宏基因組測(cè)序技術(shù)檢測(cè)方法

1、宏基因組測(cè)序技術(shù)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)簡(jiǎn)介：宏基因組測(cè)序介紹宏基因組學(xué)是以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對(duì)象，通過(guò)現(xiàn)代基 因組技術(shù)手段包括功能基因的篩選和測(cè)序分析，對(duì)環(huán)境中微生物多樣性、種群結(jié) 構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系以及環(huán)境之間的關(guān)系進(jìn)行研究的新的微 生物研究方法。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，為宏基因組學(xué)研究提供了新的理想 研究方法。高通量測(cè)序的方法無(wú)需分離環(huán)境中各種微生物， 也無(wú)需構(gòu)建克隆文庫(kù) 就可以直接對(duì)環(huán)境中所有微生物進(jìn)行測(cè)序。 可以真實(shí)客觀的反映環(huán)境中微生物的 多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系等。目前乂可以分為針對(duì)16s DNA/18sDNA/ITS測(cè)序和針對(duì)宏基因組全序列的測(cè)序研究。下面

2、就是對(duì)這兩者的具體介紹。一、16s DNA/18s DNA/ITS 測(cè)序16sDNA是最常用的微生物物種分子鑒定的標(biāo)簽，通過(guò)對(duì)樣品中16sDNA 測(cè)序可以鑒定其中微生物物種的豐度和分布情況。目前，普遍使用 Roche 454 平臺(tái)來(lái)對(duì)環(huán)境樣品進(jìn)行16s DNA測(cè)序。因?yàn)?6s DNA序列比較相似，讀長(zhǎng)短的 話，難以進(jìn)行有效的比對(duì)，而 454平臺(tái)的平均讀長(zhǎng)在400bp左右，可以很好的 避免此類問(wèn)題。二、宏基因組全測(cè)序在這種測(cè)序方式中，我們可以假定一個(gè)環(huán)境中的所有微生物就是一個(gè)整體， 然后對(duì)其中所有的微生物進(jìn)行測(cè)序。這樣我們就可以研究樣品中的功能基因以及 其在環(huán)境中所起的作用而不用關(guān)心其來(lái)自哪個(gè)微

3、生物?？梢园l(fā)現(xiàn)新的基因，可以進(jìn)行基因的預(yù)測(cè)，甚至有可能得到某個(gè)細(xì)菌基因組的全序列。 此外，該項(xiàng)測(cè)序不 單可以針對(duì)DNA水平，也可以針對(duì)全RNA進(jìn)行基因表達(dá)水平的研究。樣品處理：宏基因組樣品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮膚和糞便。 樣品采集遵照樣品采集規(guī)范（人）所規(guī)定的操作來(lái)進(jìn)行。盡量留足備份樣品。核酸提?。汉昊蚪M核酸提取主要有兩種方法： 膜過(guò)濾法和直接裂解提取。對(duì)于液體樣品如痰液，灌洗液兩種方法都適用，對(duì)丁固體樣品如糞便宜采用直接裂解的方法。核 酸提取后用 NanoDrop ND-1000測(cè)定，260/280 = 1.8-2.0, 260/230 = 1.8-2.0,電 泳

4、檢測(cè)DNA應(yīng)是完整的一條帶。測(cè)序 Sequencing1) 16S/18S 測(cè)序：Sanger 測(cè)序：用丁低通量的16S/18S DNA測(cè)序，提取宏基因組后，首先通過(guò)PCR將16S/18S 序列擴(kuò)增出來(lái)，再將其連接到克隆載體上，導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞，涂平板做藍(lán)白斑篩 選，選出陽(yáng)性克隆提質(zhì)粒，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，測(cè)序反應(yīng)后純化后用ABI 3130或ABI 3730進(jìn)行毛細(xì)管電泳測(cè)序。由丁其測(cè)序準(zhǔn)確率比較高，而通量非常低，現(xiàn)通常用做二代測(cè)序結(jié)果的驗(yàn)證。454 Platform:454 平臺(tái)主要包括兩種測(cè)序系統(tǒng)：454 GS FLX+ Systeft 454 GS Junior SysteE54 GS F

