第四章_核酸化學(xué)

1、2021-12-91第第四四章章核核酸酸化化學(xué)學(xué)2021-12-922021-12-93核酸的研究歷史核酸的研究歷史l186818686969， F. MiescherF. Miescher從膿細(xì)胞核中提出含從膿細(xì)胞核中提出含磷量高的磷量高的核素（核素（nucleinnuclein）。l18891889年，稱為年，稱為核酸（核酸（nucleic acidnucleic acid），），意指含意指含于細(xì)胞核內(nèi)的酸性物質(zhì)。于細(xì)胞核內(nèi)的酸性物質(zhì)。l核酸中的核酸中的嘌呤和嘧啶嘌呤和嘧啶主要由主要由KosselKossel等人所鑒定。等人所鑒定。19101910，KosselKossel 因核酸化學(xué)研究

2、中的成就而獲因核酸化學(xué)研究中的成就而獲諾貝爾化學(xué)獎。諾貝爾化學(xué)獎。l19281928年，年，F(xiàn)red GriffithFred Griffith發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌的轉(zhuǎn)化現(xiàn)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象（象（transformationtransformation）。2021-12-94核酸的研究歷史核酸的研究歷史l19441944年，年，Oswald AveryOswald Avery提出提出“遺傳的物質(zhì)遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是基礎(chǔ)是DNADNA”。l19521952年，年，Alfred HersheyAlfred Hershey和和Martha ChaseMartha Chase雙標(biāo)記實驗雙標(biāo)記實驗更進(jìn)一步證實了核酸

3、在遺傳中更進(jìn)一步證實了核酸在遺傳中的作用。的作用。l19531953年，年，WatsonWatson和和CrickCrick建立了建立了DNADNA結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)的雙螺旋模型雙螺旋模型，說明了基因的結(jié)構(gòu)、信息和，說明了基因的結(jié)構(gòu)、信息和功能三者間的關(guān)系，推動了分子生物學(xué)的功能三者間的關(guān)系，推動了分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展。迅猛發(fā)展。2021-12-95Maurice Hugh Frederick Wilkins James Dewey Watson Francis Harry Compton Crick for their discoveries concerning the molecular str

4、ucture of nucleic acids and its significance for information transfer in living material The Nobel Prize in Physiology or Medicine 19622021-12-96The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1965for their discoveries concerning genetic control of enzyme and virus synthesis 1910 - 19761902 - 19941920 - I

5、nstitut Pasteur Paris, France Institut Pasteur Paris, France Institut Pasteur Paris, France France France France Jacques Monod Andre Michellwoff Francois Jacob 2021-12-971927 - 1922 - 1922 - 1993National Institutes of Health Bethesda, MD, USA University of Wisconsin Madison, WI, USA Cornell Universi

6、ty Ithaca, NY, USA USA USA USA Marshall W. Nirenberg Har Gobind Khorana Robert W. Holley The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1968 for their interpretation of the genetic code and its function in protein synthesis 2021-12-9870年代建立年代建立DNA重組技術(shù)重組技術(shù)，改變了，改變了分子生物學(xué)的面貌，分子生物學(xué)的面貌，并導(dǎo)致生物技術(shù)的并導(dǎo)致生物技術(shù)的興起。興起。20

7、21-12-992021-12-91090年代以后，實施年代以后，實施人類基因組計劃人類基因組計劃（HGP）, 開辟了開辟了生命科學(xué)新紀(jì)元。生命科學(xué)新紀(jì)元。生命科學(xué)進(jìn)入后基生命科學(xué)進(jìn)入后基因組時代。因組時代。2021-12-911l功能基因組學(xué)（功能基因組學(xué)（functional genomicsfunctional genomics）：）：研究基因組研究基因組中各基因的功能，包括基因的表達(dá)及其調(diào)控模式的中各基因的功能，包括基因的表達(dá)及其調(diào)控模式的學(xué)科。學(xué)科。 lmRNA減法雜交（減法雜交（subtractive hybridization）l基因表達(dá)的系統(tǒng)分析（基因表達(dá)的系統(tǒng)分析（seria

8、l analysis of gene expression，SAGE）lcDNA微陣列（微陣列（cDNA microarray）lDNA 芯片（芯片（DNA chip）l序列標(biāo)志片段顯示（序列標(biāo)志片段顯示（sequence tagged fragments display） 2021-12-9122021-12-913l蛋白質(zhì)組學(xué)（蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomicsproteomics）：）：闡明生物體各闡明生物體各種生物基因組在細(xì)胞中表達(dá)的種生物基因組在細(xì)胞中表達(dá)的全部蛋白質(zhì)全部蛋白質(zhì)的表達(dá)模式及功能模式的學(xué)科。包括鑒定的表達(dá)模式及功能模式的學(xué)科。包括鑒定蛋白質(zhì)的表達(dá)、存在方式蛋白質(zhì)的表達(dá)、存

9、在方式(修飾形式修飾形式)、結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)、功能和相互作用等。功能和相互作用等。l等電聚焦（等電聚焦（isoelectric focusing，IEF）l雙向凝膠電泳（雙向凝膠電泳（two-dimensional gel electrophoresis，2-DE）l質(zhì)譜（質(zhì)譜（mass spectrum，MS ）2021-12-914l核酸，以核酸，以核苷酸核苷酸為基本單位，是一類重要為基本單位，是一類重要的生物大分子，擔(dān)負(fù)著的生物大分子，擔(dān)負(fù)著生命信息的儲存與生命信息的儲存與傳遞傳遞。l核酸是現(xiàn)代生物化學(xué)、分子生物學(xué)的重要核酸是現(xiàn)代生物化學(xué)、分子生物學(xué)的重要研究領(lǐng)域，是研究領(lǐng)域，是基因工程基因工

