質(zhì)粒DNA的酶切鑒定.PPT

1、1實驗二實驗二 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的酶切鑒定的酶切鑒定及瓊脂糖凝膠電泳及瓊脂糖凝膠電泳21. 實驗?zāi)康暮鸵髮嶒災(zāi)康暮鸵髮W(xué)習(xí)和掌握限制性內(nèi)切酶的特性、酶學(xué)習(xí)和掌握限制性內(nèi)切酶的特性、酶解和瓊脂糖凝膠電泳的操作方法，并解和瓊脂糖凝膠電泳的操作方法，并理解限制性內(nèi)切酶是理解限制性內(nèi)切酶是DNA重組技術(shù)的重組技術(shù)的關(guān)鍵工具，瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒關(guān)鍵工具，瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定定DNA片段的有效方法。片段的有效方法。 32. 相關(guān)基礎(chǔ)知識相關(guān)基礎(chǔ)知識 限制性核酸內(nèi)切酶：是一類能識別雙限制性核酸內(nèi)切酶：是一類能識別雙鏈鏈DNA分子特異性核酸序列的分子特異性核酸序列的DNA水水解酶。是體外剪切基因片段的

2、重要工解酶。是體外剪切基因片段的重要工具，所以常常與核酸聚合酶、連接酶具，所以常常與核酸聚合酶、連接酶以及末端修飾酶等一起稱為工具酶。以及末端修飾酶等一起稱為工具酶。限制性核酸內(nèi)切酶不僅是限制性核酸內(nèi)切酶不僅是DNA重組中重組中重要的工具，而且還可以用于基因組重要的工具，而且還可以用于基因組酶切圖譜的鑒定。酶切圖譜的鑒定。41) 寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象2) 核酸限制性內(nèi)切酶的類型核酸限制性內(nèi)切酶的類型3) 核酸限制性內(nèi)切酶的基本特性核酸限制性內(nèi)切酶的基本特性4) 同裂酶和同尾酶同裂酶和同尾酶5) 核酸限制性內(nèi)切酶的命名法核酸限制性內(nèi)切酶的命名法6) 影響核酸限制性內(nèi)切

3、酶活性的因素影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素51) 寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象限制與修飾系統(tǒng)是細(xì)胞的一種防衛(wèi)手段。限制與修飾系統(tǒng)是細(xì)胞的一種防衛(wèi)手段。 各各種細(xì)菌都能合成一種或幾種能夠切割種細(xì)菌都能合成一種或幾種能夠切割DNA雙雙鏈的核酸內(nèi)切酶，它們以此來限制外源鏈的核酸內(nèi)切酶，它們以此來限制外源DNA存在于自身細(xì)胞內(nèi)，但合成這種酶的細(xì)胞自存在于自身細(xì)胞內(nèi)，但合成這種酶的細(xì)胞自身的身的DNA不受影響，因為這種細(xì)胞還合成了不受影響，因為這種細(xì)胞還合成了一種修飾酶，對自身的一種修飾酶，對自身的DNA進行了修飾，限進行了修飾，限制性酶對修飾過的制性酶對修飾過的DNA不能起作用。這

4、種現(xiàn)不能起作用。這種現(xiàn)象被稱為寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象。象被稱為寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象。62)限制性核酸內(nèi)切酶的類型及特性限制性核酸內(nèi)切酶的類型及特性按限制酶的組成、與修飾酶活性關(guān)系以及切按限制酶的組成、與修飾酶活性關(guān)系以及切斷核酸的情況不同，分為三類：斷核酸的情況不同，分為三類： 型型 型型* 型型7第一類（第一類（I I型）限制性內(nèi)切酶型）限制性內(nèi)切酶能識別專一能識別專一的核苷酸順序，并在識別點附近的一些核的核苷酸順序，并在識別點附近的一些核苷酸上切割苷酸上切割DNADNA分子中的雙鏈，但是切割分子中的雙鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機的。這的核苷酸順序沒有專一性，是隨機的。這

5、類限制性內(nèi)切酶在類限制性內(nèi)切酶在DNADNA重組技術(shù)或基因工重組技術(shù)或基因工程中用處不大，無法用于分析程中用處不大，無法用于分析DNADNA結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)或克隆基因。這類酶如克隆基因。這類酶如EcoEcoB B、EcoEcoK K等。等。 8第二類第二類(II(II型型) )限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶能識別專一的核苷能識別專一的核苷酸順序，并在該順序內(nèi)的固定位置上切割雙鏈。酸順序，并在該順序內(nèi)的固定位置上切割雙鏈。由于這類限制性內(nèi)切酶的識別和切割的核苷酸由于這類限制性內(nèi)切酶的識別和切割的核苷酸都是專一的。因此，這種限制性內(nèi)切酶是都是專一的。因此，這種限制性內(nèi)切酶是DNADNA重組技術(shù)中最常用的工具酶