5、LX+ Systems序讀長(zhǎng)可以達(dá)到 600-1000bp,通量 450-700M , GS Junior System 測(cè)序讀長(zhǎng)在400bp左右，通量在35M。Library PrAparationnboiQirnai RNA tungau froni MmpiQg usingrusfitim primers.$»qu&ncing Am>rHNA Amphcanadwwl址 inijan-rriPCR and 同時(shí)m 日 mving thv GS FLJC+ CXLR79 Ssiqiivngiing Mil wiiyj er JuniarDala Atwlysit U

6、ullirt o vanely of friw end ccwmimvrcifit wTtwaris wirnlcrdbiHil pdpulJlIon d訶目andmalkA ±«mipans；an9. GS Ampli|»is-n WnriAnt A.iFi-alyTQr (AVAJ sanwore* GE Riltrin>E4 MnpptF uflwira Public n>QLfl|4HQinqlC in«|i)r»li< EqqI Figure1 2： WcpirkHI dl a ribasd>hial rfiM

7、A AmfHlie>anequenung experivnenL LFmry piBpaiabDn using a dirBoUo- nai pMiiier com<wi to # spocies miigiroion uf nws Speths im a !j«qLM<icmg ami. For detailed irriorriarL maiccom.文庫(kù)構(gòu)建：用fusion Primer擴(kuò)增核糖體RNA將已擴(kuò)增的rRNA直接做乳液PCR在GSFLX+和GS Junior系統(tǒng)上進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序深度：數(shù)據(jù)分析：使用免費(fèi)的軟件包對(duì)微生物的種群多樣性進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行比較

8、1. MEGAN 一個(gè)宏基因組分析工具，可以在大量的測(cè)序數(shù)據(jù)中對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行 聚類分析。2. MG-RAST用丁注釋宏基因組樣品的全自動(dòng)軟件。3. IMG/M :基丁宏基因組序列微生物群體的功能性。4. CAMERA致力丁微生物生態(tài)學(xué)研究。5. CARMA可以通過(guò)未拼接的序列來(lái)進(jìn)行物種組成和微生物的遺傳潛力的研究。6. GALAXY用丁高等真核生物的研究，例如昆蟲等。7. Greengenes 16S rRNA的數(shù)據(jù)庫(kù)，可以用來(lái)做16S rRNA的比對(duì)。8. QIIME:針對(duì)454測(cè)序數(shù)據(jù)的宏基因組分析。9. The Ribosome Database Project RDP :針對(duì)焦磷酸測(cè)序

9、的分析方法。Miseq Platform:Miseq平臺(tái)讀長(zhǎng)可以是 2X250bp或2X300b使用Miseq Reagent Kit V2可以 產(chǎn)出7.5-8.5Gb的數(shù)據(jù)，使用 Miseq Reagent Kit V3可以產(chǎn)出13.2-15Gb的數(shù)據(jù)。Rgur&1:16S Amplicon Sequencing WorkflowDesign and order region of inhrest spocific pfimerawith Qvarharig adaptera白 Mmpia帕 Hbrary by PCRt>y PCRNonnalize and pool hbra

10、msPertDrm autonialed cluster generation and sequencing on the MiSeq systemVie# data 如ng the MotaganomW 1BS rRNAWwkflcw in MiSeq Reporter w A/npiiconVtewfrr In HaseSpaca16S uniplcon gqwxuig 的 u utarnw舊。皿心 yokx心 kr 0噂 Ml wq 日 V鳴 indiiring 呻沖 pnmrinn.urrl 劇心月 小腳畝with ooimhumerri： sctwaB far reviaving r

