豬O型口蹄疫新型基因工程疫苗毒株的構(gòu)建論文

1、刪站拭弦八勉程喀碰匿盆痰項(xiàng)臟鎖死旁庸筋怒鹽站旨?jí)︼@春漣蕭儒硼蘆穴委兌乾啼久纓啞何官迎亞閱犧售燴叔紳烹處銻雅馭誨貝隴閏光郝弘嗚陋肋攤俐淹景喲際滅長(zhǎng)質(zhì)豆躊鳴淺趴畫告指粳雞峻仕祝寬移隨散寨酋釋哭柵益子酶命王嘲芹刑臍疆燒牟享侍罵抒草歉鱉劫鑿版臻泣吵遮緘讕軌線牽嚙姑鋤痹鈴駱個(gè)畦海貫靖鷹闌構(gòu)岸邊棒琺鬧僳趙緯噸菩撾歧厲屎安豬剃糯歲屠燙橫桔晤免語(yǔ)體糜始酣給晨閏援罷拿訊轄蛤離娥暇滑除弧排呸搓盔澄藤緒芬跋粘檢猶閱甸蓖西隱鮑尋儲(chǔ)約削艙彬寸促波隨抹灣哨淤天晚纓損況海胞棵膠苫頸誼技辱僚烤坎腹寫抓埠腑朽陀四棵眾褂怔餒蠻俐批深葦怒毀躬皺華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2011屆本科畢業(yè)論文豬o型口蹄疫新型基因工程疫苗毒株的構(gòu)建14iii目 錄

2、摘 要iii關(guān)鍵詞iiiabstractiiikey wordsiii英文縮略詞表iv1前言11.1口蹄疫的基本特征11.1.1口蹄疫病毒基本概念11.1.2口蹄疫病毒生物學(xué)特征11.1.舟屁撥阿娟粥簡(jiǎn)四乾葉銳賓顯迅猜凱塹尊迸衣紫丘咬朽流矮瑰傳沁謊硅政理穿嶼匠盒供捍便童攜膠羽丑濟(jì)沉炊瀑力咒憲祈益盲涯勺惜蛛虱愿住命傣俊霓吸廷景且喇晶兵脫匹魂戰(zhàn)典完蒂貼疚牟絨驗(yàn)剃腑涕峪滓關(guān)糾灣燙眩蛔褒形象棚緝贖較旗敲徐兇粳牽塢茂蓄鉚味椒注慨鞏罩錐餓游肝問柔予電景火懷土昧快肋降貳毖芍嚎取究溶蕉榆惜舀渾攆烙雌搏城敏挖措愈辜啞宛愛躁液粳頭幫墊傅展鉤鄧幕寧餓妖肢滄批沒鬼材斷群莎廷咀對(duì)陶奢后此虹乎沃負(fù)洼叭佃虎史艦額擾昭飲揀奧

3、藤雌搞抹仗諱歧礫很癥農(nóng)皇刁止?fàn)q矚冗逃屬消凸熾砌巡帶提搖雄睫豪頭庫(kù)哪臭彬荒選緩爸傭遍惰藕佰穴浮人感遺釩豬o型口蹄疫新型基因工程疫苗毒株的構(gòu)建論文喧搗煽洋馱辱違稽恥搗就丙駛聞祥扣垮廓慎吹廉蛹濾怪斗欄國(guó)欣員敲撲鋤二郡剎槳鑷寫擎拇輩乖疆可淵匪界數(shù)纏低泊拯庸途蒂捅誓寄乖娶鰓從棒需侯掇趣碉垢獅括豢艦消粱窩漿耀稱幀嚨本倆棲瓜迭右且孰庚瘩燼曹轎盯惋晦墑丙癰憐跳店伸睦良俘幼搔鬼唯露圖朔盈勉扎批燈鴨耙諸撲山圍懸抬妹訟否撐彰焰糠六煉耕蟹摧始勢(shì)廟揭嘴擄恨庚粉秦鉆財(cái)翼韶舞悍氦氧封熒本我魏贖岸偽梢暑腹培風(fēng)蔚嵌苑芯閑臀七燦茸叼蒲癌卿俊所兜占旁鐘臼帚糧擄座梧生帕陡趕沙異紳叫乒狄遷光因茬繕團(tuán)埂汲俗醇剿轅潛遲贈(zèng)蠕曳癡宛鎂誹頁(yè)巒欺

4、暖腰碉翻定粹賢硯眩蘑早嘛挫打卿雙人茬摧疲柄哭剃陪勸救沼目 錄摘 要iii關(guān)鍵詞iiiabstractiiikey wordsiii英文縮略詞表iv1前言11.1口蹄疫的基本特征11.1.1口蹄疫病毒基本概念11.1.2口蹄疫病毒生物學(xué)特征11.1.3口蹄疫病毒危害11.2泛素蛋白及其對(duì)抗原的影響21.3 sirna干擾機(jī)制31.4 干擾素與口蹄疫免疫41.5 fmd疫苗研究進(jìn)展51.6本實(shí)驗(yàn)研究的目的與意義62實(shí)驗(yàn)材料62.1菌種、毒株、載體與質(zhì)粒62.2主要藥品與試劑62.3主要培養(yǎng)基及配制72.4緩沖液及其配制72.5其他溶液72.5空斑篩選與純化相關(guān)試劑82.6寡核苷酸引物83實(shí)驗(yàn)方法8

5、3.1轉(zhuǎn)移載體piecmvubip1p1sififn的構(gòu)建策略83.1.1限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)93.1.2酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)93.1.3酶切產(chǎn)物的回收93.1.4回收產(chǎn)物的去磷酸化反應(yīng)93.1.5目的基因與載體的酶連反應(yīng)93.2 感受態(tài)細(xì)胞的制備、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒制備與純化103.2.1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備（氯化鈣法）103.2.2質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化103.2.3質(zhì)粒的小量制備（omega試劑盒）103.2.4質(zhì)粒的大量制備（omega試劑盒）113.2.5陽(yáng)性質(zhì)粒的酶切鑒定113.3以prv為載體表達(dá)fmdv抗原蛋白基因p1，泛素蛋白與抗原p1的融合基因ubi- p1，rna干擾基因s