6、之一。這種酶識別重組技術(shù)中最常用的工具酶之一。這種酶識別的專一核苷酸順序最常見的是的專一核苷酸順序最常見的是4 4個或個或6 6個核苷酸，個核苷酸，少數(shù)也有識別少數(shù)也有識別5 5個核苷酸以及個核苷酸以及7 7個、個、8 8個、個、9 9個、個、1010個和個和1111個核苷酸的。個核苷酸的。 II II 型限制性內(nèi)切酶的型限制性內(nèi)切酶的識別順序是一個回文對稱順序，即有一個中心識別順序是一個回文對稱順序，即有一個中心對稱軸，從這個軸朝二個方向?qū)ΨQ軸，從這個軸朝二個方向“讀讀”都完全相都完全相同。這種酶的切割可以有兩種方式：同。這種酶的切割可以有兩種方式：9粘性末端；是交錯切割，結(jié)果形成兩條單鏈末

7、端，粘性末端；是交錯切割，結(jié)果形成兩條單鏈末端，這種末端的核苷酸順序是互補的，可形成氫鍵，這種末端的核苷酸順序是互補的，可形成氫鍵，所以稱為粘性末端。所以稱為粘性末端。如如EcoRIEcoRI的識別順序為：的識別順序為： 5 GAA|TT_C 35 GAA|TT_C 3 3 C_TT|AAG 5 3 C_TT|AAG 5垂直線表示中心對稱軸，從兩側(cè)垂直線表示中心對稱軸，從兩側(cè)“讀讀”核苷酸順序都是核苷酸順序都是GAATTCGAATTC或或CTTAAGCTTAAG，這就是回文順序（，這就是回文順序（palindromepalindrome）。）。_ _和和表示在雙鏈上交錯切割的位置，切割后生成表

8、示在雙鏈上交錯切割的位置，切割后生成5G5G和和AATTC3AATTC3、3CTTAA3CTTAA和和G5G5二個二個DNADNA片段，各片段，各有一個單鏈末端，二條單鏈?zhǔn)腔パa的，其斷裂的磷酸二酯有一個單鏈末端，二條單鏈?zhǔn)腔パa的，其斷裂的磷酸二酯鍵以及氫鍵可通過鍵以及氫鍵可通過DNADNA連接酶的作用而連接酶的作用而“粘合粘合”。10IIII型酶切割方式的另一種是在同一位置型酶切割方式的另一種是在同一位置上切割雙鏈，產(chǎn)生平頭末端。例如上切割雙鏈，產(chǎn)生平頭末端。例如EcoEcoRV RV 的識別位置是：的識別位置是： 5 GAT|ATC 35 GAT|ATC 33 CTA|TAG 5 3 CTA

9、|TAG 5 切割后形成切割后形成5 GAT5 GAT和和ATC 3ATC 3、 3 CTA3 CTA和和TAG 5TAG 5。這種末端。這種末端同樣可以通過同樣可以通過DNADNA連接酶連接起來。連接酶連接起來。平頭末端：平頭末端：11第三類（第三類（ IIIIII型）限制性內(nèi)切酶型）限制性內(nèi)切酶也有專一也有專一的識別順序，但不是對稱的回文順序的識別順序，但不是對稱的回文順序, ,在識在識別順序旁邊幾個核苷酸對的固定位置上切別順序旁邊幾個核苷酸對的固定位置上切割雙鏈。但這幾個核苷酸對不是特異性的。割雙鏈。但這幾個核苷酸對不是特異性的。因此，這種限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的一因此，這種限制性內(nèi)切酶

10、切割后產(chǎn)生的一定長度定長度DNADNA片段，具有各種單鏈末端。因此片段，具有各種單鏈末端。因此不能應(yīng)用于基因克隆。不能應(yīng)用于基因克隆。12同裂酶：同裂酶：有時兩種限制性內(nèi)切酶的識別核苷酸順序有時兩種限制性內(nèi)切酶的識別核苷酸順序和切割位置都相同，有時其差別只在于當(dāng)和切割位置都相同，有時其差別只在于當(dāng)識別順序中有甲基化的核苷酸時，一種限識別順序中有甲基化的核苷酸時，一種限制性內(nèi)切酶可以切割，另一種則不能。例制性內(nèi)切酶可以切割，另一種則不能。例如如HpaHpa和和MspMsp的識別順序都是的識別順序都是5GCG_G35GCG_G3，如果其中有，如果其中有5-5-甲基胞嘧啶，則只有甲基胞嘧啶，則只有H