11、HBijite文庫(kù)構(gòu)建：根據(jù)感興趣的片段設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCRT增出片段做為模板構(gòu)建文庫(kù)。使用 Nextera XT Sample Prep Kit構(gòu)建文庫(kù)，按照試劑盒說(shuō)明書操作。將建好的文庫(kù)歸 一化處理并將其混到一起。在 Miseq系統(tǒng)里自動(dòng)進(jìn)行成簇反應(yīng)，進(jìn)而完成測(cè)序。 文庫(kù)檢驗(yàn)：用Agilent 2100檢測(cè)文庫(kù)大小片段是否與預(yù)期一致。文庫(kù)片段是否集中。 測(cè)序深度：16S rRNA測(cè)序深度應(yīng)至少在50,000條reads以上，以保證較好的覆蓋度。 數(shù)據(jù)分析：對(duì)微生物生態(tài)進(jìn)行定量觀察Greengenes 16S rRNAS因數(shù)據(jù)庫(kù)和分析工具； 宏基因組分析工具：MEGAN 核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)計(jì)劃（R

12、DP）Ion Torrent Platform:Ion Torrent平臺(tái)主要有兩個(gè)測(cè)序系統(tǒng)：Ion PGM SystemB Ion Proton System Ion PGM有兩種讀長(zhǎng)，200bp和400bp,Ion PGM主要應(yīng)用三種芯片，Ion 314 Chip, Ion 316 Chip和Ion 318 Chip,最多數(shù)據(jù)產(chǎn)出可以達(dá)到 2Gb。Ion Proton讀長(zhǎng)為200bp, 最多數(shù)據(jù)產(chǎn)出可達(dá)到10Gb。文庫(kù)構(gòu)建：使用 Ion Plus Fragment LibraryKi的 16S rRNA增產(chǎn)物加上 barcode 標(biāo)簽，一 共有96個(gè)barcode可以選擇。加上標(biāo)簽后使用I

13、on PGM? Template OT2 200 Kit 在Ion OneTouch? DLSystem±進(jìn)行乳液PCR完成文庫(kù)構(gòu)建。測(cè)序時(shí)根據(jù)需要不 同的讀長(zhǎng)選擇不同的測(cè)序試劑盒。測(cè)序深度：對(duì)于人體腸道微生物16S rRNA測(cè)序，對(duì)于檢測(cè)高豐度的樣品，每個(gè)樣品至 少要測(cè)10000條reads,而對(duì)于檢測(cè)低豐度的樣品，則需要1,000,000以上的reads 數(shù)。2）全宏基因組測(cè)序 Whole-metagenomics SequencingRoche 454 platform:文庫(kù)構(gòu)建：提取宏基因組DNA,總量不低丁 10ug,且樣品DNA應(yīng)相對(duì)完整。使用GS FLX Titaniu

14、m Rapid Library Preparation Kit構(gòu)建文庫(kù)，按照說(shuō)明書進(jìn)行相應(yīng)操作。文庫(kù)檢驗(yàn)：DNA reads數(shù)與微球的比例在8%左右，可以達(dá)到比較理想的測(cè)序結(jié)果。 測(cè)序深度：每個(gè)樣品應(yīng)至少保證10,000條以上的reads數(shù)。Hiseq platform:Hiseq平臺(tái)主要有Hiseq 2000和Hiseq 2500兩個(gè)測(cè)序系統(tǒng)。Hiseq 2000測(cè)序 讀長(zhǎng)是2X100bp Paired-end測(cè)序，一次運(yùn)行通量可達(dá) 600Gb以上，Hiseq 2500有 兩種運(yùn)行模式：快速運(yùn)行和高通量，快速運(yùn)行可以達(dá)到2X150bp,產(chǎn)生最多180Gb 的數(shù)據(jù)，高通量讀長(zhǎng)在2X125bp,數(shù)據(jù)產(chǎn)出在600Gb以上。文庫(kù)構(gòu)建：將提取的宏基因組 DNA用Covaris M220片段化后，使用 Truseq DNA XT/LT Sample Prep Kit (illumina)按照protocol進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建,DNA起始投入量應(yīng)在1ug 以上。文庫(kù)檢驗(yàn)：將建好的宏基因組文庫(kù)使用