10、程操作的核心分子。操作的核心分子。核酸概述核酸概述2021-12-915 98 98核中（染色體中）核中（染色體中） 真核真核 線粒體（線粒體（mtDNAmtDNA） 核外核外 葉綠體（葉綠體（ctDNActDNA）DNA DNA 擬核擬核 原核原核 核外：質(zhì)粒（核外：質(zhì)粒（plasmidplasmid） 病毒：病毒：DNADNA病毒病毒核酸的種類和分布核酸的種類和分布 核酸分為兩大類：核酸分為兩大類： 脫氧核糖核酸脫氧核糖核酸 d deoxyriboseeoxyribose n nucleic ucleic a acid cid （DNADNA） 核糖核酸核糖核酸 r ribose ibos

11、e n nucleic ucleic a acidcid（RNARNA）2021-12-916動物細(xì)胞內(nèi)主要動物細(xì)胞內(nèi)主要RNA的種類及功能的種類及功能核蛋白體核蛋白體RNA信使信使RNA轉(zhuǎn)運轉(zhuǎn)運RNA核內(nèi)不均一核內(nèi)不均一RNA核內(nèi)小核內(nèi)小RNA胞漿小胞漿小RNA 細(xì)胞核和胞液細(xì)胞核和胞液線粒體線粒體功功能能rRNAmRNA mt rRNAtRNAmt mRNAmt tRNAHnRNASnRNASnoRNAscRNA/7SL-RNA 核蛋白體組分核蛋白體組分蛋白質(zhì)合成模板蛋白質(zhì)合成模板轉(zhuǎn)運氨基酸轉(zhuǎn)運氨基酸成熟成熟mRNA的前體的前體參與參與hnRNA的剪接、轉(zhuǎn)運的剪接、轉(zhuǎn)運rRNA的加工、修飾

12、的加工、修飾蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位合成蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位合成的信號識別體的組分的信號識別體的組分核仁小核仁小RNA核蛋白體核蛋白體RNA信使信使RNA轉(zhuǎn)運轉(zhuǎn)運RNA核內(nèi)不均一核內(nèi)不均一RNA核內(nèi)小核內(nèi)小RNA胞漿小胞漿小RNA 細(xì)胞核和胞液細(xì)胞核和胞液線粒體線粒體功功能能rRNAmRNA mt rRNAtRNAmt mRNAmt tRNAHnRNASnRNASnoRNAscRNA/7SL-RNA 核蛋白體組分核蛋白體組分蛋白質(zhì)合成模板蛋白質(zhì)合成模板轉(zhuǎn)運氨基酸轉(zhuǎn)運氨基酸成熟成熟mRNA的前體的前體參與參與hnRNA的剪接、轉(zhuǎn)運的剪接、轉(zhuǎn)運rRNA的加工、修飾的加工、修飾蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位合成蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定

13、位合成的信號識別體的組分的信號識別體的組分核仁小核仁小RNA2021-12-917RNARNA組學(xué)研究細(xì)胞組學(xué)研究細(xì)胞中中非信使非信使小小RNAs（snmRNAs）的種類、結(jié)構(gòu)和功的種類、結(jié)構(gòu)和功能能。同一生物體內(nèi)不同種類的細(xì)胞、同。同一生物體內(nèi)不同種類的細(xì)胞、同一細(xì)胞在不同時間、不同狀態(tài)下一細(xì)胞在不同時間、不同狀態(tài)下小小RNAs的表達(dá)具有時間和空間特異性。的表達(dá)具有時間和空間特異性。 RNARNA組學(xué)：組學(xué)：2021-12-918三、核酸的生物功能三、核酸的生物功能（一）（一）DNA是主要的遺傳物質(zhì)是主要的遺傳物質(zhì)1944 ， O. Avery肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗1952 ，

14、 A.D Hershey 和和M. Chase 噬菌體感染實驗噬菌體感染實驗2021-12-919O.T.Avery 的細(xì)菌轉(zhuǎn)化實驗的細(xì)菌轉(zhuǎn)化實驗2021-12-9202021-12-9212021-12-9222021-12-9232021-12-9242021-12-9252021-12-926（二）（二） RNA的生物學(xué)功能2021-12-9272021-12-928本章主要內(nèi)容本章主要內(nèi)容l第一節(jié)第一節(jié) 核酸的組成成分核酸的組成成分l第二節(jié)第二節(jié) 核酸的結(jié)構(gòu)（核酸的結(jié)構(gòu)（RNA、DNA的結(jié)構(gòu)）的結(jié)構(gòu)）l第三節(jié)第三節(jié) 核酸的性質(zhì)核酸的性質(zhì)l第四節(jié)第四節(jié) 核酸的研究方法（分離純化、分析測定

15、）核酸的研究方法（分離純化、分析測定）2021-12-929 本章教學(xué)目的要求：本章教學(xué)目的要求：教學(xué)要求：理解核酸的化學(xué)組成及其分布；教學(xué)要求：理解核酸的化學(xué)組成及其分布； 區(qū)別區(qū)別DNA的各級結(jié)構(gòu)及其與的各級結(jié)構(gòu)及其與RNA的分子結(jié)構(gòu)的分子結(jié)構(gòu)的差別；的差別； 掌握核酸的種類與性質(zhì)。掌握核酸的種類與性質(zhì)。重點：重點：掌握核酸的水解產(chǎn)物、構(gòu)成及其命名。掌握核酸的水解產(chǎn)物、構(gòu)成及其命名。 DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)的組成及特點。的雙螺旋結(jié)構(gòu)的組成及特點。 RNA三葉草二級結(jié)構(gòu)模型特點，三葉草二級結(jié)構(gòu)模型特點， 核酸的的變性及影響核酸的的變性及影響Tm的因素。的因素。 2021-12-930第一節(jié)第一節(jié)