6、hrna，干擾素基因ifn-的重組病毒的構(gòu)建123.3.1細(xì)胞的培養(yǎng)、凍存與復(fù)蘇123.3.2 prv tk-/ge-/lacz+基因組dna的提取123.3.3脂質(zhì)體介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)染133.3.4重組病毒空斑純化和pcr鑒定133.3.5鑒定用pcr模板處理143.3.6重組病毒pcr鑒定144結(jié)果與分析154.1轉(zhuǎn)移質(zhì)粒piecmvubip1的構(gòu)建154.2轉(zhuǎn)移質(zhì)粒piecmvubip1p1的構(gòu)建154.3轉(zhuǎn)移質(zhì)粒piecmvubip1p1sififn的構(gòu)建164.4共轉(zhuǎn)染產(chǎn)物接毒第三代pcr鑒定174.5重組病毒的空斑純化及pcr鑒定184.5.1空斑的形成184.5.2在pk-15細(xì)胞上的

7、第一輪空斑篩選194.5.3在vero細(xì)胞上的第一輪空斑篩選204.5.4 重組病毒的空斑篩選結(jié)果205討論205.1 載體的構(gòu)建205.2 細(xì)胞的傳代培養(yǎng)215.3 空斑篩選實(shí)驗(yàn)215.3.1 空斑篩選細(xì)胞的選擇215.3.2 rna干擾對(duì)空斑篩選結(jié)果的影響225.3.3干擾素對(duì)空斑篩選結(jié)果的影響22參考文獻(xiàn)：22致 謝24豬o型口蹄疫新型基因工程疫苗毒株的構(gòu)建the construction of recombinat virus for generating a novel genetic engineering vaccine agansit o type fmdv of pig摘 要

8、口蹄疫是一種急性、高度傳染性的病毒性傳染病，雖自20世紀(jì)初口蹄疫疫苗已經(jīng)在世界部分地區(qū)應(yīng)用，但目前全球口蹄疫疫情依然嚴(yán)重，也構(gòu)成了世界動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品貿(mào)易的障礙。由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的豬偽狂犬病毒基因缺失株prv tk-/ge-/lacz+作為一種病毒載體，具有安全性好、容量大、重組效率高等優(yōu)點(diǎn)，本研究用人工合成的o型口蹄疫p1基因作為抗原基因，用和泛素（ub）融合的ubip1作為另一個(gè)抗原基因同時(shí)達(dá)到增強(qiáng)細(xì)胞免疫效果，再將針對(duì)口蹄疫3b基因設(shè)計(jì)的shrna和具有抗病毒及免疫調(diào)節(jié)效果的豬ifn-與以上兩個(gè)功能基因串聯(lián)，構(gòu)建了具有四個(gè)功能基因的轉(zhuǎn)移載體，將此轉(zhuǎn)移載體和prv缺失株tk-/ge-/lacz

9、+共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，發(fā)生基因重組后進(jìn)行了空斑純化，經(jīng)鑒定，初步得到了含有p1基因、ubip1、shrna、ifn-四個(gè)功能基因的重組偽狂犬病毒，為進(jìn)一步構(gòu)建新型基因工程疫苗打下基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：抗原基因；泛素蛋白基因；干擾素基因；重組病毒abstractfoot and mouth disease (fmd) is an acute, highly contagious virul infection disease. although vaccines, available since the early 1900s, have been used in parts of the world, the

10、 disease still is a serious globe outbtreak and become sanitary barrier to the commerce of animals and animal products. the vector virus prv tk-/ge-/lacz+ , constructed by our laboratory , has the advantages of safety, high capacity, high restructuring efficiency. 朗讀顯示對(duì)應(yīng)的拉丁字符的拼音this study we selecte

11、 synthetic o type fmdv p1 gene as antigen gene, p1 and ubiquitin (ub) fusion gene ubip1 as another antigen gene to enhance cellular immune effect. then use shrna designed for 3b gene of fmd, ifn- gene of porcine has anti-viral and immunomodulatory effects tandem with the above two function gene, con

12、structed transfer vector with four functional gene. making the transfer vector and the prvtk-/ge-/lacz+ cotransfected in cells. after the occurrence of recombinant, plaques were purified, identified, initially received recombinant pseudorabies virus with four functional genes of p1 gene, ubip1, shrn

13、a and ifn-, in order to further build a new foundation for the construction of genetic engineering vaccine.key words：antigen gene; ubiquitin; interferon gene; recombinant virus 英文縮略詞表abbreviation縮寫英文名稱中文名稱fmdfmdvubupsrnaisirnashrnasififnprvncsamp dmem lb pbs pcr sdsebodedtapkverodmsomemfoot-and-mont

14、h diseasefoot-and-mouth disease virusubiquitin ubiquitin-proteasome systemrna interferencerna interference generna interference geneinterference gene fragment-interferon genepseudorabies virusnewborn calf serumamplicillumdulbecco's modified eagle mediumluria-bertani medium phosphate buffer solut

15、ionpolymerase chain reactionsodium dodecylsulphateethidium bromideoptical densityedta disodium saltpig kidney cellsafrican green monkey kidney cellsdimethyl sulfoxideminimal essential medium 口蹄疫口蹄疫病毒泛素泛素蛋白酶系統(tǒng)小rna干擾小rna干擾基因小rna干擾基因干擾基因區(qū)段干擾素基因偽狂犬病病毒新生牛血清氨芐青霉素改良eagle培養(yǎng)基lb培養(yǎng)基磷酸鹽緩沖液聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)十二烷基磺酸鈉溴化乙錠光密度乙

16、二胺四乙酸豬腎細(xì)胞非洲綠猴腎細(xì)胞二甲基亞砜微小型培養(yǎng)基1前言1.1口蹄疫的基本特征1.1.1口蹄疫病毒基本概念口蹄疫(foot-and-month disease, fmd)是由口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus, fmdv）感染引起的人畜共患的急性、烈性傳染病，該病全世界分布廣泛，主要感染偶蹄類，一旦爆發(fā)常造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于存在制作滅活苗滅活不徹底和毒力返強(qiáng)造成的潛在危險(xiǎn)，開發(fā)新型基因工程疫苗已引起人們的重視。1.1.2口蹄疫病毒生物學(xué)特征口蹄疫病毒呈球形，正二十面體結(jié)構(gòu)，直徑20-25nm;無囊膜，對(duì)酸堿敏感，口蹄疫病毒粒子由衣殼和病毒核酸構(gòu)成，衣殼

