第二章 微生物菌種選育(筆記類)

1、第二章      工業(yè)微生物基礎(chǔ) 知識要點(diǎn)和教學(xué)要求1）、了解微生物的特點(diǎn)2）、了解常見的工業(yè)微生物3）、掌握工業(yè)微生物菌種的分離和選育4）、掌握工業(yè)微生物菌種的改良5）、掌握工業(yè)微生物菌種的保藏6）、掌握工業(yè)微生物菌種的擴(kuò)大培養(yǎng) 能力培養(yǎng)要求通過本章節(jié)的學(xué)習(xí)，學(xué)生能掌握工業(yè)微生物菌種的分離和選育、改良和保藏方法，以及菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的基本工藝。 教案內(nèi)容2.1微生物的特點(diǎn) （1）種類多，分布廣 目前已發(fā)現(xiàn)的微生物在10萬種以上。不同種類的微生物具有不同的代謝方式，能分解各式各樣的有機(jī)物質(zhì)和無機(jī)物質(zhì)，當(dāng)前國內(nèi)外積極利用微生物來防治公害，分解三廢中許

2、多毒性強(qiáng)、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的物質(zhì)。另一方面，不同微生物在生化過程中積累不同的代謝產(chǎn)物，所以發(fā)酵工業(yè)上常利用各種微生物來生產(chǎn)各種產(chǎn)品，如酒類、酒精、丙酮丁醇、抗生素、酶制劑、有機(jī)酸、氨基酸、核酸、維生素、菌體蛋白、醫(yī)藥產(chǎn)品和化工產(chǎn)品等到。 （2）高面積-體積比，代謝能力強(qiáng) （3）生長迅速，繁殖快 （4）適應(yīng)性強(qiáng)，容易培養(yǎng) （5）易變性   2.2常見的工業(yè)微生物     廣義的微生物包括病毒、立克次氏體、細(xì)菌、放線菌、酵母菌、霉菌、單細(xì)胞藻類、原生動(dòng)物和支原體等。在發(fā)酵工業(yè)中經(jīng)常遇到的是細(xì)菌、放線菌、酵母菌、霉菌及危害、放線菌生長的噬菌體。 微生物工業(yè)的范圍 微生

3、物工業(yè)越來越深地同國民經(jīng)濟(jì)各部門發(fā)生關(guān)系，涉及的范圍十分廣泛，而且越來越大，大致可分為下列14類： （1）釀酒工業(yè)（啤酒、葡萄酒、白酒等） （2）食品工業(yè)（醬、醬油、食醋、腐乳、面包、酸乳等） （3）有機(jī)溶劑發(fā)酵工業(yè)（酒精、丙酮、丁醇等） （4）抗生素發(fā)酵工業(yè)（青霉素、鏈霉素、土霉素等） （5）酶制劑發(fā)酵工業(yè)（檸檬酸、葡萄糖酸等） （6）酶制劑發(fā)酵工業(yè)（淀粉酶、蛋白酶等） （7）氨基酸發(fā)酵工業(yè)（谷氨酸、賴氨酸等） （8）核苷酸類物質(zhì)發(fā)酵工業(yè)肌苷酸、肌苷等） （9）維生素發(fā)酵工業(yè)（維生素B2、維生素B12等） （10）生理活性物質(zhì)發(fā)酵工業(yè)（激素、赤霉素等） （11）微生物菌體蛋白發(fā)酵工業(yè)（酵母、

4、單細(xì)胞蛋白等） （12）微生物環(huán)境凈化工業(yè)（利用微生物處理廢水、污水等） （13） 生物能工業(yè)（沼氣、纖維素等天然原料發(fā)酵生產(chǎn)酒精、乙烯等能源物質(zhì)） （14）微生物冶金工業(yè)（利用微生物探礦、冶金、石油脫硫等）  2.3工業(yè)微生物菌種的分離和選育   2.3.1微生物菌種的分離 從自然界分離新菌種一般包括以下幾個(gè)步驟；采樣、增殖培養(yǎng)、純種分離和性能測定等幾個(gè)步驟。 1.采樣：采樣地點(diǎn)的確定要根據(jù)篩選的目的、微生物的分布概況及菌種的主要特征與外界環(huán)境關(guān)系等，進(jìn)行綜合、具體地分析來決定。如果預(yù)先不了解某種生產(chǎn)菌的具體來源，一般可從土壤中分離。 采土方法多在選好地點(diǎn)后，用