16、 核酸的組成成分核酸的組成成分核酸核酸核苷酸核苷酸核苷核苷磷酸磷酸堿基堿基戊糖戊糖元素組成：元素組成： C H O N C H O N P P 核酸完全水解產(chǎn)生核酸完全水解產(chǎn)生嘌呤和嘧啶嘌呤和嘧啶等堿性物質(zhì)、等堿性物質(zhì)、戊糖戊糖（核糖或（核糖或脫氧核糖）和脫氧核糖）和磷酸磷酸的混合物。核酸部分水解則產(chǎn)生的混合物。核酸部分水解則產(chǎn)生核苷核苷和和核核苷酸苷酸。每個核苷分子含一分子堿基和一分子戊糖，一分子核。每個核苷分子含一分子堿基和一分子戊糖，一分子核苷酸部分水解后除產(chǎn)生核苷外，還有一分子磷酸。核酸的各苷酸部分水解后除產(chǎn)生核苷外，還有一分子磷酸。核酸的各種水解產(chǎn)物可用層析或電泳等方法分離鑒定。種水

17、解產(chǎn)物可用層析或電泳等方法分離鑒定。2021-12-931 組成核酸的戊糖有兩種。組成核酸的戊糖有兩種。DNA所含的糖為所含的糖為 -D-2-脫氧核糖脫氧核糖；RNA所含的糖則為所含的糖則為-D-核糖核糖。一、戊糖一、戊糖OHHOHHOHOHHHOCH2HOCH2OHHOHHHOHHD-核糖D-2-脫氧核糖2021-12-932 嘌呤嘌呤 嘧啶嘧啶2021-12-933（1）嘌呤堿）嘌呤堿（Adenine）（Guanine）2021-12-934（2）嘧啶堿）嘧啶堿(uracil)(cytosine)(thymine)2021-12-935嘌呤嘌呤 嘧啶嘧啶 堿基堿基腺嘌呤（腺嘌呤（Ade）鳥

18、嘌呤（鳥嘌呤（Gua）胞嘧啶（胞嘧啶（Cyt）胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（Thy）尿嘧啶（尿嘧啶（Ura）DNA、RNA均有均有DNA有有RNA有有每種核酸都含有四種堿基每種核酸都含有四種堿基 。2021-12-936N-糖苷鍵糖苷鍵NN2021-12-937核苷核苷 戊糖戊糖+ +堿基堿基 糖與堿基之間的糖與堿基之間的N-CN-C鍵，稱為鍵，稱為N-N-糖苷鍵糖苷鍵糖糖C1C1與與嘧啶嘧啶N1N1，糖，糖C1C1與與嘌呤嘌呤N9N9堿基與糖環(huán)平面垂直。堿基與糖環(huán)平面垂直。(OH)(OH)2021-12-938 A G C U dA dG dC dT2021-12-939四、核苷酸（四、核苷酸（nuc

19、leotide）2021-12-940腺苷酸NNNN9NH2OOHOHHHHCH2H12OPO- -HOO5糖苷鍵酯鍵核苷酸核苷酸:核苷的核苷的磷酸酯磷酸酯 核苷酸核苷酸=核苷核苷+磷酸磷酸=戊糖戊糖+堿基堿基+磷酸磷酸是核酸的是核酸的基本結(jié)構(gòu)單位基本結(jié)構(gòu)單位。2021-12-9412，3，5一核糖核苷酸一核糖核苷酸(2 -AMP)(3 -AMP)(5 -AMP)2021-12-9423，5脫氧核糖核苷酸脫氧核糖核苷酸Deoxyadenosine 3- monphosphate (3- dAMP)Deoxyadenosine 5- monphosphate (5- dAMP)脫氧（核糖）核苷酸

20、（脫氧（核糖）核苷酸（deoxyribonucleotide）2021-12-943PPPPPPPP常見（脫氧）核苷酸的結(jié)構(gòu)和命名常見（脫氧）核苷酸的結(jié)構(gòu)和命名鳥嘌呤核苷酸鳥嘌呤核苷酸（GMP）尿嘧啶核苷酸尿嘧啶核苷酸（UMP）胞嘧啶核苷酸胞嘧啶核苷酸（CMP）腺嘌呤核苷酸腺嘌呤核苷酸（AMP）脫氧腺嘌呤核苷酸脫氧腺嘌呤核苷酸（dAMP）脫氧鳥嘌呤核苷酸脫氧鳥嘌呤核苷酸（dGMP）脫氧胞嘧啶核苷酸脫氧胞嘧啶核苷酸（dCMP）脫氧胸腺嘧啶核苷酸脫氧胸腺嘧啶核苷酸（dTMP）2021-12-944核苷酸衍生物核苷酸衍生物l繼續(xù)磷酸化繼續(xù)磷酸化O-POO-NNNNNH2OHHOHHOHHOCH2O-

21、POO-O-POO-三磷酸腺苷 (ATP)AMPADPATP2021-12-945ATP的重要生理功能：的重要生理功能： 參與能量代謝。參與能量代謝。 各種三磷酸核苷酸參與各種三磷酸核苷酸參與DNA 、RAN的生物的生物合成（作原料）；合成（作原料）； 參與其它合成。如參與其它合成。如UTP參加糖轉(zhuǎn)化、合成，參加糖轉(zhuǎn)化、合成，CTP參與嘌呤、蛋白質(zhì)的合成；參與嘌呤、蛋白質(zhì)的合成； 作輔酶的結(jié)構(gòu)成分。如作輔酶的結(jié)構(gòu)成分。如NAD、FAD、NADP。2021-12-946NMP，NDP，NTP2021-12-947l cAMPl cGMPcAMPcAMP：3,5-3,5-環(huán)腺嘌呤核苷一磷酸環(huán)腺嘌呤

