基因工程的基本步驟教學提綱

1、基因工程的基本步驟1.21.2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序目標引領：目標引領：1 1、能說出基因工程基本操作程序的四個步驟、能說出基因工程基本操作程序的四個步驟2 2、能準確描述獲取目的基因的方法、能準確描述獲取目的基因的方法3 3、能說出基因表達載體的具體元件、能說出基因表達載體的具體元件獨立自學：閱讀教材獨立自學：閱讀教材P10-15思考：思考：1 1、何為、何為轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化？將目的基因?qū)氩煌荏w細胞的方法？將目的基因?qū)氩煌荏w細胞的方法 一樣嗎？請舉例說明一樣嗎？請舉例說明2 2、如何確定、如何確定轉(zhuǎn)化成功轉(zhuǎn)化成功？需要確認那些信息？用什么？需要確認那些信息？用什么 具體

2、的方法？具體的方法？引導探究：引導探究：1 1、農(nóng)桿菌有何特點，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的、農(nóng)桿菌有何特點，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的原理是什么原理是什么？用？用 文字和箭頭寫出具體過程文字和箭頭寫出具體過程2 2、根據(jù)農(nóng)桿菌可以將目的基因?qū)腚p子葉植物的機理，、根據(jù)農(nóng)桿菌可以將目的基因?qū)腚p子葉植物的機理，你能否設計一個方案將一個抗病基因?qū)雴巫尤~植物你能否設計一個方案將一個抗病基因?qū)雴巫尤~植物中？中？3 3、請用文字和箭頭寫出顯微注射法的、請用文字和箭頭寫出顯微注射法的具體過程具體過程4 4、作為受體生物原核生物有何優(yōu)點？請用文字和箭、作為受體生物原核生物有何優(yōu)點？請用文字和箭頭寫出目的基因?qū)朐思毎念^寫出

3、目的基因?qū)朐思毎木唧w過程具體過程5 5、請具體描述各種檢測和鑒定方法的、請具體描述各種檢測和鑒定方法的具體操作過程具體操作過程歸納: 基因工程的基本操作程序n 獲取目的基因獲取目的基因u從基因文庫從基因文庫u利用利用PCRPCRu化學方法人工合成化學方法人工合成n 構建基因表達載體構建基因表達載體u目的基因、啟動子、終止子、標記基因目的基因、啟動子、終止子、標記基因n 將目的基因?qū)胧荏w細胞將目的基因?qū)胧荏w細胞u農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法n 目的基因的檢測與鑒定目的基因的檢測與鑒定u檢測：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯檢測：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯u鑒定：抗蟲性、抗病性等鑒定：

4、抗蟲性、抗病性等目標升華目標升華1 1、目的基因的獲取、目的基因的獲取2 2、基因表達載體的構建、基因表達載體的構建3 3、將目的基因?qū)胧荏w細胞、將目的基因?qū)胧荏w細胞4 4、目的基因的檢測與鑒定、目的基因的檢測與鑒定有了目的基因，我們才有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。種生物的遺傳特性。使目的基因在受體細胞使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并可進行中穩(wěn)定存在，并可進行遺傳、表達和發(fā)揮作用遺傳、表達和發(fā)揮作用 載體進入受體細胞穩(wěn)定載體進入受體細胞穩(wěn)定表達，才能實現(xiàn)一種生表達，才能實現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物物的基因在另一種生物中的轉(zhuǎn)化。中的轉(zhuǎn)化。

5、才能確定目的基因是否才能確定目的基因是否真正在受體細胞中穩(wěn)定真正在受體細胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達。遺傳和正確表達。一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取（一）、目的基因主要是（一）、目的基因主要是_編碼蛋白質(zhì)的結構基因編碼蛋白質(zhì)的結構基因（二）、獲取目的基因的常用方法有哪些（二）、獲取目的基因的常用方法有哪些? ?1 1、從基因文庫中獲取、從基因文庫中獲取2 2、利用、利用PCRPCR技術擴增技術擴增3 3、人工合成、人工合成1、從基因文庫中直接獲取、從基因文庫中直接獲?。? 1）基因文庫：）基因文庫：概念見概念見P9P9（2 2）基因文庫的分類）基因文庫的分類: :按外源按外源DNADNA片段的

6、來源分類片段的來源分類種種類類基因組基因組DNA文庫：文庫：含有一種生物的含有一種生物的全部全部基因基因部分基因文庫：部分基因文庫：只包含了一種生物的只包含了一種生物的部分部分基因，基因， 如：如：cDNA文庫文庫提取某種生物的全部提取某種生物的全部DNADNA用適當?shù)南拗泼盖杏眠m當?shù)南拗泼盖幸欢ù笮〉囊欢ù笮〉腄NADNA片段片段將將DNADNA片段與載體連接片段與載體連接導入受體菌中儲存導入受體菌中儲存基因組文庫基因組文庫（3 3）基因文庫的構建方法）基因文庫的構建方法1 1、直接分離法、直接分離法( (鳥槍法鳥槍法) )某種生物的單鏈某種生物的單鏈mRNAmRNA單鏈互補單鏈互補DNAD

7、NA雙鏈雙鏈cDNAcDNA片段片段導入受體菌中儲存導入受體菌中儲存與載體連接與載體連接cDNAcDNA文庫文庫反（逆）轉(zhuǎn)錄酶反（逆）轉(zhuǎn)錄酶DNADNA聚合酶聚合酶2 2、反轉(zhuǎn)錄法：、反轉(zhuǎn)錄法：cDNAcDNA的合成流程圖解的合成流程圖解（4 4）兩種基因文庫的區(qū)別）兩種基因文庫的區(qū)別 過程過程高溫變性（高溫變性（解旋為單鏈解旋為單鏈）低溫退火（低溫退火（引物與單鏈互補結合引物與單鏈互補結合）適溫延伸（適溫延伸（在在TaqTaq酶的作用下合成酶的作用下合成 與模板互補的與模板互補的DNADNA雙鏈雙鏈）重復循環(huán)重復循環(huán)預變性（預變性（增加增加DNADNA變性的概率變性的概率）2 2、利用、利用

