產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的篩選及培養(yǎng)

1、產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的篩選及培養(yǎng)一、篩選步驟1、菌種的采集采集山上距濕潤的表層10cm處的土壤樣本40g左右，用研缽研成 粉末稱取1g樣本加入滅菌的250mL錐形瓶中，加入99mL無菌水搖勻 靜置。2、菌種初篩(1) 按照配方配制200mL CMC培養(yǎng)基，取1 X 250mL空錐形瓶和6 X 15mL 試管，塞上棉塞并用報(bào)紙、棉線包扎，用報(bào)紙、棉線將試 管包扎成一捆；取 12 套培養(yǎng)皿碼齊包扎。將上述器材與培養(yǎng)基、無 菌水121C高壓蒸汽滅菌20min。(2) 于無菌臺(tái)上倒9個(gè)CMC培養(yǎng)基備用。(3) 另取6支15mL經(jīng)滅菌的試管，用移液槍吸取土壤溶液(上清 液)1.000mL加入1號(hào)試管，加無菌水

2、9.000mL。混勻后吸取1.000mL 加入 2 號(hào)試管，重復(fù)上述操作，進(jìn)行 6 次梯度稀釋。(4) 待CMC培養(yǎng)基冷卻后，在超凈工作臺(tái)分別吸取 104、105、106 倍稀釋液0.100mL于CMC培養(yǎng)基上稀釋涂布，每種稀釋液涂布三份。(5) 將上述培養(yǎng)基置于37C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，標(biāo)記菌落并 記錄各菌落形態(tài)(菌落高度、質(zhì)地、顏色、氣味、著生狀態(tài)、邊緣及 表面紋理等)。(6) 配制200mL剛果紅家別培養(yǎng)基，與三套培養(yǎng)皿一起 121 C滅菌 20min。（7）在無菌操作臺(tái)上倒3個(gè)鑒別培養(yǎng)基備用。（8） 將各菌落用牙簽接種到冷卻了的剛果紅鑒別培養(yǎng)基上，37C 培養(yǎng)24h,挑選5株透明圈直

3、徑與菌落直徑比最大的菌株進(jìn)行搖瓶復(fù) 篩。3、菌種復(fù)篩（1）配制500mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，分裝到5只250mL的錐形瓶中， 121 C高壓蒸汽滅菌20min。（2）將初篩得到的菌株用接種環(huán)接種于液體培養(yǎng)基上（2環(huán)）， 37C、150r/min下培養(yǎng)23天，轉(zhuǎn)入4C冰箱保藏。二、培養(yǎng)方法1清洗實(shí)驗(yàn)器具2 滅菌3 配培養(yǎng)基（纖維素作唯一能量源的培養(yǎng)基）4倒平板+選擇培養(yǎng)原菌（可能會(huì)用搖床）5稀釋菌樣6涂布平板或平板劃線7 放入恒溫箱（調(diào)制均適宜的溫度）12-24h，之后就可以收獲 細(xì)菌了8 觀察記錄（數(shù)量、分布等）三、培養(yǎng)基種類及其組成1、初篩CMC培養(yǎng)基：CMC5g、蛋白胨 1 g、FeSO4-

4、7H2O0.005 g、NaCI 0.25 g、瓊脂粉10g于1000mL錐形瓶中加蒸餾水至500mL調(diào)節(jié)pH 7. 27. 6,加棉塞121C滅菌20min。剛果紅培養(yǎng)基：（NH4）2S04 2 g，MgS04- 7H20 0.5 g，K2HP04 1 g, NaCI 0.5 g，微晶纖維素2 g，剛果紅0.4 g，瓊脂20 g，加水至1000 mL。無菌水：取1只1000mL的錐形瓶，各加水1000mL加棉塞與CMC培 養(yǎng)基一起滅菌20 min。另取1只250mL空錐形瓶、6支15mL試管和 12 套培養(yǎng)皿滅菌備用。2、復(fù)篩基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉10g，蛋白胨10g，KHPO19, MgSO40. 29，Nacl 10g 水 1000mL pH調(diào)至 7，121C滅菌 20min3、培養(yǎng)纖維素培養(yǎng)基 :硫酸銨 2.0g ，硫酸鎂 0.5g ，磷酸二氫鉀 1.0g ，氯化 鈉0