ELISPOT技術(shù)原理及其應(yīng)用

1、DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.1酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)E Enzyme nzyme L Linked inked I ImmunommunoSPOTSPOT達(dá)科為生物技術(shù)有限公司達(dá)科為生物技術(shù)有限公司朱義鑫朱義鑫2005.11.30Elispot實(shí)驗(yàn)結(jié)果（透明板）實(shí)驗(yàn)結(jié)果（透明板）U-Cytech 公司公司 Elispot實(shí)驗(yàn)結(jié)果（實(shí)驗(yàn)結(jié)果（PVDF板）板）U-Cytech 公司公司達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.2v ELISPOTELISPOT技術(shù)起源與發(fā)展技術(shù)起源與發(fā)展v 細(xì)胞與細(xì)胞因子細(xì)胞與細(xì)胞因子v ELISPOTE

2、LISPOT技術(shù)原理技術(shù)原理v ELISPOT ELISPOT 和和 ELISAELISA的區(qū)別的區(qū)別v ELISPOTELISPOT的優(yōu)點(diǎn)的優(yōu)點(diǎn)第一部分：前言第一部分：前言達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.319831983年年, Czerkinsky&Sedgwick , Czerkinsky&Sedgwick ：計(jì)數(shù)分泌抗體的：計(jì)數(shù)分泌抗體的 B B 細(xì)胞；細(xì)胞；19851985年，年，MoreMore：NCNC板，改進(jìn)顯色底物，不再需要瓊脂糖凝膠板，改進(jìn)顯色底物，不再需要瓊脂糖凝膠; ;19881988年，年，Czerkinsky

3、 et.al.: Czerkinsky et.al.: 首次將應(yīng)用擴(kuò)展到細(xì)胞因子檢測領(lǐng)首次將應(yīng)用擴(kuò)展到細(xì)胞因子檢測領(lǐng)域，域，T cell IFN-; ; 同年業(yè)發(fā)展出雙色標(biāo)記技術(shù)；同年業(yè)發(fā)展出雙色標(biāo)記技術(shù)；19951995年，年，Schielen et.al.: Schielen et.al.: 首次將首次將PVDFPVDF膜板引入膜板引入ELISPOTELISPOT19971997年，年，Gui et.al.Gui et.al.：發(fā)展出計(jì)算機(jī)輔助的斑點(diǎn)技術(shù)技術(shù)。：發(fā)展出計(jì)算機(jī)輔助的斑點(diǎn)技術(shù)技術(shù)。1.ELISPOT1.ELISPOT技術(shù)起源與發(fā)展技術(shù)起源與發(fā)展達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE

4、BIOTECH COMPANY Ltd.4T T細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中起著關(guān)鍵性的作用，尤其是起免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中起著關(guān)鍵性的作用，尤其是起免疫調(diào)節(jié)作用的輔助細(xì)胞作用的輔助細(xì)胞ThTh。它們參與了細(xì)胞免疫。它們參與了細(xì)胞免疫(Th1)(Th1)和體液免疫和體液免疫(Th2)(Th2)抗原或者有絲分裂原刺激抗原或者有絲分裂原刺激T T細(xì)胞、單核細(xì)胞、單核/ /巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子子 Th1 cells IFN-,IL-2 Th2 cells IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13 Tc cells IFN-, TNF-, 顆粒酶顆粒酶B，穿孔素

5、，穿孔素 單核單核/ /巨噬細(xì)胞巨噬細(xì)胞 TNF-a, IL-1b, IL-6, IL-10, IL-12 細(xì)胞因子的分泌以及對效應(yīng)細(xì)胞的調(diào)節(jié)構(gòu)成了一個(gè)精確的免細(xì)胞因子的分泌以及對效應(yīng)細(xì)胞的調(diào)節(jié)構(gòu)成了一個(gè)精確的免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。2.2.細(xì)胞與細(xì)胞因子細(xì)胞與細(xì)胞因子達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.5用抗體捕獲培養(yǎng)中的細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，并以斑點(diǎn)顯色的方式將其表現(xiàn)出來。3.ELISPOT3.ELISPOT技術(shù)原理技術(shù)原理達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.64.ELISPOT 4.ELISPOT 和和

6、ELISAELISA的區(qū)別的區(qū)別ELISPOT ELISPOT 法源自法源自 ELISA ELISA ，又突破傳統(tǒng)，又突破傳統(tǒng) ELISA ELISA 法，法，是定量是定量 ELISA ELISA 技術(shù)的延伸和新的發(fā)展。兩者都可檢測技術(shù)的延伸和新的發(fā)展。兩者都可檢測細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子或其他可溶性蛋白，它們最大的細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子或其他可溶性蛋白，它們最大的不同不同: :n ELISAELISA測定的是測定的是蛋白濃度蛋白濃度，ELISPOTELISPOT測定的是測定的是細(xì)胞頻率細(xì)胞頻率；（整體水平與單細(xì)胞水平）（整體水平與單細(xì)胞水平）n ELISAELISA是是免疫檢測免疫檢測ImmunoIm