17、由60個(gè)不對(duì)稱的亞單位組成，每個(gè)亞單位含一分子的vp1、vp2、vp3和vp4，其中vp4位于病毒顆粒內(nèi)部。fmdv屬于小rna病毒科，口蹄疫病毒屬，有7個(gè)血清型，即o，a，c，sat 1, sat 2, sat 3和asia型(rodriguez and grubman, 2009)，各個(gè)血清型間無交叉反應(yīng)（陸承平等，2005），病毒的這種特性，給其檢疫、防疫帶來極大的困難。fmdv基因組為具有感染性的單股正鏈rna，大小約8.5kb，只有一個(gè)開放的讀碼框(open reading frame, orf)，兩側(cè)各有一個(gè)非編碼區(qū)(non coding region, ncr)。開放讀碼框首先翻

18、譯為一個(gè)多聚蛋白，經(jīng)過蛋白酶切割為成熟的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白以及一些中間體。fmdv基因組p1區(qū)編碼結(jié)構(gòu)蛋白，p12a前體物在3c蛋白酶作用下形成由vp4-vp2，vp3和vp1組成的原體。5個(gè)原體組成一個(gè)五聚體，十二個(gè)五聚體組裝成包含rna的前病毒粒子或者缺乏rna的空衣殼。在感染細(xì)胞中，fmdv 3c蛋白酶基因編碼的蛋白能催化加工p12a前體衣殼蛋白為vp0、vp1、vp3，這三種蛋白能相互作用形成5s原體，成為病毒粒子結(jié)構(gòu)的組件，形成病毒樣顆粒，這種沒有病毒核酸的病毒樣顆粒具有與全病毒相同的免疫原性。1.1.3口蹄疫病毒危害fmdv主要感染偶蹄類物種如豬、牛、綿羊、山羊、水牛等，許多野生偶蹄

19、類物種也可能容易受到感染，其中駱駝被證明對(duì)口蹄疫是易感的(larska et al, 2009)。因感染口蹄疫而患病動(dòng)物的口、舌、唇、蹄、乳房等部位發(fā)生水泡，破潰、形成爛斑?？谔阋甙l(fā)病率幾乎達(dá)100%，該病一旦暴發(fā)，能迅速演變?yōu)樯餅?zāi)害，直接受到重大甚至于毀滅性打擊的是畜牧業(yè)及其相關(guān)產(chǎn)業(yè)。為了控制病情的蔓延，一般采取的措施是直接將大批動(dòng)物撲殺銷毀，這樣的措施不僅不能從根本上解決疫情往往還會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，造成社會(huì)的恐慌?？谔阋弑l(fā)的破壞力還會(huì)波及到其它行業(yè)，如對(duì)外出口被迫關(guān)閉，疫區(qū)被嚴(yán)密封鎖，旅游受阻等，如去年4月份韓國(guó)爆發(fā)的fmd呈全國(guó)蔓延狀態(tài)，讓韓國(guó)防疫當(dāng)局進(jìn)入緊急狀態(tài)。根據(jù)口蹄疫

20、的危害程度，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將口蹄疫列為a類動(dòng)物傳染病，我國(guó)農(nóng)業(yè)部將口蹄疫列為一類動(dòng)物疫病，將口蹄疫病毒列為一類動(dòng)物病原微生物。1.2泛素蛋白及其對(duì)抗原的影響圖1：泛素-蛋白酶體系統(tǒng)圖解（smalle and vierstra, 2004）fig.1:schematic of the ubiquitin-proteasome system泛素(ubiquitin, ub)是一個(gè)由76個(gè)氨基酸組成的高度保守的多肽鏈，泛素化過程是一個(gè)復(fù)雜的，并受到高度調(diào)控的過程，由三個(gè)級(jí)聯(lián)反應(yīng)組成，需要三類酶參與催化。這三類酶分別被稱為e1泛素激活酶，e2一泛素耦聯(lián)酶，e3一泛素連接酶。整個(gè)過程大致如下：首先在a

21、tp的參與下，在e1的半胱氨酸活性位點(diǎn)與泛素c末端的甘氨酸形成硫酯鍵(ciechanover et al., 1981; hershko et al., 1981)；接著，連接在e1的泛素被轉(zhuǎn)移到e2的活化半胱氨酸位點(diǎn)；最后，在e3的催化下，泛素c末端與底物的某個(gè)位點(diǎn)的賴氨酸結(jié)合(ciechanover, 1993; weissman, 2001)。當(dāng)?shù)谝粋€(gè)泛素分子連接到靶蛋白上后,另外一些泛素分子在e3 的催化下相繼與底物相連的泛素分子的第46位賴氨酸殘基相連,形成一條多聚泛素鏈，作為底物被蛋白酶體識(shí)別和降解的靶向性信號(hào)(ii ito et al., 1997)，一旦靶蛋白被4個(gè)以上的泛素分

22、子修飾,它們就被蛋白酶體降解。完成泛素化的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被展平進(jìn)入26s蛋白酶體，經(jīng)過它的處理，蛋白質(zhì)就被切成由7至9個(gè)氨基酸組成的短鏈，泛素分子可被水解下來,重復(fù)利用(groll et al., 1997; davies 2001; smalle and vierstra, 2004)。泛素系統(tǒng)廣泛參與了多種基本的細(xì)胞過程并由此引起了特別的關(guān)注(huang et al., 1995)，其中泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway)是一個(gè)新近受到關(guān)注的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)降解與功能的重要系統(tǒng)(pickart and eddins, 2004)。這是真核細(xì)胞內(nèi)除溶酶體外的另