11、paHpa能夠切割。這些能夠切割。這些有相同切點的酶稱為有相同切點的酶稱為同裂酶（同切酶或異同裂酶（同切酶或異源同工酶）源同工酶）。 3） 同裂酶和同尾酶：同裂酶和同尾酶：13有時兩種酶切割序列不完全相同，但卻能產(chǎn)有時兩種酶切割序列不完全相同，但卻能產(chǎn)生相同的粘性末端，這類酶被稱為生相同的粘性末端，這類酶被稱為同尾酶同尾酶，可以通過可以通過DNADNA連接酶將這類末端連接起來，但連接酶將這類末端連接起來，但原來的酶切位點將被破壞，有時可能會產(chǎn)生原來的酶切位點將被破壞，有時可能會產(chǎn)生一個新的酶切位點。如一個新的酶切位點。如XbaXba1 1、NheNhe1 1以及以及SpeSpe1 1切割的切割

12、的DNADNA序列不同，但均給出相同的序列不同，但均給出相同的“CTAG”CTAG”粘性末端。這些粘性末端連接后，以上的酶粘性末端。這些粘性末端連接后，以上的酶將不能再切割，但卻產(chǎn)生了一個新的將不能再切割，但卻產(chǎn)生了一個新的4 4核苷酸核苷酸的酶切位點，即的酶切位點，即 BfaBfa1 1的酶切位點。的酶切位點。同尾酶：同尾酶：144) 限制性核酸內(nèi)切酶的命名法限制性核酸內(nèi)切酶的命名法v 用屬名的頭一個字母和種名的頭兩個字母用屬名的頭一個字母和種名的頭兩個字母表示寄主菌的物種名稱，如表示寄主菌的物種名稱，如E. coli 用用Eco表表示，所以用斜體字。示，所以用斜體字。v 用一個字母代表菌株

13、或型，如流感嗜血菌用一個字母代表菌株或型，如流感嗜血菌Rd菌株用菌株用d，即，即Hind。v 如果一種特殊的寄主菌株，具有幾個不同如果一種特殊的寄主菌株，具有幾個不同的限制與修飾體，則以羅馬數(shù)字表示，如的限制與修飾體，則以羅馬數(shù)字表示，如Hind, Hind，Hind等。等。155) 影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素(1) DNA的純度；的純度；(2) DNA的甲基化程度；的甲基化程度；(3) 酶切消化反應(yīng)的溫度；酶切消化反應(yīng)的溫度；(4) DNA的分子結(jié)構(gòu)；的分子結(jié)構(gòu)；(5) 溶液中離子濃度及種類；溶液中離子濃度及種類；(6) 緩沖液的緩沖液的 pH值。值。16瓊

14、脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是利用瓊脂糖溶化再凝固后瓊脂糖凝膠電泳是利用瓊脂糖溶化再凝固后能形成帶有一定孔隙的固體基質(zhì)的特性，其能形成帶有一定孔隙的固體基質(zhì)的特性，其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場的作用下密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場的作用下及中性及中性pH的緩沖條件下帶負(fù)電的核酸分子就的緩沖條件下帶負(fù)電的核酸分子就可以向陽極遷移?？梢韵蜿枠O遷移。影響影響DNA在瓊脂糖中遷移率的因素：在瓊脂糖中遷移率的因素：DNA分分子的大小、子的大小、DNA的構(gòu)象、電壓、電場方向、的構(gòu)象、電壓、電場方向、堿基組成、嵌入的燃料以及電泳緩沖液的組堿基組成、嵌入的燃料以及電泳緩沖液的組成。成。17瓊脂

15、糖凝的濃度影響給定大小的線狀瓊脂糖凝的濃度影響給定大小的線狀DNA的的遷移率，因此采用不同濃度的凝膠可以分離遷移率，因此采用不同濃度的凝膠可以分離不同大小范圍的不同大小范圍的DNA片段。片段。0.8%的瓊脂糖凝的瓊脂糖凝膠能很好地分辨膠能很好地分辨1-25kb的片段；的片段；0.5% 的瓊脂的瓊脂糖凝膠用于分辨較大片段的糖凝膠用于分辨較大片段的DNA (20-100kb）；對于小片段的）；對于小片段的DNA(0.2-2kb) 可用可用1.5%或更高濃度的凝膠進行分離。不過，以或更高濃度的凝膠進行分離。不過，以上這些并不是絕對的，因為有時我們需要同上這些并不是絕對的，因為有時我們需要同時分離多種

16、分子量相差較大的片段，因此所時分離多種分子量相差較大的片段，因此所用瓊脂糖凝膠的濃度要視情況而定。用瓊脂糖凝膠的濃度要視情況而定。18EBEB：即：即3,8-3,8-二氨基二氨基-5-5-乙基乙基-6-6-苯基菲錠溴鹽苯基菲錠溴鹽, , (Ethidium Bromide)(Ethidium Bromide)。它能夠插入。它能夠插入DNADNA分子分子中的堿基對之間而與中的堿基對之間而與DNADNA結(jié)合。由于結(jié)合。由于EBEB分子分子的插入，在紫外光的照射下，凝膠電泳中的的插入，在紫外光的照射下，凝膠電泳中的DNADNA條帶呈現(xiàn)出紅色熒光，易于檢測?？梢詶l帶呈現(xiàn)出紅色熒光，易于檢測。可以檢測檢

17、測10ng 10ng 的的DNADNA。注意：注意：EBEB是一種誘變劑，操作時一定是一種誘變劑，操作時一定要注意安全操作，必須戴塑料或乳膠要注意安全操作，必須戴塑料或乳膠手套手套!193. 3. 實驗材料與儀器實驗材料與儀器 質(zhì)粒質(zhì)粒 pCMV-Myc-T10pCMV-Myc-T10 NEB NEB 標(biāo)準(zhǔn)分子量片段標(biāo)準(zhǔn)分子量片段(1kb DNA Ladder)(1kb DNA Ladder)EcoEcoRIRI 和和 XhoXhoI I 核酸內(nèi)切酶（核酸內(nèi)切酶（TakaraTakara）EcoRI和 XhoI酶解緩沖液酶解緩沖液(10(10H buffer)H buffer) 瓊脂糖瓊脂糖

18、TBETBE或或TAETAE緩沖液緩沖液(10(10) ) 溴化乙啶染色液溴化乙啶染色液(10mg/ml)(10mg/ml) 上樣液上樣液(6(6) )：0.25% 0.25% 溴酚蘭，溴酚蘭，4040(W/V)(W/V)蔗蔗糖糖 水溶液或水溶液或3030的甘油。的甘油。20InsertEcoRIXhoI1.9kb質(zhì)粒質(zhì)粒211 kb DNA Ladder1 kb DNA Ladder不能對不能對DNADNA質(zhì)量進行精質(zhì)量進行精確定量分析，但可以通過與相近的條帶進確定量分析，但可以通過與相近的條帶進行比較估算出大概的數(shù)據(jù)。每條帶大致的行比較估算出大概的數(shù)據(jù)。每條帶大致的量如下（按量如下（按0.

19、5g0.5g上樣量計。應(yīng)按上樣量計。應(yīng)按1313條帶條帶計算，因為計算，因為3kb3kb的量是其它片段量的近三的量是其它片段量的近三倍）：倍）： 1 kb DNA Marker22片段堿基對質(zhì)量110,00242 ng28,00142 ng36,00150 ng45,00142 ng54,00133 ng63,001125 ng72,00048 ng81,50036 ng91,00042 ng10a51742 ng*10b50042 ng*23EcoR I 酶切位點：酶切位點：GAATT_CXho I 酶切位點：酶切位點：CTCGA_G1010H buffer: 500mM Tris-HCl(

20、pH7.5)H buffer: 500mM Tris-HCl(pH7.5) 100mM MgCl 100mM MgCl2 2 10mM Dithiothreitol 10mM Dithiothreitol 1000mM NaCl 1000mM NaCl24酶活性的定義：酶活性的定義：一個活性單位（一個活性單位（U)U)，是指在，是指在5050 l l反應(yīng)體系中，反應(yīng)體系中，3737o oC C的條件下，經(jīng)過的條件下，經(jīng)過1 1小時的反應(yīng)時間，將小時的反應(yīng)時間，將1 1 g g DNA DNA 完全酶解所需要的酶量。完全酶解所需要的酶量。因為不同的酶所要求的最適反應(yīng)條件不同，所因為不同的酶所要求

21、的最適反應(yīng)條件不同，所以一定要使用與酶相匹配的緩沖系統(tǒng)。一般按以一定要使用與酶相匹配的緩沖系統(tǒng)。一般按照銷售酶的公司所提供的相應(yīng)緩沖液。雙酶切照銷售酶的公司所提供的相應(yīng)緩沖液。雙酶切或多酶切時要考慮相容性緩沖液問題，一般公或多酶切時要考慮相容性緩沖液問題，一般公司會給用戶提供這方面的信息。司會給用戶提供這方面的信息。25電泳儀，電泳槽，紫外透射儀，電泳儀，電泳槽，紫外透射儀，凝膠成像儀，一次性塑料手套等凝膠成像儀，一次性塑料手套等儀器設(shè)備儀器設(shè)備264. 實驗方法和步驟實驗方法和步驟 27* * 緩沖液隨不同的酶而不同緩沖液隨不同的酶而不同, ,本實驗用本實驗用 H bufferH buffe