5、小鏟去除表土，取離地面5-15cm處的土壤幾十克，盛入預(yù)先消毒好的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，記錄采樣時(shí)間、地點(diǎn)、環(huán)境情況等，以備查考。一般土壤中芽孢桿菌、放線菌和霉素的孢子 2.增殖培養(yǎng)：收集到的樣品，如含所需菌種較多，可直接進(jìn)行分離。如果樣品含所需菌種很少，就要設(shè)法增加該菌的數(shù)量，進(jìn)行增殖（富集）。所謂增殖培養(yǎng)就是給混合菌群提供一些有利于所需菌株生長或不利于其他菌型生長的條件以促使所需菌株大量繁殖，從而有利于分離它們。例如篩選纖維素酶產(chǎn)生菌時(shí)，以纖維素作為唯一碳源進(jìn)行增殖培養(yǎng)，使得不能分解纖維素的菌不能生長；篩選脂肪酶產(chǎn)生菌時(shí)，以植物油作為唯一碳源進(jìn)行增殖培養(yǎng)，能更快更準(zhǔn)確地將脂肪酶產(chǎn)生菌分

6、離出來。 3.純種分離：通過增殖培養(yǎng)還不能得到微生物的純種，生產(chǎn)菌在自然條件下通常是與各種菌混雜在一起的，所以有必要進(jìn)行分離純化，才能獲得純種。分離方法很多，常用的有劃線法和稀釋法。 4.生產(chǎn)性能的測定：一般采用兩步法，即初篩和復(fù)篩，經(jīng)過多次重復(fù)篩選，直至獲得者-3株較好的菌株，供發(fā)酵條件的摸索和生產(chǎn)試驗(yàn)，進(jìn)而作為育種的出發(fā)菌株。 2.3.2菌種選育 菌種選育就是按照生產(chǎn)的要求，根據(jù)微生物的遺傳和變異的理論，用人工方法造成菌種變異，再經(jīng)過篩選而達(dá)到菌種選育的目的。育種的目的，就是要改善菌種的特性，使能提高產(chǎn)量、改進(jìn)質(zhì)量、降低成本、改革工藝、方便管理及綜合利用等。工業(yè)微生物育種的基本方法的包括自

7、然選育、生產(chǎn)育種、抗噬菌體菌株的選育、誘變育種、代謝控制育種及基因重組定向育種等。誘變育種一般采用物理、化學(xué)誘變因素使微生物DNA的堿基排列發(fā)生變化，以使排列錯(cuò)誤的DNA模板形成異常的遺傳信息，造成某些蛋白結(jié)構(gòu)變異，而使細(xì)胞的功能發(fā)生改變。代謝控制育種主要有兩個(gè)方面：一方面是改變代謝通路的育種，另一方面改變代謝自動(dòng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)的育種。而基因重級的方法一般有轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)及雜交等。有關(guān)育種的方法在微生物學(xué)中已詳細(xì)介紹，這里不再贅述。   2.5工業(yè)微生物菌種的保藏 菌種保藏的目的在于使菌種的生命得以延續(xù)并保持它們原有的生物學(xué)特性。在基礎(chǔ)的 研究中，可保證同一菌種在工作過程及工作結(jié)束后，均可獲得

8、重復(fù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。對于有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的生產(chǎn)菌，良好的保藏條件可保持其高產(chǎn)、高抗性等優(yōu)良的性能。對于通過生物工程技術(shù)所得的重組菌，則需保持其遺傳特性的穩(wěn)定。 菌種的保藏方法有很多，但其基本原理是大同不異的，主要是根據(jù)微生物生理、生化特點(diǎn)，人工地創(chuàng)造條件，使微生物處于代謝不活潑、生長繁殖受抑制的休眠狀態(tài)。這些人式造成的環(huán)境主要是低溫、干燥、缺氧三方面，使菌株盡可能少發(fā)生突變，以達(dá)到保持純種的目的。 2.5.1 斜面保藏法和穿刺保藏法 2.5.2 干燥保藏法 2.5.3 懸液保藏法 2.5.4 冷凍干燥保藏法 2.5.5 液氨保藏法 2.5.6 低溫保藏法 2.6 工業(yè)微生物菌種的擴(kuò)大培養(yǎng) 2.6.1 微

9、生物的培養(yǎng)方法 1.表面培養(yǎng) 表面培養(yǎng)是將純種微生物接種在固體或液體培養(yǎng)基的表面的在恒溫條件下進(jìn)行靜置培養(yǎng)的方法。如實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行的固體斜面培養(yǎng)、固體平板培養(yǎng)都是表面培養(yǎng)；進(jìn)行液體培養(yǎng)時(shí)，若細(xì)胞在液面生長繁殖，形成一層膜狀物，也為表面培養(yǎng)。表面培養(yǎng)的特點(diǎn)是生長在培養(yǎng)基表面上的微生物既能與空氣接觸吸收氧氣，又能與培養(yǎng)基接觸吸收營養(yǎng)。但是由于表面培養(yǎng)近于自然培養(yǎng)，因此存在生長緩慢，占用面積大，容易染菌等缺點(diǎn)，在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中很少采用，僅在實(shí)驗(yàn)室或小試中用得較多。 微生物類別微生物名稱產(chǎn)物用 途細(xì)菌短桿菌味精、谷氨酸食用、醫(yī)藥肌苷酸枯草桿菌淀粉酶酒精濃醪發(fā)酵、啤酒釀造、葡萄糖制造、糊精制造、糖漿制造