8、PCRPCR技術擴增目的基因技術擴增目的基因四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸(dNTP)(dNTP) 引物：引物：熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶）酶）模板模板DNA( DNA( 需含有目的基因需含有目的基因 ) ) 緩沖溶液緩沖溶液寡核苷酸序列：與目的基因的起寡核苷酸序列：與目的基因的起始段互補始段互補3 3、人工合成的目的基因、人工合成的目的基因二、基因表達載體的構建二、基因表達載體的構建 基因工程的核心基因工程的核心1、目的：、目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表

9、達和發(fā)揮作用。基因能夠表達和發(fā)揮作用。2 2、基因表達載體的組成：、基因表達載體的組成：復制原點復制原點+ +目的基因目的基因+ +啟動子啟動子+ +終止子終止子+ +標記基因標記基因啟動子：啟動子：位于基因的首端的位于基因的首端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片斷，它是片斷，它是RNARNA聚合酶識別和結合的部聚合酶識別和結合的部位，有了它才能位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出錄出mRNAmRNA，最終獲得蛋白質(zhì)，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：終止子：位于基因的尾端的位于基因的尾端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片斷，片斷，能終能終止止mRNAmRNA的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄標記基因標記基因的作用是的作

10、用是為了為了鑒別鑒別受體細胞中是否含有目的基受體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細因，從而將有目的基因的細胞篩選出來胞篩選出來載體載體與與表達載體表達載體的區(qū)別：二者都有標記基因的區(qū)別：二者都有標記基因和復制原點兩部分和復制原點兩部分DNADNA片段。表達載體在載體片段。表達載體在載體基礎上增加了基礎上增加了目的基因、啟動子、終止子目的基因、啟動子、終止子三部三部分結構分結構用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又既用到限制酶切割載體，又用到用到DNADNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學鍵都是磷酸二酯鍵酶作用的化學鍵都是磷酸二

11、酯鍵啟動子、終止子啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少對于目的基因表達必不可少目的基因不能單獨進入受體細胞，目的基因不能單獨進入受體細胞，必需以表必需以表達載體的方式攜帶進去。達載體的方式攜帶進去。注意注意三、將目的基因?qū)胧荏w細胞三、將目的基因?qū)胧荏w細胞（一）轉(zhuǎn)化：（一）轉(zhuǎn)化： （二）方法（二）方法將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)胫参锛毎参锛毎麑⒛康幕驅(qū)雽⒛康幕驅(qū)雱游锛毎麆游锛毎麑⒛康幕驅(qū)雽⒛康幕驅(qū)胛⑸锛毎⑸锛毎r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法基因槍法花粉管通道法花粉管通道法顯微注射法顯微注射法感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞目的基因進入目的基因進入_內(nèi)，并且在內(nèi)，并且在 受體細

12、胞內(nèi)維持受體細胞內(nèi)維持_和和_的過程的過程受體細胞受體細胞穩(wěn)定穩(wěn)定表達表達檢測檢測鑒定鑒定檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAmRNA檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子雜交分子雜交分子雜交（注意與上不同之處）分子雜交（注意與上不同之處）抗原抗體雜交抗原抗體雜交四、目的基因的檢測與鑒定四、目的基因的檢測與鑒定檢查是否成功檢查是否成功1 1、將目的基因?qū)胫参?/p>

13、細胞的方法：、將目的基因?qū)胫参锛毎姆椒ǎ海?）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 農(nóng)桿菌特點：農(nóng)桿菌特點：易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力數(shù)單子葉植物沒有感染能力原理：原理：Ti質(zhì)粒上的質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)可以轉(zhuǎn)移到受體細胞，并整合到受體細胞染移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的色體的DNA上。上。過程：過程：優(yōu)點優(yōu)點2 2、將目的基因?qū)雱游锛毎⒛康幕驅(qū)雱游锛毎椒ǎ猴@微注射法方法：顯微注射法程序：程序：目的基因表達載體提純目的基因表達載體提純 取卵（受精卵）取卵（受精卵） 顯微注射顯微注射 受精卵受精卵 新性狀動物新性狀動

14、物3 3、將目的基因?qū)胛⑸锛毎?、將目的基因?qū)胛⑸锛毎松锾攸c：繁殖快、單細胞、遺傳物質(zhì)少原核生物特點：繁殖快、單細胞、遺傳物質(zhì)少方法：方法：用用Ca2+處理細胞處理細胞 感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞 表表達載體與感受態(tài)細胞混合達載體與感受態(tài)細胞混合 感受態(tài)感受態(tài)細胞吸收細胞吸收DNA分子分子（一）、檢測（一）、檢測1 1、檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的、檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNADNA上是否插入上是否插入了目的基因了目的基因 ( (關鍵步驟關鍵步驟) ).首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA.將含目的基因的將含目的基因的DNA片段用放射性同位素片段用放射性同位素等作標記等作標記,以此做探針以此做探針.使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯若顯示出雜交帶示出雜交帶,表明目的基因已插入染色體表明目的基因已插入染色體DNA中中（1）方法方法: :DNADNA分子雜交分子雜交（2）過程）過程:（二）、鑒定（個體生物學水平）