22、r。置于置于3737水浴酶解水浴酶解0.5-10.5-1小時。酶解完成后，分小時。酶解完成后，分別加入別加入1010 l l 3 3倍的上樣緩沖液倍的上樣緩沖液, , 然后各取然后各取1515 l l進進行電泳分析。行電泳分析。1) 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的酶解（自提質(zhì)粒的酶解（自提質(zhì)粒pCMV-Myc-T10）282) 瓊脂糖凝膠的制備瓊脂糖凝膠的制備瓊脂糖凝膠液的制備：稱取瓊脂糖凝膠液的制備：稱取0.8g瓊脂糖，瓊脂糖，置于三角瓶中，加入置于三角瓶中，加入100ml TBE或或TAE工作液，瓶口倒扣一個小燒杯，將該三工作液，瓶口倒扣一個小燒杯，將該三角瓶置于微波爐加直至瓊脂溶解。角瓶置于微波爐加直

23、至瓊脂溶解。293）膠板的制備）膠板的制備取有機玻璃內(nèi)槽，洗凈、晾干；將有機取有機玻璃內(nèi)槽，洗凈、晾干；將有機玻璃內(nèi)槽置于一水平位置模具上，放好玻璃內(nèi)槽置于一水平位置模具上，放好梳子。梳子。 30將冷卻至將冷卻至65左右的瓊脂糖凝膠液，小心地倒左右的瓊脂糖凝膠液，小心地倒在有機玻璃內(nèi)槽上，控制灌膠速度和量，使膠在有機玻璃內(nèi)槽上，控制灌膠速度和量，使膠液緩慢地展開，直到在整個有機玻璃板表面形液緩慢地展開，直到在整個有機玻璃板表面形成均勻的膠層。成均勻的膠層。室溫下靜置室溫下靜置30min左右，待凝固完全后，輕輕拔左右，待凝固完全后，輕輕拔出梳子，在膠板上即形成相互隔開的上樣孔。出梳子，在膠板上即

24、形成相互隔開的上樣孔。制好膠后將鋪膠的有機玻璃內(nèi)槽放在含有制好膠后將鋪膠的有機玻璃內(nèi)槽放在含有0.5-1TAE（Tris-乙酸）乙酸） 或或TBE（Tris-硼酸）工作硼酸）工作液的電泳槽中使用。液的電泳槽中使用。314）加樣）加樣用微量加樣器將上述樣品分別加入膠板的用微量加樣器將上述樣品分別加入膠板的樣品孔內(nèi)。每加完一個樣品，換一個加樣樣品孔內(nèi)。每加完一個樣品，換一個加樣頭。加樣時應(yīng)防止碰壞樣品孔周圍的凝膠頭。加樣時應(yīng)防止碰壞樣品孔周圍的凝膠面以及穿透凝膠底部，本實驗樣品孔容量面以及穿透凝膠底部，本實驗樣品孔容量約約1520 l。1 kb DNA ladder（能見到（能見到10條帶）條帶）

25、: 在第在第一個上樣孔或最后一個上樣孔內(nèi)加入一個上樣孔或最后一個上樣孔內(nèi)加入6 l 的的 1 kb DNA ladder（50ng/ l ）。）。325）電泳（帶上手套操作）電泳（帶上手套操作） 加完樣后的凝膠板即可通電進行電泳；加完樣后的凝膠板即可通電進行電泳； 建議在建議在80100V的電壓下電泳；的電壓下電泳； 當(dāng)溴酚蘭移動到距離膠板下沿約當(dāng)溴酚蘭移動到距離膠板下沿約1cm處停處停止電泳；止電泳； 將凝膠放入溴化乙啶（將凝膠放入溴化乙啶（EB工作液工作液（0.5 g/ml左右）中染色約左右）中染色約20min。33為了獲得電泳分離為了獲得電泳分離DNA片段的最大分辨率，片段的最大分辨率，電場強度不應(yīng)高于電場強度不應(yīng)高于5V/cm（兩電極間的距（兩電極間的距離）。電泳溫度視需要而定，對大分子的離）。電泳溫度視需要而定，對大分子的分離，以低溫較好，也可在室溫下進行。分離，以低溫較好