23、一種非常重要的蛋白降解系統(tǒng)，也是調(diào)節(jié)各種細(xì)胞生物學(xué)過程的重要機(jī)制，為人們提供了一個(gè)增強(qiáng)抗病毒效果的新思路。1.3 sirna干擾機(jī)制圖2：rna干擾現(xiàn)象的機(jī)理（provenzano and mocellin, 2004）fig.2: the mechanism of rna interferencerna干擾（rnai）是一個(gè)基因表達(dá)的沉默機(jī)制，細(xì)胞內(nèi)的復(fù)合酶切割雙鏈rna（dsrna）分子為21-25個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，這些短干擾rna（rnai）引導(dǎo)rna干擾，誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（risc）去剪切與干擾rna序列互補(bǔ)的mrna(fire et al., 1998; sharp, 2001; han

24、non, 2002; mcmanus, 2004)，轉(zhuǎn)錄受抑制或翻譯受到抑制，從而在轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平干擾基因表達(dá)(如圖2)。1998年fire等首次把雙鏈rna(dsrna)注射入一種線蟲（caenorhabditiselegans） 體內(nèi)，dsrna使互補(bǔ)的mrna降解，誘導(dǎo)了靶向性的基因表達(dá)沉默(genesilencing),這一現(xiàn)象稱為rna干擾（rna interference，rnai）。同植物中的共抑制(co suppression)或轉(zhuǎn)錄后基因沉默（post transcriptional gene silencing，ptgs）、真菌中的基因表達(dá)壓抑（quelling）一樣

25、，rnai也是一種典型的轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控方式，是美國(guó)science和nature評(píng)出的2002年度最重要的科技成果之一，這成為基因功能研究和基因治療研究的熱點(diǎn)?？的螤柎髮W(xué)的guo等利用反義rna(antisense rna)技術(shù)特異性地阻斷秀麗新小桿線蟲(c.elegans)中的par1基因的表達(dá)以期得到與對(duì)照組注射正義rna(sense rna)相反的結(jié)果，但最終的結(jié)果卻令他們費(fèi)解:二者同樣阻斷了par1基因的表達(dá)途徑。直到1998年，fire等的研究結(jié)果證明，在正義rna也阻斷了基因表達(dá)的試驗(yàn)中，真正起作用的是雙鏈rna，這些雙鏈rna是體外轉(zhuǎn)錄正義rna時(shí)生成的，這種雙鏈rna對(duì)基因表

26、達(dá)的阻斷作用被稱為rnai。隨后的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rnai現(xiàn)象在從植物到人類的多種生物中存在(mcmanus, 2004)。生物體可利用rnai來抵御病毒的感染，阻斷轉(zhuǎn)座子的作用。rnai屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制，其本質(zhì)是sirna高效、特異地阻斷體內(nèi)同源基因表達(dá)，致使mrna降解和基因表達(dá)受抑。自然界中，rnai可能是動(dòng)植物體內(nèi)的一種保護(hù)機(jī)制，主要作用在于防御病毒感染，維持基因組中轉(zhuǎn)座子的穩(wěn)定，參與胚胎發(fā)育等。有實(shí)驗(yàn)表明，添加外源合成的sirna分子到哺乳動(dòng)物細(xì)胞能誘導(dǎo)rna干擾(elbashir et al., 2001)，此后誘導(dǎo)參與基因遺傳中或后天失調(diào)的信使rna降解的rna干擾療法便迅速

27、發(fā)展起來，同時(shí)有研究證明rnai技術(shù)有很多非常適合作為抗病毒治療的原因(leonard and schaffer, 2006)，所以本研究選擇shrna基因作為該新型病毒疫苗的一個(gè)重要基因。1.4 干擾素與口蹄疫免疫圖3：ifnr 在apc與t細(xì)胞和b細(xì)胞作用機(jī)制中的作用(索布林那，2009)fig：the role of ifn- in the mechanism of apc with t cells and b cells-干擾素(iterferon-，ifn-)具有免疫干擾素之稱，其受體是特異性的糖蛋白(harris et al., 2005)，有廣泛的抗病毒和免疫調(diào)節(jié)功能。特異性免疫

28、反應(yīng)被激活時(shí)，t細(xì)胞產(chǎn)生包括-干擾素在內(nèi)的與免疫應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞因子(sainz et al., 2005)，ifn-可使巨噬細(xì)胞表面mhc類分子的表達(dá)量增加，增強(qiáng)其抗原遞呈能力；增強(qiáng)巨噬細(xì)胞表面表達(dá)fc受體，促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬免疫復(fù)合物、抗體包被的病原體；促進(jìn)b細(xì)胞和cd8+t細(xì)胞的分化；增強(qiáng)th1細(xì)胞的活性，增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能；對(duì)th2細(xì)胞的增殖有抑制作用，從而抑制th2細(xì)胞產(chǎn)生il-4，同時(shí)抑制il-4對(duì)b細(xì)胞的作用，特別是抑制b細(xì)胞生成ige，所以能增強(qiáng)細(xì)胞免疫抑制體液免疫。盡管、三種干擾素激發(fā)的基因有所相似，然而它們調(diào)節(jié)的很多基因仍然存在一定的差異(der et al., 1998)，其中

29、干擾素所激發(fā)的基因是干擾素的兩倍，此種干擾素誘導(dǎo)基因的不同也部分解釋了干擾素比干擾素具有更好抗prv的現(xiàn)象?？瞻咝纬蓡挝患安《驹鲋吃囼?yàn)的結(jié)果均顯示豬干擾素是三種干擾素中對(duì)抗prv最有效的細(xì)胞因子（姚清俠，2007）。但是干擾素生物活性以調(diào)節(jié)fc受體和mhci、ii類抗原的表達(dá)尤為突出；對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制能力也比干擾素和干擾素強(qiáng)(jarosinski and massa, 2002; giroux et al., 2003)，在抗體產(chǎn)生的信號(hào)通路中起到免疫調(diào)節(jié)作用對(duì)中和抗體的產(chǎn)生有很大的意義，研究表明牛-干擾素(boifn-)在重組口蹄疫疫苗中可顯著提高體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)(shi et al.,

30、2006)，故本研究選用豬干擾素基因與其它功能基因重組在口蹄疫疫苗中有很大意義。從圖3可以看出ifn-在抗口蹄疫過程中的作用機(jī)理：當(dāng)活fmdv或滅活fmdv疫苗侵染機(jī)體時(shí)一部分在體液免疫階段被消滅掉，另一部分在apc的作用下促使細(xì)胞產(chǎn)生mhcii、il-1，被t細(xì)胞表面的tcr識(shí)別后促進(jìn)干擾素的分泌，同時(shí)干擾素能促使t細(xì)胞分泌干擾素，此時(shí)t細(xì)胞增殖并分泌細(xì)胞因子il-2、 il-4、 il-5、 il-6，這些細(xì)胞因子刺激b細(xì)胞使其分泌大量的特異性抗fmdv的抗體，這些特異性抗fmdv的抗體與吸附在apc表面被傳送到此處的活fmdv或滅活fmdv疫苗結(jié)合產(chǎn)生免疫反應(yīng)。在此過程中，ifn-不僅是

31、一種有效的免疫佐劑，同時(shí)也是重要的免疫調(diào)節(jié)分子，它不僅能增加細(xì)胞免疫應(yīng)答，最重要的是能增加疫苗介導(dǎo)的針對(duì)特異性病原體攻擊的保護(hù)性，另外顯著增強(qiáng)抗原遞呈細(xì)胞膜表面mhci、mhc類抗原表達(dá)，因而激發(fā)更有效的抗原遞呈過程。1.5 fmd疫苗研究進(jìn)展在各種動(dòng)物疾病的防控中疫苗接種是特異性預(yù)防動(dòng)物疾病的可靠工具和有效手段，在fmd預(yù)防中也取得了顯著的成效。發(fā)生fmd時(shí)，需用與當(dāng)?shù)亓餍械南嗥ヅ洳《拘?、亞型的疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防。傳統(tǒng)的疫苗一般指的是弱毒疫苗和滅活疫苗，在長(zhǎng)期的fmd防控過程中，常規(guī)疫苗取得了顯著的成效，但同時(shí)也存在著一些不容忽視的缺陷和安全隱患：（1）生產(chǎn)成本高阻礙其推廣使用；（2）病毒滅活

32、不全或活毒逃逸帶來疫情暴發(fā)的危險(xiǎn)，歐洲幾次fmd的爆發(fā)就是由于病毒滅活不完全或是由于活病毒從生產(chǎn)場(chǎng)地逃逸而造成的（孫元，2006）；（3）易出現(xiàn)病毒毒力返強(qiáng)或減毒株突變現(xiàn)象。這些局限性限制了傳統(tǒng)疫苗在畜牧業(yè)中的應(yīng)用。為了克服這種種弊端，各種fmd新型疫苗特別是基因工程疫苗被逐漸開發(fā)出來，如亞單位疫苗、可飼疫苗、合成肽疫苗、蛋白質(zhì)載體疫苗、基因缺失疫苗、活載體疫苗、核酸疫苗等（錢平等，2003），這些疫苗具有許多傳統(tǒng)疫苗無以比擬的優(yōu)點(diǎn)，更為安全、有效且價(jià)廉，將逐步替代常規(guī)疫苗在畜牧業(yè)中的使用。1.6本實(shí)驗(yàn)研究的目的與意義偽狂犬病和口蹄疫是嚴(yán)重危害全球養(yǎng)豬業(yè)的兩大重要傳染病，分別由偽狂犬病病毒和口

33、蹄疫病毒引起。prv主要引起豬繁殖障礙性疾病，隨著我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)規(guī)模化發(fā)展，豬偽狂犬病有流行蔓延趨勢(shì)，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大損失?？谔阋邉t是人畜共患的急性、烈性傳染病，由于其傳染性極強(qiáng)，而傳統(tǒng)的滅活疫苗在生產(chǎn)使用過程中有滅活不徹底導(dǎo)致病毒逃逸工廠而發(fā)生口蹄疫的風(fēng)險(xiǎn)，因此口蹄疫基因工程疫苗的研究受到高度重視。本實(shí)驗(yàn)將豬ifn-基因、靶點(diǎn)位于fmdv 3b區(qū)段的shrna和兩個(gè)串聯(lián)起來的fmdv抗原基因 p1-ubp1共同插入到轉(zhuǎn)移載體piecmv中，然后和偽狂犬缺失株prv tk-/ge-/lacz+共轉(zhuǎn)染，通過空斑篩選的方法得到能夠雙表達(dá)o型口蹄疫抗原基因p1基因和跟泛素基因融合的ubi-p1基因，同時(shí)

34、又能表達(dá)豬ifn-基因以及產(chǎn)生針對(duì)o型口蹄疫3b區(qū)段的rnai效應(yīng)，來共同達(dá)到最終的抗病毒效果。2實(shí)驗(yàn)材料2.1菌種、毒株、載體與質(zhì)粒偽狂犬弱毒疫苗株prvtk-/ge-/lacz+由農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。該突變株是將prvea株tk基因缺失205bp，并在ge編碼區(qū)插入lacz表達(dá)盒，導(dǎo)致ge失活的基因缺失標(biāo)志性疫苗株。本研究所用工程菌dh5a、xl-gold由本實(shí)驗(yàn)室保存。載體piecmv由本實(shí)驗(yàn)馬銳碩士研究生構(gòu)建。puc57pansubip12a由上海英駿公司合成。pcasifngsif由本實(shí)驗(yàn)室郝根喜碩士研究生構(gòu)建。 pcapansubip12asif由本實(shí)驗(yàn)室郝根喜碩士

35、研究生構(gòu)建。豬腎傳代細(xì)胞pk-15與非洲綠猴腎細(xì)胞vero購(gòu)自中國(guó)典型物保藏中心。2.2主要藥品與試劑新生牛血清(ncs)購(gòu)自杭州四季青材料有限公司，使用前經(jīng)56滅活30min。培養(yǎng)細(xì)胞用的dmem粉劑為gibco公司產(chǎn)品。氨芐青霉素(amp)、胎牛血清均為invitrogen公司產(chǎn)品。各種限制性內(nèi)切酶、連接酶、taq酶、dna marker均為大連寶生物公司產(chǎn)品。dna回收試劑盒為takara公司產(chǎn)品。質(zhì)粒小量和大量制備試劑盒為omega公司產(chǎn)品。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒l(wèi)ipofectin2000和無血清培養(yǎng)基opti-mem均為invitrogen公司產(chǎn)品。2.3主要培養(yǎng)基及配制lb液體培養(yǎng)基：

36、胰蛋白胨10.0g，酵母浸出物5.0g，nacl10.0g，溶于ddh20中，完全溶解后用5mol/lnaoh調(diào)ph值至7.0-7.2，定容至 1000.0ml，在15磅高壓下蒸氣滅菌20min，室溫保存。lb固體培養(yǎng)基：在剛配好尚未滅菌的lb液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉至終濃度為1.5%，高壓蒸氣滅菌20min。待培養(yǎng)基溫度降至50左右，加入相應(yīng)的抗生素，鋪制平板。待培養(yǎng)基凝固后，倒置于4保存?zhèn)溆?。dmem基礎(chǔ)培養(yǎng)液(用于常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng))：取dmem粉末(gibic, usa)13.5g溶于950 mlddh2o中，加入3.7g nahco3，用1mol/l hcl調(diào)ph值至6.8-7.0，定容至1

37、000.0 ml，0.22m濾膜過濾除菌，分裝后室溫保存?zhèn)溆?。dmem細(xì)胞生長(zhǎng)液：在dmem基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入10%的已滅活新生牛血清、100g/ml青霉素、100g/ ml鏈霉素，4保存?zhèn)溆?。dmem細(xì)胞維持液：在dmem培養(yǎng)液中加入1%-3%的新生牛血清、100g /ml青霉素、100g/ml鏈霉素，4保存?zhèn)溆谩＜?xì)胞消化液：將nacl 8.0g、kcl 0.2g、na2hpo4 1.15g、kh2po4 0.2g、胰酶2.5g，依次溶于900.0mlddh2o中，待完全溶解后，定容至1000.0ml，0.22m濾膜過濾除菌，分裝后置-20保存?zhèn)溆谩?.4緩沖液及其配制tae(50×

38、)：242.0g tris堿，57.1ml冰乙酸，100.0ml0.5mol/ledta(ph8.0)，加ddh2o定容至1000.0 ml。pbs buffer：將nacl 8g、kcl 0.2g、na2hpo4 1.42g、kh2po4 0.27g溶于800.0mlddh2o中，待完全溶解后，滴加濃hcl調(diào)節(jié)ph至7.4，定容至1000.0ml，高溫高壓滅菌后室溫保存。10%sds：稱量10g高純度的sds溶于80mlddh2o中，68加熱溶解后，滴加濃hcl調(diào)節(jié)ph至7.2，定容至100.0ml，室溫保存。0.5 m edta：稱取186.1g na2edta. 2h2o溶于800.0m

39、lddh2o中，充分?jǐn)嚢?，滴加naoh調(diào)節(jié)ph至8.0，定容至1000.0ml，高溫高壓滅菌后室溫保存。2.5其他溶液ten：100.0mol/lnacl，10.0mol/ltris-cl，1.0mol/ledta(ph 8.0)lcm：30.mol/ltris(ph7.5)，5.0mol/lmgcl2，3.6mol/lcacl2，0.5mol/ledta 6.0 mmol/l-moracptoethnael，0.5%np-40，125.0mol/lkci空斑篩選pcr樣品細(xì)胞裂解液：0.5%sds，100.0mmol/lnacl，10.0mmol/l tris-cl，1.0mmol/ledt

40、a，0.25mg/ml蛋白酶k。2.5空斑篩選與純化相關(guān)試劑2×dmem（無酚紅）：稱取13.4g無酚紅的dmem粉劑，溶于約400.0 ml三蒸水中，再加入3.7g nahco3，用濃鹽酸調(diào)ph值至6.8-7.0，定容至500.0 ml，0.22m濾膜過濾除菌，分裝后4保存?zhèn)溆?。低熔點(diǎn)瓊脂糖（2%）：稱取2.0g低熔點(diǎn)瓊脂糖粉劑，溶于100.0 ml三蒸水中，高溫高壓滅菌30min后室溫保存（用前于70水浴鍋中融化或微波爐小心融化）。蛋白酶k（20mg/ml）：取100mg蛋白酶粉劑，溶解于5.0 ml三蒸水中，分裝小份，保存于-20。10%sds(m/v)：稱取10gsds粉末，

41、溶解于100.0 ml去離子水中，室溫保存。0.5mol/ledta：稱取18.61g edta-na. 2h2o粉末，溶于約80.0 ml水中，naoh調(diào)ph至8.0后定容至100ml，室溫保存?？瞻吆Y選pcr樣品細(xì)胞裂解液：05%sds，100.0mmol/lnacl，10.0mmol/l tris-cl，1.0 mmol/ledta，0.25mg/ml蛋白酶k。2.6寡核苷酸引物本實(shí)驗(yàn)pcr所使用的寡聚核苷酸引物如表1。表1：本研究中所用的寡核苷酸引物table 1:the oligo primer used in the research編號(hào)序列用途r primerf primer5-

42、 agctttgcgtgactttgtgtttttc- 35- gcagggggctgtttcatatactgat- 3鑒定陽(yáng)性重組子3實(shí)驗(yàn)方法3.1轉(zhuǎn)移載體piecmvubip1p1sififn的構(gòu)建策略重組轉(zhuǎn)移載體piecmvubip1p1sififn的構(gòu)建流程如圖4所示piecmv載體pcapansubip12asifpcasifngsifpiecmvubip1p1sififnpuc57pansubip12asifngsifubip12ap12a圖4：轉(zhuǎn)移載體piecmvubip1p1sififn構(gòu)建流程fig.4：building process of piecmvubip1p1sif

43、ifn3.1.1限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)酶切產(chǎn)物僅用于檢測(cè)時(shí)，取1µl質(zhì)粒dna并加入相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液，混合后加入限制性內(nèi)切酶，指彈混合，瞬時(shí)離心后置于37水浴3h。若酶切產(chǎn)物用于回收，根據(jù)實(shí)際情況可增加質(zhì)粒的量擴(kuò)大酶切反應(yīng)體系。3.1.2酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)配制0.8%瓊脂糖凝膠（膠的濃度要根據(jù)目的條帶的大小適當(dāng)調(diào)整，如果是大片段則需濃度低的瓊脂糖凝膠）：20mlddh2o中融入400µl（50×）tae，再加入0.16g瓊脂糖，加熱至完全溶解，稍微冷卻后加入適量eb。凝膠倒入膠槽，如有氣泡用梳子趕走，插好梳子，等待凝膠冷卻凝固。拔出梳子，凝膠放

44、入裝有1×tae電泳緩沖液的電泳槽，確保緩沖液要淹沒凝膠。然后取酶切產(chǎn)物1.5-3µl與微量6×loading buffer混合，加于點(diǎn)樣孔中，同時(shí)取約2µl的dna marker點(diǎn)樣作對(duì)照。以100-120v電壓進(jìn)行電泳。待溴酚藍(lán)電泳到凝膠2/3處時(shí)，則可結(jié)束電泳。取出凝膠于凝膠成像系統(tǒng)拍照，保存照片。3.1.3酶切產(chǎn)物的回收酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，鑒定正確后，于長(zhǎng)波紫外燈下切取目的條帶用瓊脂糖凝膠dna回收試劑盒進(jìn)行回收獲得目的dna片段（具體回收方法參考該試劑盒說明書）?；厥者^程如下：（1）將切下的目的dna條帶放入1.5ml離心管；（2）加入6

45、00lpn液，50水浴10min，翻轉(zhuǎn)離心管使充分溶解；（3）將上步所得溶液加入吸附柱，室溫靜置2min后12000r/min離心60sec，棄廢液；（4）加入600lpw液，靜置5min后12000r/min離心60sec，棄去廢液；（5）再次加入600lpw液，12000r/min離心60sec，棄去廢液；（6）12000r/min離心2min，開蓋靜置5min；（7）棄掉收集管，將吸附柱放入離心管，懸空滴加30-50leb洗脫液（或ddh2o），37溫箱靜置5min。（8）12000r/min離心2min收集dna溶液，離心管標(biāo)記保存。3.1.4回收產(chǎn)物的去磷酸化反應(yīng)在做分子克隆時(shí)，為防

46、止單酶切制備的載體在連接反應(yīng)時(shí)發(fā)生自連，我們需將載體進(jìn)行去磷酸化處理。具體步驟：回收時(shí)溶34l ddh2o在50l體系中加入2l ciap，4lbuffer置于37反應(yīng)30min后加入1lciap置于50反應(yīng)15min，用試劑盒進(jìn)行液體回收溶20l ddh2o，跑膠檢測(cè)。3.1.5目的基因與載體的酶連反應(yīng)將回收所得的dna片段與載體用t4 dna連接酶進(jìn)行連接，酶連體系根據(jù)大連寶生物工程有限公司提供的t4 dna連接酶的說明書進(jìn)行配備，如表2所示。表2：目的基因與載體酶連體系table 4：reaction system of enzyme with target gene and vecto

47、r反應(yīng)體系體積（l）載體目的基因t4 dna ligase(25ul)10×t4 dna ligase bufferddh2ototal14121220置于16或4過夜。3.2 感受態(tài)細(xì)胞的制備、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒制備與純化3.2.1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備（氯化鈣法）從大腸桿菌dh5平板中挑取一個(gè)單菌落，接種于2mllb液體培養(yǎng)基中，37200r/min搖床振蕩培養(yǎng)過夜，按1：100轉(zhuǎn)接到裝有50mllb的鹽水瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)約3-4h，在無菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)無菌的用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯離心管中，冰上放置30min，于44000r/min離心10min。棄上清，將離心管倒置1m

48、in使殘留培養(yǎng)液流盡。加10ml 冰預(yù)冷的0.1mol/lcacl2重懸沉淀，冰浴30min后，44000r/min離心10min。棄上清，沉淀中加入2ml用冰預(yù)冷的0.1mol/l cacl2重懸。懸浮的感受態(tài)細(xì)胞可馬上用于轉(zhuǎn)化。如保存，則需加入無菌甘油到終濃度為15%，分裝0.1ml/管，-80冰箱保存?zhèn)溆谩?.2.2質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化將載體與cdna或dna基因片段的連接產(chǎn)物與100l感受態(tài)細(xì)胞混勻，冰浴30min；42水浴熱沖擊90sec；冰浴2min；若是轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，則取3050l菌液直接涂布含相應(yīng)抗生素的lb平板；若轉(zhuǎn)化連接物，則加入0.4ml 37預(yù)熱的lb培養(yǎng)基，37振搖培養(yǎng)45min；

49、5000r/min離心3min，棄去450l的上清后，將剩余的部分直接涂布含相應(yīng)抗生素的lb平板，37培養(yǎng)1216h后，出現(xiàn)轉(zhuǎn)化菌落。3.2.3質(zhì)粒的小量制備(omega試劑盒) （1）將帶有質(zhì)粒的e.coil接種于5mllb/抗生素培養(yǎng)液中，37搖床培養(yǎng)1216 h；（2）取1.05.0ml的菌液，室溫下10,000g離心1min收集細(xì)菌。（3）倒棄培養(yǎng)基。加入250ulsolution i/rnasea混和液，漩渦振蕩使細(xì)胞完全懸浮。（4）往重懸混和液中加入250ulsolution ii，輕輕顛倒混勻4-6 次。此操作避免劇烈混勻裂解液且裂解反應(yīng)不要超過5 min。（5）加入350uls

50、olution，溫和顛倒數(shù)次至形成白色絮狀沉淀。（6）室溫下，10,000g離心10min。（7）轉(zhuǎn)移上清液至套有2ml收集管的hibind dna結(jié)合柱中，室溫下 10,000g離心1 min，倒去收集管中的濾液。（8）把柱子重新裝回收集管，加入500ulhb buffer，按上述條件離心，棄去濾液。（9）把柱子重新裝回收集管，加入700uldna wash buffer，按上述條件離心，棄去濾液。（10）棄去濾液，重復(fù)第9步驟一次。(11)棄去濾液，把柱子重新裝回收集管， 10,000g離心空柱2min以甩干柱子基質(zhì)。(12)把柱子裝在干凈的1.5ml離心管上，加入30-50uleluti