22、核苷一磷酸cGMPcGMP：3,5-3,5-環(huán)鳥嘌呤核苷一磷酸環(huán)鳥嘌呤核苷一磷酸2021-12-948其他核苷酸其他核苷酸 主要起調(diào)節(jié)作用，如主要起調(diào)節(jié)作用，如 ： ppGpp：鳥苷：鳥苷5二磷酸二磷酸3二磷酸二磷酸 pppGpp：鳥苷：鳥苷5三磷三磷酸酸3二磷酸二磷酸2021-12-949（1）核苷的堿基）核苷的堿基上的上的H被其它基團(tuán)取代被其它基團(tuán)取代 甲基甲基m 乙酰基乙?；鵤c 氨基氨基n 甲硫基甲硫基ms 羥基羥基o或或h 硫基硫基s 異戊烯基異戊烯基i 羧基羧基c m N22取代位置核苷取代基的數(shù)目取代基五、修飾成分五、修飾成分HNNOROCH2OHom5 U或hm5 U2021-

23、12-950例：例：HNNORSs4 U2021-12-951N5-甲基胞嘧啶核苷甲基胞嘧啶核苷 m5CN6-甲基腺嘌呤核苷甲基腺嘌呤核苷 m6A2021-12-952OCH2HHOHHOCH3HHO2-O-甲基腺苷Ade(Am)2021-12-953假尿嘧啶核苷，假尿嘧啶核苷，pseudouridine， （3）堿基與戊糖的連接方式不同）堿基與戊糖的連接方式不同U2021-12-9542021-12-955第二節(jié)第二節(jié) RNARNA的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)2021-12-956一、核酸的一級結(jié)構(gòu)一、核酸的一級結(jié)構(gòu)核苷酸殘基沿核酸主鏈核苷酸殘基沿核酸主鏈排列的順序。排列的順序。核苷酸相當(dāng)于氨基酸、核苷酸相

24、當(dāng)于氨基酸、單糖的角色。單糖的角色。2021-12-9573，5-磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵352021-12-958l 核苷酸之間連接方核苷酸之間連接方式：式： 3，5-磷酸二磷酸二酯鍵酯鍵；l 主鏈骨架：主鏈骨架：戊糖和戊糖和磷酸磷酸；l 兩個末端：兩個末端：5-5-磷磷酸端（常用酸端（常用5-P5-P表表示）；示）；3-3-羥基端羥基端（常用（常用3-OH3-OH表示）表示）l 主鏈走向主鏈走向: :核苷酸主核苷酸主鏈具有方向性，走鏈具有方向性，走向為向為53，一級一級結(jié)構(gòu)的書寫和閱讀結(jié)構(gòu)的書寫和閱讀方向也是方向也是53 。2021-12-959核酸一級結(jié)構(gòu)的表示方式核酸一級結(jié)構(gòu)的表示方式DN

25、A RNA5PdAPdCPdGPdTOH 3 5PAPCPGPUOH 或或5ACGTGCGT 3 5ACGUAUGU 3 ACGTGCGT ACGUAUGUT53OH U53OH OH OH OH OH 線條式縮寫線條式縮寫字母式縮寫字母式縮寫2021-12-960l核酸的化學(xué)組成核酸的化學(xué)組成l腺嘌呤、脫氧腺嘌呤核苷、腺嘌呤核苷酸、腺腺嘌呤、脫氧腺嘌呤核苷、腺嘌呤核苷酸、腺嘌呤二核苷酸、腺嘌呤三核苷酸；嘌呤二核苷酸、腺嘌呤三核苷酸；l修飾成分修飾成分2021-12-961l核酸一級結(jié)構(gòu)特點核酸一級結(jié)構(gòu)特點2021-12-962二、各種RNA一級結(jié)構(gòu)的特點l主要功能是參與蛋白質(zhì)的生物合成。主要

26、功能是參與蛋白質(zhì)的生物合成。l1.核糖體核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA ）l含量最豐富，占總含量最豐富，占總RNA的的80%左右左右lrRNA與蛋白質(zhì)形成與蛋白質(zhì)形成核糖體核糖體，一起構(gòu)成了蛋白，一起構(gòu)成了蛋白質(zhì)合成的場所。質(zhì)合成的場所。2021-12-9632021-12-964大腸桿菌核糖體（大腸桿菌核糖體（70S70S）原核生物原核生物30S30S亞基亞基50S50S亞基亞基16S RNA16S RNA（15421542）2121種蛋白質(zhì)種蛋白質(zhì)23S RNA23S RNA（29402940）5S RNA5S RNA（120120）3434種蛋白質(zhì)種蛋白質(zhì)高等動物核糖

27、體（高等動物核糖體（80S80S）40S40S亞基亞基60S60S亞基亞基18S RNA18S RNA（18741874）3333種蛋白質(zhì)種蛋白質(zhì)28S RNA28S RNA（47184718）5.8S RNA5.8S RNA（160160）4949種蛋白質(zhì)種蛋白質(zhì)2021-12-9652.轉(zhuǎn)移 RNA（transfer RNA，tRNA）l占總占總RNA的的15%l在蛋白質(zhì)的生物合成中，在蛋白質(zhì)的生物合成中，起起攜帶氨基酸攜帶氨基酸的作用。的作用。l5-末端總是末端總是磷酸化，常為磷酸化，常為pG。l3-末端最后三個核苷酸順末端最后三個核苷酸順序相同，總是序相同，總是CCAOH。l存在較多的