7、muno-Assay-Assay，而，而ELISPOTELISPOT是是生物生物檢測檢測Bio-AssayBio-Assay（活細(xì)胞，功能檢測）（活細(xì)胞，功能檢測）n ELISAELISA檢測的特異性表現(xiàn)在檢測的特異性表現(xiàn)在抗體抗體上，上，ELISPOTELISPOT檢測的特檢測的特異性及表現(xiàn)在雙重的異性及表現(xiàn)在雙重的刺激源刺激源和和抗體抗體上。上。達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.75.ELISPOT5.ELISPOT的優(yōu)點(diǎn)的優(yōu)點(diǎn) 目前，檢測細(xì)胞因子或者細(xì)胞免疫反應(yīng)的方法有以下目前，檢測細(xì)胞因子或者細(xì)胞免疫反應(yīng)的方法有以下幾種：幾種：ELISAELIS

8、A、ELISPOTELISPOT、FACSFACS、TetramerTetramer、3 3H H胸苷胸苷參入法、參入法、5151CrCr釋放法。釋放法。 n高靈敏高靈敏：度少至：度少至1001001,0001,000個(gè)分子個(gè)分子/Cell/Cell即能夠被檢測。比即能夠被檢測。比ELISAELISA的的靈敏度高靈敏度高200200倍。倍。n單細(xì)胞水平單細(xì)胞水平：即使只有一個(gè)陽性細(xì)胞也能夠檢測出來，比：即使只有一個(gè)陽性細(xì)胞也能夠檢測出來，比FACSFACS靈敏。靈敏。n高通量高通量：每個(gè)研究人員每天可作數(shù)百樣本的檢測。：每個(gè)研究人員每天可作數(shù)百樣本的檢測。High Throughput Hig

9、h Throughput ScreeningScreening達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.8在在10106 6抗原呈遞細(xì)胞（抗原呈遞細(xì)胞（APCAPC）中混入已知數(shù)量的）中混入已知數(shù)量的IFN-IFN-陽性陽性T T淋巴細(xì)胞，然后用三種方法分別進(jìn)行檢測。淋巴細(xì)胞，然后用三種方法分別進(jìn)行檢測。X X坐標(biāo)：各檢測方法的檢測結(jié)果坐標(biāo)：各檢測方法的檢測結(jié)果 Y Y坐標(biāo)：每百萬坐標(biāo)：每百萬APCAPC中實(shí)際中實(shí)際IFN-IFN-+ +T T細(xì)胞數(shù)量細(xì)胞數(shù)量ELISPOT/FACS/ELISAELISPOT/FACS/ELISA檢測精確度比較 ELISPOT

10、ELISPOT 流式熒光染色流式熒光染色 ELISAELISA達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.9第二部分：技術(shù)特點(diǎn)第二部分：技術(shù)特點(diǎn)n技術(shù)操作流程技術(shù)操作流程nELISPOTELISPOT技術(shù)要點(diǎn)技術(shù)要點(diǎn)n塑料板與膜板塑料板與膜板n膜結(jié)構(gòu)與抗體包被膜結(jié)構(gòu)與抗體包被n細(xì)胞處理細(xì)胞處理n有血清與無血清有血清與無血清n刺激物選擇刺激物選擇n建立陽性對照建立陽性對照n調(diào)整適當(dāng)?shù)募?xì)胞濃度調(diào)整適當(dāng)?shù)募?xì)胞濃度n預(yù)培養(yǎng)法與直接法預(yù)培養(yǎng)法與直接法n各種染色系統(tǒng)各種染色系統(tǒng)達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.10v包被抗體包被抗體 4

11、 4 過夜，洗滌；過夜，洗滌；v封閉封閉37 1h37 1h；v加入淋巴細(xì)胞和刺激原加入淋巴細(xì)胞和刺激原37 37 孵育孵育8-40h8-40h；v冰水裂解并移出細(xì)胞，洗滌；冰水裂解并移出細(xì)胞，洗滌；v加入生物素標(biāo)記的檢測抗體加入生物素標(biāo)記的檢測抗體37 1h37 1h，洗滌；，洗滌；v加入酶聯(lián)親和素加入酶聯(lián)親和素37 1h37 1h，洗滌；洗滌；v加入顯色底物，顯色加入顯色底物，顯色1040min1040min；v獲得斑點(diǎn)，計(jì)數(shù)。獲得斑點(diǎn)，計(jì)數(shù)。1，23456781. ELISPOT1. ELISPOT一般操作流程一般操作流程達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY

12、Ltd.112. ELISPOT2. ELISPOT技術(shù)要點(diǎn)技術(shù)要點(diǎn)u細(xì)胞培養(yǎng)和培養(yǎng)前階段無菌操作，避免污染細(xì)胞培養(yǎng)和培養(yǎng)前階段無菌操作，避免污染u細(xì)胞在細(xì)胞在ELISPOT板上孵育時(shí)要避免震動(dòng)，包括開關(guān)板上孵育時(shí)要避免震動(dòng)，包括開關(guān)CO2孵箱孵箱u洗滌要充分，尤其是裂解細(xì)胞之后的洗滌洗滌要充分，尤其是裂解細(xì)胞之后的洗滌u洗滌時(shí)，槍頭不能接觸到膜，從孔中移出液體采用傾洗滌時(shí)，槍頭不能接觸到膜，從孔中移出液體采用傾倒的方式倒的方式u洗滌最后一次要用高質(zhì)量的吸水紙拍干洗滌最后一次要用高質(zhì)量的吸水紙拍干達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.12塑料板：塑料板：U-

13、cytechU-cytech公司特有的透明版公司特有的透明版操作簡單，方便，省時(shí)，價(jià)廉，但是斑點(diǎn)不如膜板漂亮，適于初操作簡單，方便，省時(shí)，價(jià)廉，但是斑點(diǎn)不如膜板漂亮，適于初學(xué)者以及臨床診斷。學(xué)者以及臨床診斷。膜板：膜板：PVDFPVDF膜板、膜板、NCNC膜板膜板操作復(fù)雜，但是斑點(diǎn)漂亮，適合有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)者以及科學(xué)研究。操作復(fù)雜，但是斑點(diǎn)漂亮，適合有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)者以及科學(xué)研究。3.3.塑料板與膜板塑料板與膜板達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.13塑料板：塑料板：U-cytech公司特有的透明版公司特有的透明版優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：v透明全塑料板，易于操作，可以隨時(shí)觀察

14、細(xì)胞；透明全塑料板，易于操作，可以隨時(shí)觀察細(xì)胞；v可以快速包被，節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間；可以快速包被，節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間；v可回收細(xì)胞和上清；可回收細(xì)胞和上清；v價(jià)格只有價(jià)格只有PVDFPVDF膜板的一半。膜板的一半。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：v吸附能力比膜差，斑點(diǎn)松散，易受粒細(xì)胞的分解；吸附能力比膜差，斑點(diǎn)松散，易受粒細(xì)胞的分解；v裸視下斑點(diǎn)為灰白色，不如有顏色斑點(diǎn)明顯；裸視下斑點(diǎn)為灰白色，不如有顏色斑點(diǎn)明顯；v只有一種染色系統(tǒng)，不能用于多色分析。只有一種染色系統(tǒng)，不能用于多色分析。修飾的修飾的HRP/銀銀染系統(tǒng)染系統(tǒng)達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.14膜板：膜板：PVDFPVD

15、F膜，膜， NCNC膜膜優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：FPVDFPVDF膜的吸附能力更強(qiáng)，斑點(diǎn)致密、圓潤；膜的吸附能力更強(qiáng)，斑點(diǎn)致密、圓潤；F斑點(diǎn)顏色鮮艷，易于判讀；斑點(diǎn)顏色鮮艷，易于判讀；F能用于多色能用于多色ELISPOTELISPOT實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：F需酒精預(yù)濕等步驟，操作稍復(fù)雜；需酒精預(yù)濕等步驟，操作稍復(fù)雜；F因?yàn)槟さ臐B漏問題，在洗滌步驟稍復(fù)雜；因?yàn)槟さ臐B漏問題，在洗滌步驟稍復(fù)雜；F幾乎不可能回收細(xì)胞和上清；幾乎不可能回收細(xì)胞和上清；F膜的脆弱性，實(shí)驗(yàn)中的操作與保存更困難。膜的脆弱性，實(shí)驗(yàn)中的操作與保存更困難。HRP/DABAP/BCIP&NBTHRP/AEC達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKE

16、WE BIOTECH COMPANY Ltd.15IFN- IL-5IL-10IFN- PMA/ ionomycin2x105 hu-PBMCindirectLPS/ IFN- 2.5x104 hu-PBMCdirectICE Peptide Pool2x105 hu-PBMCindirectPVDFPVDF板、透明板的典型斑點(diǎn)圖像板、透明板的典型斑點(diǎn)圖像達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.164. 4. 膜結(jié)構(gòu)和抗體包被膜結(jié)構(gòu)和抗體包被n通常的包被條件是4過夜，也可以室溫2小時(shí)n37 包被不能超過1小時(shí)，否則包被效率急劇降低n膜吸附能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過包被抗體的

17、量，所以需要封閉n包被后必須接著封閉，否則包被抗體會逐漸失活n封閉之后用純水或PBS洗滌，可以在4長期存儲關(guān)于膜的一些參數(shù)（單孔面積）關(guān)于膜的一些參數(shù)（單孔面積）厚度：厚度：120-150um最大蛋白吸附量：最大蛋白吸附量： 80-100 ugELISPOT所需量：所需量：1 ug包被抗體集中于膜表面包被抗體集中于膜表面1um(透明板容納量為：透明板容納量為：30-40 ug)達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.17 從外周血提取淋巴細(xì)胞時(shí)從外周血提取淋巴細(xì)胞時(shí), , 應(yīng)避免凝血引起的細(xì)胞活應(yīng)避免凝血引起的細(xì)胞活性降低；血液越新鮮越好，全血不應(yīng)該存放超過性

18、降低；血液越新鮮越好，全血不應(yīng)該存放超過6 6小小時(shí)。時(shí)。 只能采用淋巴細(xì)胞提取液分離。提取淋巴細(xì)胞時(shí)應(yīng)盡只能采用淋巴細(xì)胞提取液分離。提取淋巴細(xì)胞時(shí)應(yīng)盡量去除紅細(xì)胞、粒細(xì)胞和雜質(zhì)的干擾量去除紅細(xì)胞、粒細(xì)胞和雜質(zhì)的干擾 從小鼠的脾臟取淋巴細(xì)胞時(shí)，尤其要注意，加入從小鼠的脾臟取淋巴細(xì)胞時(shí)，尤其要注意，加入ELISPOTELISPOT培養(yǎng)孔的細(xì)胞須為單細(xì)胞懸液培養(yǎng)孔的細(xì)胞須為單細(xì)胞懸液 預(yù)培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞若有壞死預(yù)培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞若有壞死/ /凋亡（培養(yǎng)液變黃）會凋亡（培養(yǎng)液變黃）會影響斑點(diǎn)的形成影響斑點(diǎn)的形成 預(yù)培養(yǎng)后的細(xì)胞入預(yù)培養(yǎng)后的細(xì)胞入ELISPOTELISPOT培養(yǎng)板前應(yīng)更換培養(yǎng)液培養(yǎng)板前應(yīng)更

19、換培養(yǎng)液ELISPOT實(shí)驗(yàn)的難點(diǎn)在于細(xì)胞處理與培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的難點(diǎn)在于細(xì)胞處理與培養(yǎng)5. 5. 細(xì)胞處理細(xì)胞處理 達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.186. 6. 有血清與無血清有血清與無血清u血清是細(xì)胞培養(yǎng)所必需的添血清是細(xì)胞培養(yǎng)所必需的添加品加品 ，ELISPOT有細(xì)胞培養(yǎng)有細(xì)胞培養(yǎng)的過程，所以需要血清的過程，所以需要血清u但是血清批次間差異大、成但是血清批次間差異大、成分未可知，為分未可知，為ELISPOT增加增加了嚴(yán)重的不確定性因素。有些了嚴(yán)重的不確定性因素。有些批次的血清嚴(yán)重干擾試驗(yàn)結(jié)果。批次的血清嚴(yán)重干擾試驗(yàn)結(jié)果。u無血清培養(yǎng)法已經(jīng)成熟，其無血清培

20、養(yǎng)法已經(jīng)成熟，其優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：成分固定，徹底消除了批次間的差異，結(jié)果可以在全世界的試驗(yàn)室之間比較。不含雜蛋白，背景更弱，斑點(diǎn)更清晰。不含抑制細(xì)胞因子分泌成分，斑點(diǎn)更多，更加反映真實(shí)的結(jié)果。u目前只能用于直接法，間接目前只能用于直接法，間接法孵育時(shí)間過長，細(xì)胞生長受法孵育時(shí)間過長，細(xì)胞生長受影響，結(jié)果不理想。影響，結(jié)果不理想。119 SFC267 SFC我們自己的試驗(yàn)結(jié)果：我們自己的試驗(yàn)結(jié)果：PHA/10,000 Hu-PBMC上：上：5%小牛血清（杭州）下：無血清培養(yǎng)基小牛血清（杭州）下：無血清培養(yǎng)基U-cytech)達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.19

21、n非特異性刺激物非特異性刺激物有絲分裂原有絲分裂原 ConAConA，PMAPMA，PHAPHA，IonomycinIonomycinn特異性刺激物特異性刺激物重組蛋白重組蛋白病毒載體或者病毒顆粒病毒載體或者病毒顆粒重疊肽段重疊肽段表位肽表位肽注意：注意：u直接在直接在ELISPOTELISPOT培養(yǎng)可能會因沒有足夠的刺激強(qiáng)度而導(dǎo)致斑點(diǎn)數(shù)少。培養(yǎng)可能會因沒有足夠的刺激強(qiáng)度而導(dǎo)致斑點(diǎn)數(shù)少。此時(shí)可以采用預(yù)培養(yǎng)法。此時(shí)可以采用預(yù)培養(yǎng)法。u部分多價(jià)抗原刺激物導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，可以換用單價(jià)抗原刺激物。部分多價(jià)抗原刺激物導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，可以換用單價(jià)抗原刺激物。u核酸、激素等抗原刺激物的免疫原性較弱，應(yīng)該加強(qiáng)刺激

22、濃度、輔助核酸、激素等抗原刺激物的免疫原性較弱，應(yīng)該加強(qiáng)刺激濃度、輔助刺激物、延長刺激時(shí)間等。刺激物、延長刺激時(shí)間等。7. 7. 刺激物選擇刺激物選擇達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.208.8.建立陽性對照建立陽性對照n非特異性刺激陽性對照：非特異性刺激陽性對照：ConA 伴刀豆蛋白伴刀豆蛋白A 0.4-1.0ug/wellPHA 植物血球凝集素植物血球凝集素 0.3-1.0ug/wellIonomycin 伊諾霉素伊諾霉素 50-100ng/wellPMA 14烷酰佛波乙酯烷酰佛波乙酯 5.0-10ng/welln特異性陽性刺激原：國際標(biāo)準(zhǔn)多肽池特異

23、性陽性刺激原：國際標(biāo)準(zhǔn)多肽池CEF CEF C CMVMV， E EBVBV， ininf fluenza virusluenza virus在在PBMCPBMC的的IFN- ELISPOT IFN- ELISPOT 分析中：分析中：自發(fā)斑點(diǎn)頻率自發(fā)斑點(diǎn)頻率：1050/百萬PBMC細(xì)胞；(十萬分之一）PHAPHA刺激頻率刺激頻率：104105/百萬PBMC細(xì)胞；（百分之一）CEFCEF刺激頻率刺激頻率：500 5000 /百萬PBMC細(xì)胞（千分之一）達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.21陽性對照實(shí)例陽性對照實(shí)例未未 刺刺 激激40SFC/百萬百萬PBMC

24、CEF 刺刺 激激3，400SFC/百萬百萬PBMCPHA 刺刺 激激26，000SFC/百萬百萬PBMC人PBMC40萬/孔U-cytech無血清培養(yǎng)基人PBMC1萬/孔U-cytech無血清培養(yǎng)基人PBMC5萬/孔U-cytech無血清培養(yǎng)基4265177達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.229.9.調(diào)整適當(dāng)?shù)募?xì)胞濃度調(diào)整適當(dāng)?shù)募?xì)胞濃度 844 492 355 192n20-4020-40萬萬/ /孔形成最大密度的單層細(xì)胞孔形成最大密度的單層細(xì)胞n根據(jù)所使用刺激原作初步調(diào)整根據(jù)所使用刺激原作初步調(diào)整ConAConA PHA PMA PHA PMA ：

25、0.5-50.5-5萬萬/ /孔孔特異性刺激物：特異性刺激物：5-405-40萬萬/ /孔孔n根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的斑點(diǎn)數(shù)目作精細(xì)調(diào)整根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的斑點(diǎn)數(shù)目作精細(xì)調(diào)整人人PBMC/CEF刺激刺激 U-cytech無血清培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.2310. 10. 預(yù)培養(yǎng)法與直接法預(yù)培養(yǎng)法與直接法p 預(yù)培養(yǎng)法即：預(yù)先將細(xì)胞和刺激物加入預(yù)培養(yǎng)法即：預(yù)先將細(xì)胞和刺激物加入2424孔板中作孔板中作預(yù)孵育和刺激，然后再加入預(yù)孵育和刺激，然后再加入ELISPOTELISPOT板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。p 大多數(shù)大多數(shù)ELISPOTELISPOT實(shí)驗(yàn)都可以

26、用直接實(shí)驗(yàn)都可以用直接ELISPOTELISPOT法得法得到可接受的結(jié)果。到可接受的結(jié)果。p 預(yù)孵育的優(yōu)點(diǎn)：預(yù)孵育的優(yōu)點(diǎn)：經(jīng)過預(yù)孵育，斑點(diǎn)更分散，清晰經(jīng)過預(yù)孵育，斑點(diǎn)更分散，清晰可以除去貼壁的巨噬細(xì)胞，從而減少小斑點(diǎn)的影響；粒細(xì)胞可以除去貼壁的巨噬細(xì)胞，從而減少小斑點(diǎn)的影響；粒細(xì)胞的影響（蟲啃）也可以大大減輕的影響（蟲啃）也可以大大減輕某些細(xì)胞因子通常很難用直接法得到結(jié)果某些細(xì)胞因子通常很難用直接法得到結(jié)果，比如顆粒酶、顆粒酶、IL-IL-1010p 預(yù)孵育的缺點(diǎn)：預(yù)孵育的缺點(diǎn)：需要長時(shí)間孵育刺激，更為嚴(yán)格的無菌操作環(huán)境需要長時(shí)間孵育刺激，更為嚴(yán)格的無菌操作環(huán)境需耗費(fèi)額外的物資和時(shí)間需耗費(fèi)額外

27、的物資和時(shí)間達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.24直接法直接法PVDFPVDF刺激物：ICE Peptide Pool40 Hours,2 X 105 Cell/ Well預(yù)孵育法預(yù)孵育法PVDFPVDF刺激物：ICE Peptide Pool24+16 Hours,2 X 105 Cell/ WellIFN-IFN-直接法與預(yù)培養(yǎng)法比較直接法與預(yù)培養(yǎng)法比較達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.25直接法直接法PVDFPVDF刺激物：破傷風(fēng)桿菌40Hours, 2X105Cell/Well預(yù)孵育法預(yù)孵育法PVDFPVD

28、F刺激物：破傷風(fēng)桿菌24+16 Hours, 2X105Cell/WellIL-10IL-10直接法與預(yù)培養(yǎng)法比較直接法與預(yù)培養(yǎng)法比較達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.2611.11.各種染色系統(tǒng)各種染色系統(tǒng)修飾的修飾的HRP/銀染系統(tǒng)銀染系統(tǒng)HRP/AECAP/BCIP&NBTHRP/DAB透明板：只有一種修飾的透明板：只有一種修飾的HRP/HRP/銀染系統(tǒng)，白色不透明斑點(diǎn)。銀染系統(tǒng)，白色不透明斑點(diǎn)。PVDFPVDF板：兩種標(biāo)記酶板：兩種標(biāo)記酶 辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶HRP-HRP-顯色快，但是背景高顯色快，但是背景高(30min)(30

29、min)AECAEC底物，顏色鮮艷，但易退色底物，顏色鮮艷，但易退色DABDAB底物，棕色斑點(diǎn)，著色稍牢固，但是板點(diǎn)松散底物，棕色斑點(diǎn)，著色稍牢固，但是板點(diǎn)松散堿性磷酸酶堿性磷酸酶AP-AP-顯色慢，但是背景干凈顯色慢，但是背景干凈(2h)(2h)BCIP&NBTBCIP&NBT混合底物，藍(lán)黑色，著色牢固混合底物，藍(lán)黑色，著色牢固達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.27第三部分：常見問題第三部分：常見問題0.0. 無斑點(diǎn)無斑點(diǎn) 斑點(diǎn)過少（影響斑點(diǎn)數(shù)量的因素）斑點(diǎn)過少（影響斑點(diǎn)數(shù)量的因素） 斑點(diǎn)過密斑點(diǎn)過密 斑點(diǎn)聚集在孔邊緣問題斑點(diǎn)聚集在孔邊

30、緣問題 斑點(diǎn)變花或者斑點(diǎn)變花或者“拖尾拖尾” 透明板透明板“空斑空斑”問題問題 斑點(diǎn)明顯偏大，并且彌散斑點(diǎn)明顯偏大，并且彌散 PVDFPVDF膜酒精預(yù)濕處理中的問題膜酒精預(yù)濕處理中的問題 細(xì)胞凋亡對細(xì)胞凋亡對ELISPOTELISPOT的影響的影響達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.28 ELISPOTELISPOT影響斑點(diǎn)形成的因素影響斑點(diǎn)形成的因素uQuality antibody pairQuality antibody pairuSolid support (polystyrene, nitrocellulose, PVDF)Solid suppo

31、rt (polystyrene, nitrocellulose, PVDF)uCells from STLV/HTLV-infected animals/humansCells from STLV/HTLV-infected animals/humansuCell source of tissues Cell source of tissues uCell composition (T cells, monocytes/macrophages, Cell composition (T cells, monocytes/macrophages, granulocytes, erythrocyte

32、s etc.)granulocytes, erythrocytes etc.)uKinetics cytokine productionKinetics cytokine productionuColoring systemColoring systemuWashing conditions/dilution bufferWashing conditions/dilution bufferuPreincubation (yes or no)Preincubation (yes or no)達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.29斑點(diǎn)過密，細(xì)胞數(shù)量過多斑點(diǎn)過

33、密，細(xì)胞數(shù)量過多 844 192Human PBMC, stimulate by CEF peptide pool人人PBMC/CEF刺激刺激 U-cytech無血清培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.30斑點(diǎn)聚集在孔邊緣問題斑點(diǎn)聚集在孔邊緣問題細(xì)胞集中于孔邊緣細(xì)胞集中于孔邊緣與細(xì)胞在孔邊緣的與細(xì)胞在孔邊緣的“層流阻滯層流阻滯”作用相關(guān)作用相關(guān)常見于常見于PVDF膜板，膜的自然曲率影響膜板，膜的自然曲率影響改善方法改善方法u接種細(xì)胞之后，不要搖動(dòng)、振蕩接種細(xì)胞之后，不要搖動(dòng)、振蕩u細(xì)胞體積不要超過細(xì)胞體積不要超過100uLu培養(yǎng)箱質(zhì)量，鋁

34、箔包裹均勻受熱培養(yǎng)箱質(zhì)量，鋁箔包裹均勻受熱u方型孔板可杜絕細(xì)胞（斑點(diǎn)）的邊緣效應(yīng)方型孔板可杜絕細(xì)胞（斑點(diǎn)）的邊緣效應(yīng)洗板時(shí)的流水沖擊力過大洗板時(shí)的流水沖擊力過大見于使用自動(dòng)洗板機(jī)的情景見于使用自動(dòng)洗板機(jī)的情景達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.31這是震動(dòng)所導(dǎo)致的斑點(diǎn)拖尾4. 4. 斑點(diǎn)變花或者斑點(diǎn)變花或者“拖尾拖尾”這是細(xì)胞趨化所導(dǎo)致的斑點(diǎn)變花n細(xì)胞在培養(yǎng)過程中震動(dòng)導(dǎo)致斑點(diǎn)拖尾n大部分斑點(diǎn)清晰，但部分出現(xiàn)“拖尾”，這并非震動(dòng)的原因主要原因是主要原因是DC所導(dǎo)致的細(xì)所導(dǎo)致的細(xì)胞趨化作用胞趨化作用常見于多價(jià)刺激，沒有固常見于多價(jià)刺激，沒有固定的定的DC比例，

35、有很大的比例，有很大的個(gè)體差異個(gè)體差異達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.325. 5. 透明板透明板“空斑空斑”問題問題n主要原因是粒細(xì)胞分主要原因是粒細(xì)胞分泌或分解所至的酶解泌或分解所至的酶解現(xiàn)象現(xiàn)象nPVDF膜板因底部是白膜板因底部是白色的膜，同時(shí)斑點(diǎn)更色的膜，同時(shí)斑點(diǎn)更致密而幾乎看不出來致密而幾乎看不出來改善方法改善方法采用單價(jià)刺激物，多價(jià)刺采用單價(jià)刺激物，多價(jià)刺激物時(shí)更容易出現(xiàn)激物時(shí)更容易出現(xiàn)與與PBMC分離的質(zhì)量密切分離的質(zhì)量密切相關(guān)相關(guān)采用預(yù)孵育法可大大減輕采用預(yù)孵育法可大大減輕這一現(xiàn)象這一現(xiàn)象達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH

36、 COMPANY Ltd.33我們自己的一個(gè)例子我們自己的一個(gè)例子（透明板，（透明板，PBMCPBMC，乙肝核心抗原蛋白），乙肝核心抗原蛋白）達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.346.6.斑點(diǎn)明顯偏大，并且彌散斑點(diǎn)明顯偏大，并且彌散u這與包被抗體的質(zhì)量、濃度有著密切的關(guān)系這與包被抗體的質(zhì)量、濃度有著密切的關(guān)系u隨著包被抗體濃度的增加，斑點(diǎn)變得清晰致密隨著包被抗體濃度的增加，斑點(diǎn)變得清晰致密u由于透明板的吸附能力差，這個(gè)問題更突出一些由于透明板的吸附能力差，這個(gè)問題更突出一些0.2ug/well0.5ug/well1.0ug/well達(dá)科為生物達(dá)科為生物D

37、AKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.35斑點(diǎn)偏大，彌散：我們自己的例子斑點(diǎn)偏大，彌散：我們自己的例子（透明板，（透明板，PBMCPBMC，乙肝核心抗原蛋白），乙肝核心抗原蛋白）達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.367. PVDF7. PVDF膜酒精預(yù)濕處理問題膜酒精預(yù)濕處理問題nPVDFPVDF膜由于其疏水性，需要酒精預(yù)濕潤膜由于其疏水性，需要酒精預(yù)濕潤n有些公司的產(chǎn)品聲稱不需要預(yù)濕，但是有些公司的產(chǎn)品聲稱不需要預(yù)濕，但是斑點(diǎn)減少斑點(diǎn)減少30-40%30-40%n由于膜的通透性，加入過量酒精會導(dǎo)致由于膜的通透性，加入過量酒精會導(dǎo)致其殘留在

38、膜的背面其殘留在膜的背面n正確方法正確方法減少酒精用量至減少酒精用量至 15ul 70% 15ul 70% 乙醇乙醇快速預(yù)濕快速預(yù)濕 3030秒，迅速用水或秒，迅速用水或PBSPBS洗滌至少洗滌至少三遍三遍達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.37一個(gè)客戶的實(shí)例一個(gè)客戶的實(shí)例達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.38v細(xì)胞凋亡是高背景、無斑點(diǎn)的重要原因細(xì)胞凋亡是高背景、無斑點(diǎn)的重要原因v如果有如果有3030細(xì)胞凋亡，完全不會出斑點(diǎn)；即使細(xì)胞凋亡，完全不會出斑點(diǎn)；即使5 5凋亡，也有嚴(yán)重凋亡，也有嚴(yán)重影響對策：對策：v臺盼藍(lán)

39、活細(xì)胞計(jì)數(shù)臺盼藍(lán)活細(xì)胞計(jì)數(shù)v復(fù)蘇凍存的細(xì)胞，可以先培養(yǎng)過夜，再做復(fù)蘇凍存的細(xì)胞，可以先培養(yǎng)過夜，再做ELISPOTELISPOT實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)8. 8. 細(xì)胞凋亡對細(xì)胞凋亡對ELISPOTELISPOT的影響的影響達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.39第四部分：第四部分：ELISPOTELISPOT應(yīng)用應(yīng)用nELISPOTELISPOT在國外的應(yīng)用已經(jīng)非常普遍，成為一項(xiàng)免疫學(xué)檢測常規(guī)在國外的應(yīng)用已經(jīng)非常普遍，成為一項(xiàng)免疫學(xué)檢測常規(guī)技術(shù)。凡是免疫學(xué)相關(guān)領(lǐng)域，都可以應(yīng)用技術(shù)。凡是免疫學(xué)相關(guān)領(lǐng)域，都可以應(yīng)用ELISPOTELISPOT技術(shù)。技術(shù)。n我們國內(nèi)，主要用疫

40、苗研究方面，尤其是艾滋病疫苗我們國內(nèi)，主要用疫苗研究方面，尤其是艾滋病疫苗。中國藥品生物制品檢定所：中國藥品生物制品檢定所： 2003年 預(yù)防用DNA疫苗臨床前研究技術(shù)指導(dǎo)原則預(yù)防用以病毒為載體的活疫苗制劑的技術(shù)指標(biāo)原則“使用ELISPOT方法檢測淋巴細(xì)胞分泌干擾素功能，應(yīng)該作為檢測和評價(jià)疫苗的細(xì)胞免疫的有效方法” WHOWHO：WHO-UNAIDS-sponsored training workshop 2003年 在艾滋病(HIV)疫苗的研究中，推薦使用ELISPOT檢測淋巴細(xì)胞分泌干擾素功能。在我國舉辦了技術(shù)培訓(xùn)學(xué)習(xí)班。nELISPOTELISPOT在國內(nèi)大規(guī)模應(yīng)用的時(shí)代已經(jīng)到來。在國內(nèi)

41、大規(guī)模應(yīng)用的時(shí)代已經(jīng)到來。達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.40國外國外ELISPOTELISPOT應(yīng)用應(yīng)用疫苗研究疫苗研究HIV疫苗：在小鼠上檢驗(yàn)抗原性；在猴體檢驗(yàn)保護(hù)功效；在人體檢驗(yàn)免疫原性；研究猴子感染SIV動(dòng)力學(xué)；I型與II型HIV引發(fā)的CTL反應(yīng)差別；HBV疫苗：疫苗的免疫原性；疫苗的治療效果；疫苗的給藥途徑；不同病人的敏感性腫瘤疫苗 抗腫瘤甲胎蛋白和熱休克蛋白DNA疫苗；DC疫苗預(yù)防胃癌；DC疫苗治療白血?。宦殉舶┲械募?xì)胞免疫情況；日本臨床DC疫苗治療黑色素瘤的情況其它疫苗：瘧疾疫苗：瘧疾疫苗產(chǎn)生的CD4+8+和體液免疫反應(yīng)；克隆病疫苗；肝癌

42、疫苗；HPV疫苗；抗原表位篩選： 結(jié)核桿菌的CTL表位；丙肝CTL表位；HIV-1表位肽；用肽庫篩選T細(xì)胞表位肽；HIV蛋白酶和整合酶功能域中的CTL表位；痘病毒的T細(xì)胞表位自身免疫病研究、診斷自身免疫病研究、診斷風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡 研究紅斑狼瘡患者腎中的抗體分泌細(xì)胞的影響牛皮癬（銀屑?。褐虏C(jī)理，易感病人預(yù)測，治療效果評估I-型糖尿?。褐虏C(jī)理，臨床檢測，易感病人預(yù)測麻風(fēng)病 多重硬化癥結(jié)核?。憾嘀乜顾幮?、癥狀不明顯的結(jié)核病早期診斷器官移植器官移植腎移植 肝移植 骨髓移植：次要組織相容性抗原(H)在骨髓移植中的影響；肝移植免疫耐受研究CCR2在移植排斥中的角色；研究移植耐受性差異；免疫系

43、統(tǒng)研究免疫系統(tǒng)研究研究抗體分泌細(xì)胞：B細(xì)胞的成熟；活化；抗體分泌細(xì)胞在粘膜的分布研究粘膜免疫反應(yīng)：不同的粘膜部位；局部免疫與系統(tǒng)免疫；各種疫苗的粘膜保護(hù)效果研究基礎(chǔ)免疫學(xué)：研究基因治療中的外源蛋白免疫耐受；腫瘤疫苗對細(xì)胞免疫的刺激；研究DC細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)；抗瘧疾研究；HIV患者中細(xì)胞免疫強(qiáng)度和病毒載量的關(guān)系；同時(shí)評估多種細(xì)胞免疫反應(yīng)；測定針對原生腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)；急性丙肝病人體內(nèi)的細(xì)胞免疫反應(yīng)；老年人對流感病毒免疫反應(yīng)低下的原因分析；達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.41ELISPOTELISPOT在國內(nèi)的應(yīng)用在國內(nèi)的應(yīng)用HIVHIV疫苗疫苗HBV(H

44、BV(乙肝乙肝) )疫苗疫苗SARSSARS疫苗疫苗HEV(HEV(戊肝戊肝) )疫苗疫苗乙肝診斷與治療評估乙肝診斷與治療評估I- I-性糖尿病診斷性糖尿病診斷肝移植排斥反應(yīng)肝移植排斥反應(yīng)B B細(xì)胞抗體分泌研究細(xì)胞抗體分泌研究達(dá)科為生物達(dá)科為生物DAKEWE BIOTECH COMPANY Ltd.42ELISPOTELISPOT在在HIVHIV疫苗研究中的應(yīng)用疫苗研究中的應(yīng)用n體液免疫與細(xì)胞免疫：細(xì)胞免疫在控制體液免疫與細(xì)胞免疫：細(xì)胞免疫在控制HIV主治方面發(fā)揮了主主治方面發(fā)揮了主要作用要作用n目前沒有任何疫苗能預(yù)防目前沒有任何疫苗能預(yù)防HIV的感染，但是可以減輕感染之后的感染，但是可以減輕感染之后的發(fā)病情況，甚至不再發(fā)病。的發(fā)病情況，甚至不再發(fā)病。n評價(jià)評價(jià)HIV疫苗的好壞不再與看它激發(fā)的抗體，而在于看它激發(fā)疫苗的好壞不再與看它激發(fā)的抗體，而在于看它激發(fā)的病毒特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。的病毒特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。n目前評價(jià)這個(gè)指標(biāo)最好的方法就是：目前評價(jià)這個(gè)指標(biāo)最好的方法就是：ELISPOT!疫苗免疫兩周后，猴PBMC對HIV病毒裂解物的IFN-ELISPOT反應(yīng)A, 肌肉與粘膜聯(lián)合免疫；B,單獨(dú)肌肉免疫。 Makitalo B. et. al. Enhanced cel