10、、紡織品退漿、銅板紙加工、洗衣業(yè)、香料加工（除去淀粉）蛋白酶皮革脫毛柔化、膠卷回收銀、絲綢脫膠、醬油速釀、水解蛋白、飼料、明膠制造、洗衣業(yè)梭狀桿丙酮、丁醇工業(yè)有機(jī)溶劑巨大芽孢桿菌葡萄糖異構(gòu)酶由葡萄糖制造果糖大腸桿菌酰胺酶制造新型青霉素節(jié)桿菌強(qiáng)的松醫(yī)藥蠟狀芽孢桿菌青霉素酶青霉素的檢定、抵抗青霉素敏感癥酵母菌酒精酵母酒精工業(yè)、醫(yī)藥酵母甘油醫(yī)藥、軍工假絲酵母石油及蛋白制工業(yè)造低凝固點(diǎn)石油及酵母菌體蛋白環(huán)烷酸工業(yè)啤酒酵母細(xì)胞色素丙醫(yī)藥輔酶甲酵母片凝血質(zhì)類酵母脂肪酶醫(yī)藥、紡織脫臘、洗衣業(yè)阿氏假囊酵母核黃素醫(yī)藥脆壁酵母乳糖酶食品工業(yè)2.固體培養(yǎng) 固體培養(yǎng)法是將純種微生物接種在固體培養(yǎng)基上。工業(yè)上常用大米、

11、麩皮、米糠、谷殼、木屑等為基本原料，適當(dāng)補(bǔ)充一些其他營養(yǎng)成分和水分，經(jīng)滅菌后制成微生物培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基的特點(diǎn)是疏松，在培養(yǎng)基內(nèi)部充滿了空氣，因此既可以靜置培養(yǎng)，又可以通風(fēng)培養(yǎng)。固體培養(yǎng)是介于表面培養(yǎng)和深層培養(yǎng)之間的一種培養(yǎng)方式，它的優(yōu)點(diǎn)是設(shè)備簡單，投資少，適合于小規(guī)模生產(chǎn)。缺點(diǎn)是占地面積大，勞動(dòng)強(qiáng)度高，產(chǎn)品質(zhì)量不太穩(wěn)定。   3.液體深層培養(yǎng) 液體深層培養(yǎng)又叫液體通風(fēng)培養(yǎng)，菌體在液體培養(yǎng)基中處于懸浮狀態(tài)，導(dǎo)入培養(yǎng)基中的空氣通過氣液界面?zhèn)髻|(zhì)進(jìn)入液相，再擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。液體深層培養(yǎng)是在專門的發(fā)酵罐中進(jìn)行的。它的優(yōu)點(diǎn)是可以根據(jù)微生物在生長過程中對碳源、氮源、生長因子等營養(yǎng)物質(zhì)及溫度、P

12、H值、需氧量等條件的不同需要，合理配制，補(bǔ)加各種營養(yǎng)物質(zhì)和隨時(shí)調(diào)節(jié)溫度、PH值和通風(fēng)量，這就有可能把微生物培養(yǎng)過程的生長、代謝都控制在最佳狀態(tài)而收到最好的培養(yǎng)效果。 微生物類別 微生物名稱 產(chǎn)物 用 途 霉   菌 黑曲霉 檸檬酸 工業(yè)、食用、醫(yī)藥 柚甙酶 桔柑罐頭脫除苦味 酸性蛋白酶 啤酒防濁劑、消化劑、飼料 單寧酶 分解單寧、制造沒食子酸、酶的精制 糖化酶 酒表發(fā)酵工業(yè) 棲土曲霉 蛋白酶 同上 根霉 根霉糖化酶 葡萄糖制造、酒精廠糖化用   甾體激素 醫(yī)藥 土曲霉 甲義丁二酸 工業(yè) 赤霉菌 赤霉素 農(nóng)業(yè)、植物生長激素 梨頭霉 甾體激素 醫(yī)藥 青霉菌 青霉素 醫(yī)藥

