仿 1：1：將量取25 ml Tris-HCl（pH8.0）平衡苯酚，加入24 ml 氯仿和 1 ml 異戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4保存。LB培養(yǎng)基：胰化蛋白胨 10g酵母提取物 5gNaCl 15gpH 7.0瓊脂糖（Agarose）；1 liter（升）5×TBE備用溶液（stock solution）：54g tris base，27.5g 硼酸（boric acid），20ml 0.5 mol/L E

11、DTA , pH 8.0；6×凝膠加樣緩沖液：0.25% 溴酚藍(lán)（bromophenol blue），40% 蔗糖（sucrose in water）；另外還有的試劑是：胰RNA酶、DNA Marker、硼酸、Gelview試劑（2）實(shí)驗(yàn)材料：含有pUC19質(zhì)粒的大腸桿菌等。4實(shí)驗(yàn)方法步驟及注意事項(xiàng)1）實(shí)驗(yàn)方法步驟第一部分：質(zhì)粒DNA的提取及酶切（1）取1.4 ml含pUC19這里的大腸桿菌培養(yǎng)物于1.5 ml微量離心管中，4 000 r/min 離心2分鐘，吸去上清液，并使細(xì)胞沉淀盡可能干燥；（2）加100 ml 溶液懸浮細(xì)菌沉淀，充分混和均勻，室溫放置10 min；（3）加200

12、 ml溶液 （新鮮配制），蓋緊管口，輕緩上下4-6次顛倒離心管以混合內(nèi)容物。將離心管靜置冰上5 min（使溶液變透明，粘稠）；（4）加200 ml溶液 （事先冰上預(yù)冷），蓋緊離心管口后上下輕緩顛倒4-6次，置冰上15 min (溶液出現(xiàn)白色沉淀)；（5）12 000 rpm離心15 min，轉(zhuǎn)移上清液至另一離心管（棄沉淀）；（6）向上清液中加入等體積的酚：氯仿（1：1），反復(fù)混勻，12 000 rpm離心5min，取上清液移至另一離心管中；（7）加2倍體積無(wú)水乙醇，振蕩混勻，靜置10 min，12000 rpm離心510 min。棄上清液，將離心管倒置于吸水紙，將附于管壁的殘余液滴除凈。（8）

13、加200 ml 70乙醇洗滌沉淀物，12000 rpm離心2 min，棄上清液，將沉淀在室溫下晾干（或在5060的烘箱中也可）。（9）沉淀加20l TE, 反復(fù)吹打使質(zhì)粒DNA充分溶解，20保存。第二部分：質(zhì)粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳. 凝膠的制備（Preparation of the gel）（1） 制備1瓊脂糖凝膠：稱取0.5g瓊脂糖，放人錐形瓶中，加入50mL的 0.5×TBE 緩沖液，放入微波爐加熱至完全溶化，則為0.5瓊脂糖凝膠液（由于蒸發(fā)作用，溶解前在容量瓶上作一個(gè)記號(hào)，溶解后用三蒸水補(bǔ)足）；(2）制膠器的安裝：取多功能制膠器，洗凈，晾干；將多功能制膠器放置于一水平位置，選

14、擇12×6cm制膠架，然后選擇1.5mm 18teeth的梳子（最大加樣量25µl）；將所選擇規(guī)格的梳子插入制膠架的定位槽中；（3）將熔化的瓊脂糖凝膠液轉(zhuǎn)入Gelview專用的三角瓶中，然后加入Gelview 5µl；（4）將冷到60左右的瓊脂糖凝膠液，緩緩倒入所選擇的制膠槽內(nèi)，直至有機(jī)玻璃板上形成一層均勻的膠面(注意不要形成氣泡)；（5）待膠凝固后（30-60min），輕輕拔掉梳子，將凝膠盤從制膠槽中取出，放入電泳槽內(nèi)；（6）加入電泳緩沖液(0.5×）至電泳槽中；. 加樣(Loading DNA samples)：用移液槍緩慢將DNA樣品及其經(jīng)過(guò)酶切的

15、質(zhì)粒DNA樣品垂直加入加樣孔直至開(kāi)口下方（記錄點(diǎn)樣順序，以便作為對(duì)照和分析），各加樣量如下：DNA samples ：15µl 酶切的DNA樣品：3µl Loading buffer： 2µl DNA markers ：6µl （DNA samples與Loading buffer總共加入20µl）. 電泳（Gel）：（1）接通電泳槽與電泳儀的電源(注意正負(fù)極，DNA片段從負(fù)極向正極移動(dòng))。保持電壓 120V；（2）當(dāng)溴酚藍(lán)染料移動(dòng)到凝膠總長(zhǎng)度一半處時(shí)，停止電泳；. Gel Interpretation （凝膠圖像解釋）：將電泳后的凝膠放在紫外

16、燈的照射下進(jìn)行DNA電泳條帶的觀察，并用凝膠電泳成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照、分析。2）注意事項(xiàng)（1） 加溶液I后，必須要將菌體懸浮徹底，不得有塊狀或大顆粒狀呈現(xiàn)，是質(zhì)粒DNA提取的首要關(guān)鍵；（2） TAE和TBE均為常用的緩沖液。TBE比TAE有相對(duì)高的緩沖能力。（3） 加樣染料溴酚藍(lán)可與長(zhǎng)度約為0.5 kb的DNA一起遷移，可用于指示遷移率最高的片段。（4） DNA的遷移速率取決于以下因素:DNA的分子大小分子量越小，遷移越快。瓊脂糖濃度濃度越低，遷移越快。DNA的構(gòu)象環(huán)狀的或帶切口環(huán)狀的DNA通常比線狀的DNA遷移要快。兩個(gè)電極之間單位厘米的電壓電壓越高，遷移越快。（5） 如果DNA條帶不夠窄且不夠