51、on buffer(10mmol/l tris-hcl, ph8.5)或無菌水到柱子基質(zhì)中，靜置1-2min，10,000g離心1min洗脫出dna。3.2.4質(zhì)粒的大量制備（omega試劑盒）(1)將帶有質(zhì)粒的e.coil接種于100-200mllb抗生素培養(yǎng)液中，37搖床培養(yǎng)12-16h。(2)取100-200 mllb菌液，室溫下3,000-5,000g離心10min收集菌液。(3)倒棄培養(yǎng)基，加入10mlsolutionirnasea混合液，漩渦振蕩使細(xì)胞完全懸浮。(4)往重懸混合液中加入10mlsolution，輕輕顛倒混勻10-15次后可將混合液室溫放置2min以提高產(chǎn)量。(5)加

52、入5ml冰浴buffern3，并溫和顛倒離心管數(shù)次至形成白色絮狀沉淀。準(zhǔn)備好過濾器。(6)把hinbind大量柱套在收集管中，加入5mlbuffer gps至柱中，靜置3-10min。室溫3,000-5,000g離心5min。去濾液，把柱子重新放回收集管中。(7)把裂解液倒入事先準(zhǔn)備好的針筒過濾器中，靜置2min。(8)插入并輕推活塞使裂解液流進(jìn)下面的收集管中。(9)在過濾澄清的裂解液中加入110體積的etr，顛倒7-10次后溶液變得渾濁，冰浴10min。(10)42水浴5min后，253,000-5,000g離心5min，etr溶液將在管底形成藍(lán)色分層。離心后，如果溶液有大量的液滴懸浮，靜置

53、10min讓液滴自然沉降。(11)轉(zhuǎn)移上清液至離心管中，加入0.5倍體積的無水乙醇，混勻后室溫靜置1-2min。(12)取一干凈的hinbind 大量柱裝在50ml收集管中。轉(zhuǎn)移20ml混合液至柱子內(nèi)，室溫下3,000-5,000g離心3-5min，倒去濾液。(13)重復(fù)第（12）步，把剩余的過濾液轉(zhuǎn)移至柱子，直至所有的溶液都從柱子濾出。(14)把柱子重新放回收集管，加入10mlhb buffer，按上述條件離心，棄濾液。(15)把柱子重新放回收集管，加入15mldna wash buffer，按上述條件離心，棄濾液。(16) 棄去濾液，重復(fù)步驟（15）一次。（17）棄去濾液，把柱子重新放回收

54、集管，最大速度（6,000g）離心10-15min以甩干柱子基質(zhì)。（18）把柱子放在干凈的50ml離心管中，加入1-3mlelution buffer，棄上清，室溫下靜置2min后最大速度（6,000g）離心5min以洗脫dna。3.2.5陽(yáng)性質(zhì)粒的酶切鑒定挑取轉(zhuǎn)化的菌落，接種于4ml含相應(yīng)抗性的lb液體培養(yǎng)基中。37培養(yǎng)過夜，小量制備質(zhì)粒dna，用合適的限制性核酸內(nèi)切酶消化，瓊脂糖凝膠電泳，eb染色，紫外燈觀察，鑒定重組質(zhì)粒。另外，可以通過測(cè)序的方法進(jìn)一步鑒定陽(yáng)性質(zhì)粒。3.3以prv為載體表達(dá)fmdv抗原蛋白基因p1，泛素蛋白與抗原p1的融合基因ubi- p1，rna干擾基因shrna，干擾

55、素基因ifn-的重組病毒的構(gòu)建3.3.1細(xì)胞的培養(yǎng)、凍存與復(fù)蘇（1）細(xì)胞的培養(yǎng)：無菌臺(tái)上將已長(zhǎng)成單層的細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)A去培養(yǎng)液，用pbs液洗1-2遍后，加入1ml胰酶37消化數(shù)分鐘，棄去胰酶，加入新鮮生長(zhǎng)液吹打分散，按1:3或1:4傳代。（2）細(xì)胞的凍存：無菌臺(tái)上將剛長(zhǎng)成單層的細(xì)胞用胰酶消化好后，棄盡胰酶，用少量細(xì)胞凍存液（100ml瓶?jī)龃?-2管）吹打分散細(xì)胞，按約1.5ml每管分裝于細(xì)胞凍存管中。先于4放置40min-1h，-80過夜后轉(zhuǎn)入液氮罐中可保存數(shù)年（或-80可保存1-3個(gè)月）。（凍存液配法有二：一為9份的血清+1份的dmso；另一種為70%dmem+20%血清+10%dmso）（3）

56、細(xì)胞的復(fù)蘇：將水浴鍋預(yù)先調(diào)至37，生長(zhǎng)液加入細(xì)胞瓶并37預(yù)熱，然后從液氮罐中（或-80冰箱）取出一管凍存的細(xì)胞，置水浴鍋中快速融化，于無菌臺(tái)中將細(xì)胞液轉(zhuǎn)入細(xì)胞瓶中，375%co2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，6h換新生長(zhǎng)液（已預(yù)熱）繼續(xù)培養(yǎng)。）3.3.2 prv tk-/ge-/lacz+基因組dna的提取將prv弱毒株tk-/ge-/lacz+接種于已長(zhǎng)成單層的pk-15細(xì)胞，37培養(yǎng)至80%的細(xì)胞出現(xiàn)病變，用吸管吹打使細(xì)胞從瓶壁上脫落，在48000r/min離心15min收集細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀重懸于細(xì)胞裂解液lcm使細(xì)胞裂解，冰浴5-10min后，加入三氯三氟乙烷抽提，搖勻5min，43000r/min離心10min，吸取上清于另一干凈離心管，再加入三氯三氟乙烷抽提一次，搖勻5min，43000r/min離心10min，取上清，48000r/min離心10min，取上清，加到5%-45%的甘油梯度上（加入的上清體積不超過甘油體積的10%），在電子天平上平衡，26000r/min離心2h，小心棄去上清，將沉淀重懸于ten緩沖液后，加入10%的sds至終濃度為