28、存在較多的甲基化堿基甲基化堿基。2021-12-9663.信使信使 RNA（messenger RNA，mRNA）l占總占總RNA的的5%，相對分子質(zhì)量較大，代謝活躍，相對分子質(zhì)量較大，代謝活躍l在蛋白質(zhì)生物合成中起著在蛋白質(zhì)生物合成中起著模板模板的作用。的作用。l真核細(xì)胞真核細(xì)胞mRNAl5 末端帽子結(jié)構(gòu)：末端帽子結(jié)構(gòu)：m7GpppXPY，識別翻譯起始識別翻譯起始l3 末端有多聚腺苷酸尾巴結(jié)構(gòu)末端有多聚腺苷酸尾巴結(jié)構(gòu)(polyA)，維持維持mRNA的穩(wěn)定性的穩(wěn)定性AAAA Anm7GpppAUG GUGUAA5 3 5 帽子結(jié)構(gòu)帽子結(jié)構(gòu) 密碼子密碼子 3 多聚多聚A尾尾 5 5 非編碼區(qū)非編

29、碼區(qū) 編碼區(qū)編碼區(qū) 3 3 非編碼區(qū)非編碼區(qū)2021-12-9672021-12-968核酸的一級結(jié)構(gòu)核酸的一級結(jié)構(gòu) 序列測定序列測定英國英國 SangerSanger1955 1955 確定牛胰島素結(jié)構(gòu)，確定牛胰島素結(jié)構(gòu)，1958 1958 獲諾貝爾化學(xué)獎獲諾貝爾化學(xué)獎1975 1975 設(shè)計出設(shè)計出DNADNA測序法，測序法，1980 1980 獲諾貝爾化學(xué)獎獲諾貝爾化學(xué)獎2021-12-9692021-12-970末端終止法末端終止法Sanger22，33雙脫氧核苷三磷酸雙脫氧核苷三磷酸（ddNTPddNTP）是）是DNADNA合成鏈延伸的合成鏈延伸的抑制抑制劑劑。2021-12-971

30、2021-12-972DNA序列分析儀：序列分析儀：四色熒光基團(tuán)標(biāo)記的dNTP2021-12-973三、三、RNA的高級結(jié)構(gòu)的高級結(jié)構(gòu)l堿基按一定規(guī)律形成堿基按一定規(guī)律形成堿基堿基對對（base pair, bp）lRNA鏈由于自身回折的結(jié)鏈由于自身回折的結(jié)果可以形成果可以形成“發(fā)卡發(fā)卡”（hairpin）結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)l“發(fā)卡發(fā)卡” 結(jié)構(gòu)可進(jìn)而形結(jié)構(gòu)可進(jìn)而形成螺旋結(jié)構(gòu)成螺旋結(jié)構(gòu)l不能形成堿基配對的形成不能形成堿基配對的形成“突環(huán)突環(huán)”（loop）2021-12-974ltRNA的二級結(jié)構(gòu)的二級結(jié)構(gòu) l酵母丙氨酸酵母丙氨酸t(yī)RNA（tRNAAla）l分子中含有較多的分子中含有較多的修飾成修飾成分分（

31、10-20%）l3-末端都具有末端都具有CCAOH的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)l5-末端磷酸化，常為末端磷酸化，常為G（pC）l“三葉草三葉草”l四臂四環(huán)四臂四環(huán)P2021-12-975l氨基酸臂：氨基酸臂：由由7對對bp組成，富含組成，富含G，末端為，末端為CCA，接受活化，接受活化AAl二氫尿嘧啶環(huán)（二氫尿嘧啶環(huán)（D環(huán)）：環(huán)）：由由812個核苷酸個核苷酸組成組成l反密碼環(huán)：反密碼環(huán)：識別密碼子識別密碼子l額外環(huán)：額外環(huán)：大小是大小是tRNA分類的重要指標(biāo)分類的重要指標(biāo)l假尿嘧啶核苷假尿嘧啶核苷-胸腺嘧啶核苷環(huán)胸腺嘧啶核苷環(huán)（T C環(huán)）環(huán)）2021-12-976tRNAAla三級結(jié)構(gòu)特點l像一個倒像一個倒“

32、L”形形l兩個螺旋區(qū)兩個螺旋區(qū)：氨基酸臂：氨基酸臂和和T C臂形成；臂形成；D臂和臂和反密碼子臂形成。反密碼子臂形成。l倒倒“L”的的拐角拐角： T C環(huán)和環(huán)和D環(huán)環(huán)l倒倒“L”形的形的一端是一端是3-CCA-OH；另一端是反另一端是反密碼子環(huán)密碼子環(huán)。2021-12-977基因與基因組基因與基因組基因（基因（genegene）：一段有功能的）：一段有功能的DNADNA片段，生物細(xì)胞中片段，生物細(xì)胞中DNADNA分子的最小功能單位（交換單位）。分子的最小功能單位（交換單位）。 蛋白質(zhì)（蛋白質(zhì)（mRNA mRNA 蛋白質(zhì)）蛋白質(zhì)）產(chǎn)物產(chǎn)物 tRNAtRNA RNA RNA rRNA rRNA 調(diào)

33、節(jié)功能：調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)功能：調(diào)節(jié)基因無產(chǎn)物無產(chǎn)物 作用未知作用未知結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因第三節(jié)第三節(jié) DNA的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)2021-12-978基因組（基因組（genomegenome）：某生物體（完整單倍體）所含全部遺：某生物體（完整單倍體）所含全部遺傳物質(zhì)的總和。傳物質(zhì)的總和。包括：核基因組（擬核包括：核基因組（擬核/ /核核DNADNA）及核外（質(zhì)粒）及核外（質(zhì)粒/ /質(zhì)體質(zhì)體DNADNA） bp bp（堿基對（堿基對） 103 104 105 106 107 108 109 1010 1011 1012人人兩棲兩棲類類魚類魚類藻類藻類酵母酵母細(xì)菌細(xì)菌E.ColE.Coli i病毒病毒質(zhì)粒質(zhì)粒各種

34、細(xì)胞、病毒和細(xì)菌質(zhì)粒中基因組的大小各種細(xì)胞、病毒和細(xì)菌質(zhì)粒中基因組的大小2021-12-979原核生物基因組特點原核生物基因組特點l 重復(fù)序列少，多位編碼區(qū)重復(fù)序列少，多位編碼區(qū)l 多為操縱子形式組織多為操縱子形式組織l 有重疊基因存在有重疊基因存在真核生物基因組特點真核生物基因組特點l 以染色體存在以染色體存在l 重復(fù)序列多重復(fù)序列多 2021-12-980一、一、DNA的二級結(jié)構(gòu)（重點）的二級結(jié)構(gòu)（重點） DNA的二級結(jié)構(gòu)指的二級結(jié)構(gòu)指DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)的雙螺旋結(jié)構(gòu)2021-12-9812021-12-982（一）（一）DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的研究背景雙螺旋結(jié)構(gòu)的研究背景 堿基組成分析堿基組成分

35、析Chargaff 規(guī)則：規(guī)則：A = T G = CA+C=G+TA+G=C+T 堿基的理化數(shù)據(jù)分析堿基的理化數(shù)據(jù)分析A-T、G-C以氫鍵以氫鍵配對配對互補(bǔ)配對原則的重要性互補(bǔ)配對原則的重要性 DNA纖維的纖維的X-線衍射圖譜分析線衍射圖譜分析 2021-12-9832021-12-984（二）（二）DNA雙螺旋模型要點雙螺旋模型要點1、主鏈：兩條、主鏈：兩條右手螺旋右手螺旋的的多核苷酸鏈反向平行，圍多核苷酸鏈反向平行，圍繞同一中心軸纏繞。磷酸繞同一中心軸纏繞。磷酸和核糖在外側(cè)，堿基位于和核糖在外側(cè)，堿基位于雙螺旋的內(nèi)側(cè)，堿基平面雙螺旋的內(nèi)側(cè)，堿基平面互相平行并且與縱軸垂直。互相平行并且與縱

36、軸垂直。兩條鏈的磷酸二酯鍵的方兩條鏈的磷酸二酯鍵的方向相反，習(xí)慣上把向相反，習(xí)慣上把35向定為正向；向定為正向；2、堿基：堿基互補(bǔ)配對，、堿基：堿基互補(bǔ)配對，A、T形成形成兩個兩個氫鍵；氫鍵；G、C形形成成三個三個氫鍵。氫鍵。2.0 nm大大溝溝2021-12-9852.0 nm小小溝溝大大溝溝3、螺旋參數(shù)、螺旋參數(shù)雙螺旋的直徑為雙螺旋的直徑為2nm，螺距螺距3.4nm，每圈螺旋含，每圈螺旋含10個個核苷酸殘基。相鄰堿核苷酸殘基。相鄰堿基的距離為基的距離為0.34nm，相鄰，相鄰堿基的夾角堿基的夾角36。4、螺旋表面、螺旋表面表面有表面有大溝和小溝大溝和小溝。2021-12-986（三）穩(wěn)定雙

37、螺旋結(jié)構(gòu)的作用力（三）穩(wěn)定雙螺旋結(jié)構(gòu)的作用力堿基配對的堿基配對的氫鍵氫鍵。GC含量越多，越穩(wěn)定。含量越多，越穩(wěn)定。堿基堆積作用堿基堆積作用在維系在維系DNA二級結(jié)構(gòu)上更重要二級結(jié)構(gòu)上更重要（主要因素）（主要因素）離子鍵離子鍵：磷酸基上的負(fù)電荷與介質(zhì)中的陽離子：磷酸基上的負(fù)電荷與介質(zhì)中的陽離子或組蛋白的正離子之間形成?；蚪M蛋白的正離子之間形成。2021-12-987（四）（四）DNADNA雙螺旋的多樣性雙螺旋的多樣性類型類型旋轉(zhuǎn)方向旋轉(zhuǎn)方向螺旋直徑螺旋直徑（nm）螺距螺距（nm）每轉(zhuǎn)堿基每轉(zhuǎn)堿基對數(shù)目對數(shù)目堿基對間垂直堿基對間垂直距離（距離（nm）堿基對與水堿基對與水平面傾角平面傾角ADNABD

38、NAZDNA右右右右左左2.02.31.82.83.44.51110120.2550.340.2720072021-12-988l（五）生物學(xué)意義（五）生物學(xué)意義l第一次描述了第一次描述了DNA分子的結(jié)構(gòu)，提出了遺分子的結(jié)構(gòu)，提出了遺傳信息的儲存方式以及傳信息的儲存方式以及DNA的復(fù)制機(jī)理，的復(fù)制機(jī)理，對對DNA復(fù)制、基因遺傳、復(fù)制、基因遺傳、RNA翻譯、基因翻譯、基因表達(dá)、調(diào)控表達(dá)、調(diào)控等方面的研究都奠定了基礎(chǔ)，等方面的研究都奠定了基礎(chǔ)，揭開了分子生物學(xué)研究的序幕，為分子遺揭開了分子生物學(xué)研究的序幕，為分子遺傳學(xué)的研究奠定了基礎(chǔ)。傳學(xué)的研究奠定了基礎(chǔ)。2021-12-989二、二、DNADN

39、A的三級結(jié)構(gòu)的三級結(jié)構(gòu)lDNADNA雙螺旋的進(jìn)一步扭曲雙螺旋的進(jìn)一步扭曲構(gòu)成三級結(jié)構(gòu)構(gòu)成三級結(jié)構(gòu)l超螺旋是超螺旋是DNADNA三級結(jié)構(gòu)的三級結(jié)構(gòu)的一種常見形式一種常見形式l即即DNADNA雙螺旋的螺旋雙螺旋的螺旋l正超螺旋和負(fù)超螺旋正超螺旋和負(fù)超螺旋螺螺旋旋超螺旋超螺旋2021-12-9902021-12-9912021-12-992核小體核小體組蛋白組蛋白八聚體八聚體連接連接DNAH1組蛋白組蛋白真核細(xì)胞染色質(zhì)的組裝真核細(xì)胞染色質(zhì)的組裝真核生物染色體DNA組裝不同層次的結(jié)構(gòu)DNA （2nm）核小體鏈（核小體鏈（ 11nm，每個核小體，每個核小體200bp）纖絲（纖絲（ 30nm，每圈，每圈6

40、個核小體個核小體）突環(huán)（突環(huán)（ 150nm，每個突環(huán)大約，每個突環(huán)大約75000bp）玫瑰花結(jié)（玫瑰花結(jié)（ 300nm ，6個突環(huán)個突環(huán)）螺旋圈（螺旋圈（ 700nm，每圈，每圈30個玫瑰花個玫瑰花）染色體（染色體（ 1400nm）2021-12-994l如果人體有如果人體有1014個細(xì)胞，每個體細(xì)胞的個細(xì)胞，每個體細(xì)胞的DNA 含量含量為為6.4109個堿基對。試計算人體個堿基對。試計算人體DNA 的總長度的總長度是多少？是太陽是多少？是太陽-地球之間距離（地球之間距離（2.2109 公里）公里）的多少倍？的多少倍？l每個體細(xì)胞的每個體細(xì)胞的DNA 的總長度為：的總長度為：6.41090.3

41、4nm = 2.176109nm= 2.176m。l人體內(nèi)所有體細(xì)胞的人體內(nèi)所有體細(xì)胞的DNA 的總長度為：的總長度為：2.176m1014 = 2.1761011kml這個長度與太陽這個長度與太陽-地球之間距離（地球之間距離（2.2109公里）公里）相比為：相比為：2.1761011/2.2109 = 99 倍。倍。2021-12-995第四節(jié) 核酸及核苷酸的性質(zhì)一、溶解性一、溶解性二、核酸及其組分的兩性性質(zhì)二、核酸及其組分的兩性性質(zhì)三、紫外吸收三、紫外吸收 四、核酸的變性與復(fù)性四、核酸的變性與復(fù)性 2021-12-996一、溶解性lRNARNA、核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶堿呈、核苷酸、核苷、

42、嘌呤和嘧啶堿呈白色結(jié)白色結(jié)晶或粉末晶或粉末lDNADNA：疏松的石棉纖維狀固體疏松的石棉纖維狀固體l兩性解離兩性解離 / 一般呈酸性（在中性溶液中帶負(fù)電一般呈酸性（在中性溶液中帶負(fù)電荷），微荷），微 溶于水，不溶于有機(jī)溶劑溶于水，不溶于有機(jī)溶劑l0.14摩爾法摩爾法2021-12-997二、核酸及其組分的兩性性質(zhì)l磷酸基、含氮堿基磷酸基、含氮堿基l（一）堿基的解離（一）堿基的解離ONH2NH+NHONH2NNHO-NH2NNH212.5pK 14.6pK HH2021-12-998l（二）核苷的解離（二）核苷的解離l戊糖可增強(qiáng)堿基的酸性解離戊糖可增強(qiáng)堿基的酸性解離l核糖中的羥基也可發(fā)生解離核糖

43、中的羥基也可發(fā)生解離l（三）核苷酸及核酸分子的解離（三）核苷酸及核酸分子的解離l磷酸基使核苷酸具有很強(qiáng)的酸性磷酸基使核苷酸具有很強(qiáng)的酸性l（四）核苷酸與核酸的等電點（四）核苷酸與核酸的等電點lDNADNA等電點為等電點為4 44.54.5；lRNARNA等電點為等電點為2 22.52.52021-12-999三、核酸的紫外吸收特性三、核酸的紫外吸收特性l核酸的核酸的堿基堿基具有共扼雙鍵，具有共扼雙鍵，因而有紫外吸收性質(zhì)，吸收因而有紫外吸收性質(zhì)，吸收峰在峰在260nm（蛋白質(zhì)的紫（蛋白質(zhì)的紫外吸收峰在外吸收峰在280nm）。）。l可利用紫外分光光度計測定可利用紫外分光光度計測定各波長下的光吸收值

44、各波長下的光吸收值（absorbance, A）lA260或或OD260：樣品在波長樣品在波長260nm下的光吸收值下的光吸收值2021-12-9100核酸的紫外吸收的應(yīng)用核酸的紫外吸收的應(yīng)用l1.核酸及其組分含量的測定核酸及其組分含量的測定l核酸濃度與核酸濃度與A260成正比成正比l1 g/ml DNA， A260=0.020；l1 g/ml RNA， A260=0.025；lA260=1.0相當(dāng)于相當(dāng)于l50g/ml雙鏈雙鏈DNAl40g/ml單鏈單鏈DNA（或（或RNA）2021-12-9101l2.核酸純度的測定核酸純度的測定l通過測定通過測定260nm和和280nm的光吸收比值的光吸

45、收比值lDNA純品純品: A260/A280 = 1.8lRNA純品純品: A260/A280 = 2.0l含雜蛋白及苯酚，含雜蛋白及苯酚，1.82021-12-9102四、核酸的變性與復(fù)性l(一一) 核酸的變性核酸的變性（denaturation）l1.核酸變性的概念核酸變性的概念l某些理化因素會破壞某些理化因素會破壞氫鍵和堿基堆積力氫鍵和堿基堆積力，使核，使核酸分子的高級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而引起核酸理酸分子的高級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而引起核酸理化性質(zhì)及生物學(xué)功能發(fā)生改變化性質(zhì)及生物學(xué)功能發(fā)生改變l變性因素：加熱、過高過低的變性因素：加熱、過高過低的pH值、有機(jī)溶值、有機(jī)溶劑、尿素及酰胺等。劑、尿

46、素及酰胺等。2021-12-9103DNA變性2021-12-9104l2. 2. 變性的實質(zhì)變性的實質(zhì)l某些理化因素破壞了氫鍵和堿基堆積力，使核某些理化因素破壞了氫鍵和堿基堆積力，使核酸分子高級結(jié)構(gòu)改變、理化性質(zhì)及生物活性發(fā)酸分子高級結(jié)構(gòu)改變、理化性質(zhì)及生物活性發(fā)生改變。生改變。l不涉及磷酸二酯鍵斷裂，一級結(jié)構(gòu)不變不涉及磷酸二酯鍵斷裂，一級結(jié)構(gòu)不變2021-12-9105降解：核苷酸骨架上降解：核苷酸骨架上3，5 -磷酸二酯鍵的斷裂磷酸二酯鍵的斷裂DNADNA變性的本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂變性的本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂2021-12-9106l3.3.變性后理化性質(zhì)變化變性后理化性質(zhì)變化l粘度下

47、降，某些顏色反應(yīng)增強(qiáng)，生物學(xué)功能改粘度下降，某些顏色反應(yīng)增強(qiáng)，生物學(xué)功能改變等變等l紫外吸收增加紫外吸收增加增色效應(yīng)增色效應(yīng)2021-12-91072021-12-9108l4、DNA熱熱變性的特征變性的特征l變性過程是變性過程是“躍變式躍變式”的，的，而非漸變而非漸變l將引起將引起DNA變性的溫度稱為變性的溫度稱為熔熔點（點（melting temperature，Tm）l指增色效應(yīng)達(dá)指增色效應(yīng)達(dá)50%時的溫度時的溫度（或（或DNA變性一半所需溫度）變性一半所需溫度）l一般一般DNA Tm 值在值在85 - 90 C之間之間2021-12-9109lTm值大小與下列因素有關(guān)：值大小與下列因素

48、有關(guān)：l（1）DNA的均一性：的均一性：l（2）GC含量：含量：l經(jīng)驗公式：經(jīng)驗公式： (G+C)%（Tm69.3）2.44l（3）介質(zhì)中的離子強(qiáng)度：）介質(zhì)中的離子強(qiáng)度：2021-12-9110某些某些DNADNA的的TmTm值值60801001 .01 .41 .2100%A260t 0CTmTmTmTmTmTm1232021-12-9111(二)核酸的復(fù)性（renaturation）l被拆開的兩股多核苷酸鏈重新由氫鍵連接而成被拆開的兩股多核苷酸鏈重新由氫鍵連接而成雙螺旋結(jié)構(gòu)雙螺旋結(jié)構(gòu)復(fù)性復(fù)性l變性過程的逆過程變性過程的逆過程l熱變性的熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，這一經(jīng)緩慢冷卻后即可

49、復(fù)性，這一過程稱為過程稱為退火退火(annealing) 。2021-12-9112DNA復(fù)性2021-12-9113l分子量越大復(fù)性越難；分子量越大復(fù)性越難；l濃度越大，復(fù)性越容易；濃度越大，復(fù)性越容易；l減色效應(yīng)（低色效應(yīng)）減色效應(yīng)（低色效應(yīng)）復(fù)性時紫外吸收減復(fù)性時紫外吸收減少的現(xiàn)象少的現(xiàn)象2021-12-9114第第5 5節(jié)節(jié) 核酸的研究方法核酸的研究方法 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）核酸的凝膠電泳核酸的凝膠電泳核酸的分子印跡技術(shù)核酸的分子印跡技術(shù)2021-12-91151.概述l聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCRPCR）體外擴(kuò)增）體外擴(kuò)增DNADNA已成為應(yīng)用最廣泛已成

50、為應(yīng)用最廣泛的一種生物技術(shù)。的一種生物技術(shù)。l19851985年年K. MullisK. Mullis在研究在研究DNADNA聚合酶反應(yīng)時發(fā)明了這項技聚合酶反應(yīng)時發(fā)明了這項技術(shù)。最初采用術(shù)。最初采用KlenowKlenow酶來擴(kuò)增酶來擴(kuò)增DNADNA，但每次加熱變性，但每次加熱變性DNADNA時都會使酶失活，需要重新添加時都會使酶失活，需要重新添加DNADNA聚合酶，因此使用聚合酶，因此使用不方便。不方便。19881988年年SaikiSaiki等人用耐熱的等人用耐熱的TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶取代取代KlenowKlenow酶之后，才使這項技術(shù)成熟，從而得到各方面的酶之后，才使

51、這項技術(shù)成熟，從而得到各方面的應(yīng)用。應(yīng)用。一、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（一、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCRPCR）2021-12-91162.步驟l（1 1）設(shè)計）設(shè)計一對引物一對引物以便有效擴(kuò)增所需要的以便有效擴(kuò)增所需要的DNADNA序列，并盡序列，并盡量減少可能產(chǎn)生的非特異產(chǎn)物。量減少可能產(chǎn)生的非特異產(chǎn)物。l（2 2）優(yōu)化反應(yīng)體系，以便獲得最好的擴(kuò)增效果。該反應(yīng)）優(yōu)化反應(yīng)體系，以便獲得最好的擴(kuò)增效果。該反應(yīng)體系應(yīng)包括適量體系應(yīng)包括適量模板模板(1 ng(1 ng0.001 ng0.001 ng) )，引物引物（100 100 pmol/100 ulpmol/100 ul）, ,4 4種種dNTPdNTP(200 umol(200 umol/L/L）TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