13、60; 葡萄糖氧化酶 蛋白除去葡萄糖、脫氧、食品罐頭貯存、醫(yī)藥 灰黃霉菌 灰黃霉素 醫(yī)藥 木霉菌 纖維素酶 淀粉和食品加工、飼料 黃曲霉菌 淀粉酶 醫(yī)藥、工業(yè) 紅曲霉 紅曲霉糖化酶 葡萄糖制造、酒精廠糖化用 放線菌 各類放線菌 鏈霉素 醫(yī)藥 氯霉素 土霉素 金霉素 紅霉素 新生霉素 卡那霉素 小單孢菌 慶大霉素 醫(yī)藥 灰色放線菌 蛋白酶 同上 球孢放線菌 甾體激素 醫(yī)藥  2.7 種子擴(kuò)大培養(yǎng) 1、種子擴(kuò)大培養(yǎng)的任務(wù)現(xiàn)代的發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模越來越大，每只發(fā)酵罐的容積有幾十立方米甚至幾百立方米，要使小小的微生物在幾十小時(shí)的較短時(shí)間內(nèi)，完成如此巨大的發(fā)酵轉(zhuǎn)化任務(wù)，那就必須具備數(shù)量巨大的微生

14、物細(xì)胞才行。菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的目的就是要為每次發(fā)酵罐的投料，提供相當(dāng)數(shù)量的代謝旺盛的種子。因?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間的長短和接種量的大小有關(guān)，接種量大，發(fā)酵時(shí)間則短。將較多數(shù)量的成熟菌體接入發(fā)酵罐中，就有利于縮短發(fā)酵時(shí)間，提高發(fā)酵罐利用率，并且也有利于減少染菌的機(jī)會(huì)。因此，種子擴(kuò)大培養(yǎng)的任務(wù)，不但要得到純而壯的培養(yǎng)物，而且要獲得活力旺盛的、接種數(shù)量足夠的培養(yǎng)物。對于不同產(chǎn)品的發(fā)酵過程來說，必須根據(jù)菌種生長繁殖速度快慢來決定種子擴(kuò)大培養(yǎng)的級數(shù)?？股厣a(chǎn)中，放線菌的細(xì)胞生長繁殖速度較慢，常常用三級種子培養(yǎng)，即將種子罐中之菌絲移植到較大的種子罐中擴(kuò)大培養(yǎng)后，再移入發(fā)酵罐中，這種流程稱為三級發(fā)酵。一般50t發(fā)酵罐多采

15、用三級發(fā)酵，有的甚至采用四級發(fā)酵，如鏈霉素生產(chǎn)。有些酶制劑發(fā)酵生產(chǎn)也采用三級發(fā)酵。而谷氨酸及其他氨基酸發(fā)酵所用的菌種是細(xì)菌，生長繁殖速度很快，所以采用二級發(fā)酵。二級發(fā)酵的流程如下： 斜面菌種 一級種子搖床培養(yǎng) 二級種子罐培養(yǎng) 發(fā)酵罐   2.種子罐級數(shù) 種子罐級數(shù)是指制備種子需逐級擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)，一般根據(jù)種子的生長特性、孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度，以及發(fā)酵罐的容積而定。對于生長快的細(xì)菌，種子用量少，幫種子罐數(shù)相應(yīng)也少。如谷氨酸生產(chǎn)，種子接入種子罐后于32C培養(yǎng)7-10h，菌濃達(dá)到108-109個(gè)/ml，即可接入發(fā)酵罐作為種子，這稱為一級種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)，也稱二級發(fā)酵。生長較慢的菌種，如青霉

16、素生產(chǎn)菌種，種子接入一級種子罐27C培養(yǎng)40h后，再需移入裝有新鮮培養(yǎng)基的第二級種子罐，于27C培養(yǎng)10-24h移至發(fā)酵罐作為種子，這稱為二級種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)，也稱三級發(fā)酵。一般50m3發(fā)酵罐都采用三級發(fā)酵。 種子罐的級數(shù)越少，越有利于簡化工藝和控制，并可減少由于多次移種而帶來染菌的機(jī)會(huì)。但也必須考慮盡量延長發(fā)酵罐最終代謝產(chǎn)物積累的時(shí)間，縮短由于種子發(fā)芽、生長而占用的非生產(chǎn)時(shí)間，以提高發(fā)酵罐的生產(chǎn)率。  3.  接種齡與接種量 接種齡是指種子罐中培養(yǎng)的菌絲體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間。通常接種齡以菌絲處于生命極為旺盛的對數(shù)生長期，且培養(yǎng)液中菌體尚未達(dá)到最高峰時(shí)較為合適。對于年輕的種子接入發(fā)酵罐后往往會(huì)出現(xiàn)前期生長緩慢，整個(gè)發(fā)酵周期延長；過老的種子會(huì)引起生產(chǎn)能力下降而菌絲過早自溶。不同品種或同一品種而工藝條件不同，其接種齡是不一樣的，一般要以過多次試驗(yàn)來確定。 接種量是指移入的種子液體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例。如大多數(shù)抗生素發(fā)酵的最適接種