17、均勻，可能是內(nèi)以下原因所引起：DNA過(guò)載 電壓過(guò)高 加樣孔破損 凝膠中有氣泡（6） 在紫外燈下觀察凝膠電泳所得結(jié)果應(yīng)該戴上防護(hù)眼鏡，因?yàn)樽贤饩€對(duì)眼睛有傷害作用；二實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1 實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象與結(jié)果：將電泳后的凝膠放在紫外燈的照射下觀察到的和用凝膠電泳成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照得到的DNA電泳條帶圖如下所示意：圖注：x：代表經(jīng)過(guò)酶切的質(zhì)粒DNA樣品的電泳條帶； x ：代表未經(jīng)過(guò)酶切的質(zhì)粒DNA樣品的電泳條帶（x相同的互為對(duì)照組）； marker:DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物。pUC19質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)參照條帶圖像：2 對(duì)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析及其結(jié)論：（1） 對(duì)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的分析及其結(jié)論：從上述所示的DNA電泳條帶圖可以

18、看出：不管在DNA Sample中還是在經(jīng)過(guò)酶切處理后的DNA樣品中均具有電泳遷移速率處于中間的線性質(zhì)粒DNA。而在此次試驗(yàn)中出現(xiàn)線性質(zhì)粒DNA是因?yàn)閜Uc質(zhì)粒DNA在提取的過(guò)程中DNA雙鏈在相對(duì)應(yīng)的兩條鏈上同時(shí)產(chǎn)生切口。 這說(shuō)明質(zhì)粒制備過(guò)程個(gè)出現(xiàn)線性DNA說(shuō)明存在核酸酶污染或?qū)嶒?yàn)操作有問(wèn)題?？赡茉谄渲谢煊猩倭康牡鞍踪|(zhì)（圖中，位置在marker組最后一電泳條帶后方的很可能就是蛋白質(zhì)組分），或者在實(shí)驗(yàn)的提取過(guò)程中加入溶液所經(jīng)歷的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，在堿性條件下基因組DNA片斷會(huì)慢慢斷裂，從而使提取的質(zhì)粒DNA樣品混入了基因組 DNA。但是其中各組也存在超螺旋DNA（與marker組對(duì)照，電泳速率最快，跑在

19、最前面的）。標(biāo)號(hào)為1、2和3組的電泳條帶存在開(kāi)環(huán)質(zhì)粒DNA（與marker組的最后一條帶相比較，同在一條水平線上且較亮的一條條紋即為開(kāi)環(huán)質(zhì)粒DNA），而且只出現(xiàn)在未經(jīng)過(guò)酶切的質(zhì)粒DNA Sample中， 這說(shuō)明在此次實(shí)驗(yàn)過(guò)程中酶切是徹底的。從總體上觀察，所有電泳條帶的亮度并不高，可能是提取的質(zhì)粒DNA量較少（濃度過(guò)低）或電泳前加樣量過(guò)少所致。（2）對(duì)實(shí)驗(yàn)分析及其結(jié)論：溶液的作用：懸浮大腸桿菌菌體，而且加溶液I后，必須要將菌體懸浮徹底，不得有塊狀或大顆粒狀呈現(xiàn)，是質(zhì)粒DNA提取的首要關(guān)鍵。且其中含有的溶霉菌可以水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的-1,4糖苷鍵，因而具有溶菌作用。另外葡萄糖的作

20、用是使懸浮后的大腸桿菌不會(huì)很快沉積到管子的底部，增加溶液的粘度，維持滲透壓及防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2+ 和Mg2+等二價(jià)金屬離子的螯合劑，在溶液 I中加入EDTA，是要把大腸桿菌細(xì)胞中的二價(jià)金屬離子都螯合掉，從而起到抑制 DNase對(duì)DNA的降解和抑制微生物生長(zhǎng)的作用。另外也可保證溶菌酶活性。溶液的作用：提供堿性條件，在NaOH與SDS的共同作用下使大腸桿菌瞬間裂解，并變性核DNA。當(dāng)細(xì)胞懸浮于NaOH和十二烷基酸鈉（SDS）溶液中使，在高pH（堿性環(huán)境）的作用下細(xì)胞發(fā)生裂解，此外蛋白質(zhì)和染色體DNA發(fā)生變性與細(xì)胞碎片一起沉淀下來(lái)。這是由于細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化。新配制的溶液避免作為最佳溶解細(xì)胞的試劑NaOH接觸空氣中的CO2過(guò)久而減弱了堿性。用不新鮮的0.4 M NaOH，即便有SDS也無(wú)法有效溶解大腸桿菌。因此必須使用新鮮的0.4 M NaOH試劑進(jìn)行配制。溶液的作用：該溶液所含有的高濃度鉀離子與溶液體系中的十二烷基硫酸鈉（即SDS與NaOH所形成的可溶性物質(zhì)）發(fā)生反應(yīng)形成十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsul