最權(quán)威最齊全的PCR匯總及其原理,程序

1、rtpcrtpcr - rt-pcr 簡介反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) (reverse transcription-polymerase chain reaction, rt-p cr)是將rna的反轉(zhuǎn)錄(reverse transcription )和cdna的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(pcr)相結(jié) 合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄嗨的作用從rna合成cdna,旳以cdna為模板，擴(kuò)增合成冃的片段。 rt-pcr技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細(xì)胞屮基因表達(dá)水平，細(xì)胞屮rna病毒的含量 和肓接克隆特定基因的cdna序列。作為模板的rna可以是總rna、mrna或體外轉(zhuǎn)錄的rna 產(chǎn)物。無論使用何種rna,關(guān)鍵是確保rn

2、a中無rna陸和基因組dna的污染。rtpcr -原理只要是利用相關(guān)技術(shù)提取組織或細(xì)胞中的總rna,以其中的mrna作為模板，采用olig o (dt)或隨機(jī)引物利用反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cdnao再以cdna為模板經(jīng)行pcr擴(kuò)增，而獲得 目的基因或檢測基因表達(dá)。rtpcr -過程rt-pcr可以用一步法或兩步法的形式進(jìn)行。在兩步法rt-pcr中，每一步都在最佳條件 下進(jìn)行。cdna的合成首先在反轉(zhuǎn)錄緩沖液小進(jìn)行，然后取出1/10的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行pcr。在 一步法rt-pcr中，在同時為反轉(zhuǎn)錄和pcr優(yōu)化的條件下，反轉(zhuǎn)錄和pcr在一直觀眾順次進(jìn) 行。1、反轉(zhuǎn)錄酶的選擇rt-pcr兩種方法連用予rnrn

3、ait這受群析 two step rt pcr 叢早古 < u random 4*oii$o-dt箱可以制&cdnapod cdna才臺*佯屛連用于屛母it愉測円兀鼻鼻十tiangen兩種方法1、money鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶冇較強(qiáng)的聚合酚活性，rna酶h活性相對較弱。最適作用溫度為37°。2、amv反轉(zhuǎn)錄酶有強(qiáng)的聚合酶活性和rna酶ii活性。最適溫度為42°。2、合成cdna引物的選擇用于反轉(zhuǎn)錄的引物可視實(shí)驗(yàn)的具體情況選擇隨機(jī)引物、oligo dt及基因特界性引物中 的一種。對于短的不具冇發(fā)卡結(jié)構(gòu)的真核細(xì)胞mrna,三種都可。一步法實(shí)匕示意0b（卿一個反總管

4、中）<-d步法rt-pcr引物的選擇:1隨機(jī)引物 適用于長的或具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的rnao確 于rrna> nirna、trna等所有rna 的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。主要用于單一模板的rt-pcr反應(yīng)。合成法示倉8b （兩步濟(jì)u<cmab兩步法2. oligo dt適用于具有polya尾巴的rna。（原核生物的rna、真核生物的oligo dt rrna和trna不具有polya尾巴。）由于oligo dt要結(jié)合到polya尾巴上,所以對rna樣 品的質(zhì)量要求較高，即使有少量降解也會使全長cdna合成儀人人減少。3. 基因特異性引物與模板序列互補(bǔ)的引物，適用于目的序列已知的悄況。rtpcr

5、-影響因素rt-pcr反應(yīng)受多個因素影響，如硫酸鎂的濃度，引物退火的溫度，擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)等。1、建議選擇0. 5-3. 0 mm （相差0.5 mm）的硫酸鎂作初步實(shí)驗(yàn)。2、對于具有較高tm的引物，增加退火和延伸時的溫度對反應(yīng)有利。較高的溫度有利于 減少非特異的引物結(jié)合，因而提高特異產(chǎn)物的得率。3、人多數(shù)口標(biāo)rna經(jīng)40輪pcr反應(yīng)就能觀察到。但如果口標(biāo)rna太稀少，或者只有很 少的起始材料，有必要增加擴(kuò)增的次數(shù)到45-50次。反向pcr反向pcr是一種新型的基因擴(kuò)增方法，它能擴(kuò)增一段已知序列旁側(cè)的dna,也就是說這一 反應(yīng)體系不是在一對引物z間而是在引物外側(cè)合成dnao反向pcr -簡介pcr

6、只能擴(kuò)增兩端序列已知的基因片段，反向pcr nj'擴(kuò)增中間一段已知序列，而兩端序列未 知的基因片段不擴(kuò)增。反轉(zhuǎn)錄pcr反轉(zhuǎn)錄pcr又稱為逆轉(zhuǎn)錄pcr,是指擴(kuò)增mrna的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)。先將mrna反轉(zhuǎn)錄 成cdna,然后再以cdna為模板，用pcr方法加以擴(kuò)增。3 pfiexlazbmrlwmrua cwaj waaag1 super rnasek 伍tjreverse transmptasc3pcrtwvttttttrt-pcr反應(yīng)原理反轉(zhuǎn)錄 pcr (reverse transcription-polymerase chain reaction, rt-pcr) 乂稱為逆轉(zhuǎn) 錄pcr

7、。其原理是:提取組織或細(xì)胞中的總rna,以其中的mrna作為模板,釆用0ligo(dt) 或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cdna。再以cdna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，而獲得冃的基因 或檢測基因表達(dá)。rt-pcr使rna檢測的靈敏性提高了兒個數(shù)雖級，使一些極為微屋rna樣 品分析成為可能。該技術(shù)主要用于：分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、獲取目的基因、合成cdna探針、 構(gòu)建 rna 髙效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。rt- pcr (reverse transcription-polymerase chain reaction) 即逆轉(zhuǎn)錄pcr,是將rna的逆轉(zhuǎn)錄(rt)和cdna的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)(pcr)相結(jié)合的技 術(shù)。r

8、t-pcr技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細(xì)胞/組織中基因表達(dá)水平，細(xì)胞中rna病 毒的含量和直接克隆特定基因的cdna序列等。反轉(zhuǎn)錄pcr、反轉(zhuǎn)錄酶的選擇1money鼠片血病病毒(mmlv)反轉(zhuǎn)錄酶：有強(qiáng)的聚合酶活性，ra酶h活性相對較 弱。最適作用溫度為37°co2. 禽成髓細(xì)胞瘤病毒(amv)反轉(zhuǎn)錄酚：有強(qiáng)的聚合陸活性和rna b h活性。最適作 用溫度為42°co3. thermus thermophilus> thermus flavus等嗜熱微生物的熱穩(wěn)定性反轉(zhuǎn)錄酶:在m n2存在下，允許高溫反轉(zhuǎn)錄rna,以消除rna模板的二級結(jié)構(gòu)。4. mmlv反轉(zhuǎn)錄酶

9、的rnase h-突變體：商品名為superscript和superscript ii <>此種 酶較英它酶能多將更大部分的rna轉(zhuǎn)換成cdna,這一特性允許從含二級結(jié)構(gòu)的、低溫反轉(zhuǎn) 錄很困難的mrna模板合成較長cdnao反轉(zhuǎn)錄pcr -二.合成cdna引物的選擇1. 隨機(jī)六聚體引物：當(dāng)特定nirna由于含有使反轉(zhuǎn)錄猶終止的序列而難于拷貝其全長 序列時，可采用隨機(jī)六聚體引物這一不特異的引物來拷貝全長mrnao用此種方法時，體系 屮所有rna分子全部充當(dāng)了 cdna第一鏈模板，pcr引物在擴(kuò)增過程中賦予所需要的特異性。 通常用此引物合成的cdna屮96%來源于rrn'ao2

10、. oligo(dt)：是一種對mrna特異的方法。因絕人多數(shù)真核細(xì)胞mrna具有3'端po lv(a )尾,此引物與其配對,僅mrna可被轉(zhuǎn)錄。由于poly(a )rna僅占總rna的1-4%,故 此種引物合成的cdna比隨機(jī)六聚體作為引物和得到的cdna在數(shù)量和復(fù)雜性方面均要小。3. 特異性引物：最特異的引發(fā)方法是用含目標(biāo)rna的互補(bǔ)序列的寡核廿酸作為引物, 若pcr反應(yīng)用二種特異性引物，第一條鏈的合成可由與mrna 3'端最靠近的配對引物起始。 川此類引物僅產(chǎn)生所需要的cdna,導(dǎo)致更為特異的pcr擴(kuò)增。反轉(zhuǎn)錄pcr -三、操作步驟1. 總rna的提取。2. cdna第一

11、鏈的合成(reverse transcription):冃前試劑公司有多種cdna第一鏈 試劑盒出售，具原理基本相同，但操作步驟不-?，F(xiàn)以g1b1c0l公司提供的superscripttmpreamplification system for first strand cdna synthesis 試劑盒為例。(1) 在0.5ml微量離心管中,加入總rna 1-5 ug,補(bǔ)充適量的depc h20使總體積達(dá)1 ink 在管中加10um oligo (dt) 12-18 lul,輕輕混勻、離心。(2) 70°c加熱lomin,立即將微量離心管插入冰浴中至少lmino然后加入卜列試劑的混

12、合物：10xpcr buffer 2口 125mm mgc12 2u 11omm dntpmi x 1u 10. im dtt 2u 1輕輕混勻,離心。42°c孵育2-5mino（3）加入 superscript ii1 u 1 ,在 42°c水浴中孵育 50mino（4）于70°c加熱15min以終止反應(yīng)。（5）將管插入冰中，加入rnase ii 1 u 1 , 37°c孵育20min,降解殘留的rna。-20°c 保存?zhèn)溆谩?. pcr：（1）取0.5ml pcr管，依次加入下列試劑：第一鏈 cdna 2 n 1上游引物（10pm） 2u

13、1下游引物（10pm） 2u 1dntp（2mm） 4u 110xpcr buffer 5ultaq k（2u/u 1）1 u 1（2）加入適量的ddl!20,使總體積達(dá)50u lo輕輕混勻,離心。（3）設(shè)定pcr程序。在適當(dāng)?shù)臏囟葏?shù)下擴(kuò)增28-32個循環(huán)。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可 靠為準(zhǔn)確，可在pcr擴(kuò)增目的棊因吋，加入一對內(nèi)參（如g3pd）的特界性引物，同吋擴(kuò)增 內(nèi)參dna,作為對照。（4）電泳鑒定：行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。（5）密度掃描、結(jié)果分析：采用凝膠圖像分析系統(tǒng)，対電泳條帶進(jìn)行密度掃描。反轉(zhuǎn)錄pcr -四.注意事項(xiàng)1. 在實(shí)驗(yàn)過程中要防止rna的降解，保持rna的完整性。

14、在總rna的提取過程中，注 意避免mra的斷裂。2. 為了防止非特異性擴(kuò)增，必須設(shè)陰性對照。3. 內(nèi)參的設(shè)定：主要為了用于靶rna的定量。常用的內(nèi)參有g(shù)3pd （甘汕醛-3-磷酸脫 氫酶）、3-actin （3-肌動蛋 等。其目的在于避免rna定最謀差、加樣誤羌以及各pc r反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差。4. pcr不能進(jìn)入平臺期，出現(xiàn)平臺效應(yīng)與所擴(kuò)增的目的基因的長度、序列、二級結(jié)構(gòu) 以及目標(biāo)dna起始的數(shù)最有關(guān)。故對于每一個日標(biāo)序列出現(xiàn)平臺效應(yīng)的循環(huán)數(shù)，均應(yīng)通過單 獨(dú)實(shí)驗(yàn)來確定。5. 防止dna的污染：（1）采用dna酶處理rna樣品。（2）在可能的情況卜，將pcr引

15、物置于基因的不同外顯子，以消除基因和mrna的共 線性。巢式pcr巢式pcr是一種變異的聚合酚鏈反應(yīng)（pcr）,使用兩對（而非一對）pcr引物擴(kuò)增完整的 片段。第一對pcr引物擴(kuò)增片段和普通pcr相似。第二對引物稱為巢式引物（因?yàn)樗麄?在笫一次pcr擴(kuò)增片段的內(nèi)部）結(jié)合在笫一次pcr產(chǎn)物內(nèi)部，使得笫二次pcr擴(kuò)增片段 短于第一次擴(kuò)增。巢式pcr的好處在于，如果第一次擴(kuò)增產(chǎn)生了錯誤片斷，則第二次能在 錯誤片段上進(jìn)行引物配對并擴(kuò)增的概率極低。因此，巢式pcr的擴(kuò)增非常特異。巢式pcr -定義巢式pcr是一種變異的聚合酶鏈反應(yīng)（pcr）,使用兩對（而非一對）pcr引物擴(kuò)增完桀的片 段。笫一對pcr引

16、物擴(kuò)增片段和普通pcr相似。笫二對引物稱為巢式引物（因?yàn)樗麄冊隗室?次pcr擴(kuò)增片段的內(nèi)部）結(jié)合在第一次pcr產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次pcr擴(kuò)增片段短于第一次 擴(kuò)增。巢式pcr的好處在于，如果第一次擴(kuò)增產(chǎn)生了錯謀片斷，則第二次能在錯謀片段上進(jìn) 行引物配對并擴(kuò)增的概率極低。因此，巢式pcr的擴(kuò)增非常特異。巢式pcr -原理dna的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈dna在多種醜的作用下可以變性解鏈 成單鏈，在dna聚合酶與啟動子的參與卜，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。 在實(shí)驗(yàn)小發(fā)現(xiàn)，dna在高溫時也可以發(fā)住變性解鏈，當(dāng)溫度降低后乂可以復(fù)性成為雙鏈。因 此，通過溫度變化控制dna

17、的變性和復(fù)性，并設(shè)計(jì)引物做啟動了，加入dna聚合酶、dntp 就可以完成特定基因的體外復(fù)制。但是，dna聚合酶在高溫時會失活，因此，每次循環(huán)都 得加入新的dna聚合酶，不僅操作煩瑣，1仏幾價格昂貴，制約了 pcr技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。發(fā) 現(xiàn)耐熱dna聚合同酶一taq酶對于pcr的應(yīng)用冇里程碑的意義，該酶可以耐受90°c以上的高 溫而不失活，不需要每個循環(huán)加酶，使pcr技術(shù)變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，p cr技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用丁臨床。pcr技術(shù)的基本原理類似于dna的天然復(fù)制過 程，其特片性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核齊酸引物。pcr由變性-退火一延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成

18、：模板dna的變性：模板dna經(jīng)加熱至9 3°c左右一定時間后，使模板dna雙鏈或經(jīng)pcr擴(kuò)增形成的雙鏈dm解離，使之成為單鏈， 以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板dna與引物的退火（復(fù)性）：模板dna經(jīng)加熱 變性成單鏈后，溫度降至55°c左右，弓i物與模板dna單鏈的互補(bǔ)序列配対結(jié)合；引物的 延伸：dna模板一引物結(jié)合物在taqdna聚合酶的作用下，以d"tp為反應(yīng)原料，靶序列為模 板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板dna鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù) 循環(huán)變性一退火一延仲三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而f這種新鏈乂可成為 下次循環(huán)的模

19、板。每完成一個循環(huán)需24分鐘，23小時就能將待擴(kuò)冃的棊因擴(kuò)增放大 兒百萬倍。巢式pcr -反應(yīng)巢式pcr通過兩輪pcr反應(yīng)，使用兩套引物擴(kuò)增特界性的da片斷。笫二對引物的功能是特 界性的擴(kuò)增位于首輪pcr產(chǎn)物內(nèi)的一段dna片斷。第一輪擴(kuò)增中，外引物用以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn) 物，此產(chǎn)物在內(nèi)引物的存在下進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。從而提高反應(yīng)的特異性。巢式pcr -實(shí)驗(yàn)步驟第一步：目標(biāo)的dna模板藍(lán)色的第一對引物結(jié)合。第一對引物也可能結(jié)合到其他具有相似結(jié) 合位點(diǎn)的片段上并擴(kuò)增多種產(chǎn)物。但只有一種產(chǎn)物是1=1的片斷（圖屮未顯示可能的多種產(chǎn) 物）。第二步：使用圖屮紅色標(biāo)記的第二套引物對第一輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行第二輪pcr

20、擴(kuò)增。由 于第二套引物位于第一倫pcr產(chǎn)物內(nèi)部，而非目的片斷包含兩套引物結(jié)合位點(diǎn)的可能性極 小，因此笫二套引物不町能擴(kuò)增非冃的片斷。這種巢式pcr擴(kuò)增確保第二輪pcr產(chǎn)物幾乎或 者完全沒有引物配對特界性不強(qiáng)造成的非特杲性擴(kuò)增的污染。巢式pcr -應(yīng)用一般應(yīng)用于動物方面。如病毒,梅毒螺旋體，hiv,腫瘤基因等。在race(rapid-amplifi cation of cdna ends)中,也利用巢式pcr增加特異性。巢式pcr,可以在10的六次方基因組背杲下檢測到一個拷貝的病毒基因，也不像二次pcr 容易產(chǎn)生成片的產(chǎn)物，是效果最好的pcr,但也因此是最容易污染的pcro (1巢式pcr -巢

21、式pcr相對普通pcr的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)1、克服了單次擴(kuò)增“平臺期效應(yīng)”的限制，使擴(kuò)增倍數(shù)提高，從而極大的提高了 pcr的敏 感性；2、由于模板和引物的改變，降低了非特異性反應(yīng)連續(xù)放人進(jìn)行的可能性，保證了反應(yīng)的特 異性；3、內(nèi)側(cè)引物擴(kuò)增的模板是外側(cè)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物，第二階段反應(yīng)能否進(jìn)行，也是對笫一階段 反應(yīng)正確性的鑒定，因引可以保證整個反應(yīng)的準(zhǔn)確性及町行性。進(jìn)行第二次pcr墳增引起交義污染的兒率大。為了克服此缺點(diǎn)，可彩用同一反應(yīng)管中巢式p cr,主要利用內(nèi)外引物tm值不同。如果你己排除引物，酶，rna提取，逆轉(zhuǎn)錄籌等其他原因引起的pcr不成功，確定關(guān)鍵原因 是模板最低的話，可以用巢式。但還是建議先排除

22、一下其他可能因素，畢竟普通pcr簡單。熒光定量pcr熒光定量pcr -概述熒光定量 pcr 是(realtime fluores-cence quantitative pcr, rtfq pcr)是 1996 年由美國applied biosystems公司推出的種新定量試驗(yàn)技術(shù)，它是通過熒光染料或熒光 標(biāo)記的特異性的探針，對pcr產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件 可以對產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測樣品模板的初始濃度。熒光定量pcr -原理pcr擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核昔酸， 兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時，

23、報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信 號被淬滅基團(tuán)吸收；剛開始時，探針結(jié)合在dna任意一條單鏈上;pcr擴(kuò)增吋，taq酶的5, 端一3,端外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān) 測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條dna鏈，就有一個熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號 的累積與pcr產(chǎn)物形成完全同步。熒光量化pcr原理熒光定量pcr -應(yīng)用領(lǐng)域tl988型實(shí)吋熒光定量pcr儀應(yīng)用領(lǐng)域ib臨床疾病診斷：各型肝炎、艾滋炳、禽流感、結(jié)核、性病等傳染病診斷和療效評價；地中海 貧血、血友病、性別發(fā)育界常、智力低下綜合癥、胎兒畸形等優(yōu)牛優(yōu)育檢測；腫瘤標(biāo)志物及 瘤基因檢測實(shí)現(xiàn)腫瘤病診斷；遺傳基因檢測

24、實(shí)現(xiàn)遺傳病診斷。動物疾病檢測：禽流感、新城疫、口蹄疫、豬瘟、沙門菌、大腸埃希菌、胸膜肺炎放線 桿菌、寄生蟲病等、炭疽芽砲桿菌。食晶安全：食源微牛物、食站過敏源、轉(zhuǎn)基因、乳品企業(yè)阪崎腸桿菌等檢測。科學(xué)研究：醫(yī)學(xué)、農(nóng)牧、生物相關(guān)分了生物學(xué)定量研究。應(yīng)用行業(yè)：各級各類醫(yī)療機(jī)構(gòu)、大學(xué)及研究所、cdc、檢驗(yàn)檢疫局、獸醫(yī)站、食品企業(yè) 及乳晶多重pcr多重pcr所屬現(xiàn)代詞，指的是-般pcr僅應(yīng)用-對引物，通過pcr擴(kuò)增產(chǎn)生一個核酸片 段，主要用于單一致病因子等的鑒定。多重pcr簡介 一-般pcr僅應(yīng)用一對引物，通過pcr擴(kuò)增產(chǎn)生一個核酸片段，主要用于單一致病因子等的 鑒定.多重pcr(multiplex p

25、cr), 乂稱多重引物pcr或復(fù)合pcr,它是在同一 pcr反應(yīng)體 系里加上二對以上引物，同時擴(kuò)增出多個核酸片段的pcr反應(yīng)，其反應(yīng)原理，反應(yīng)試劑和 操作過程與一般pcr相同.多重pcr的主耍用丁多種病原微生物的同吋檢測或鑒定和病原微牛物，某些遺傳病及癌:基 因的分型鑒定。多種病原微牛物的同時檢測或鑒定，是在同一 pcr反應(yīng)管屮同時加上多種 病原微生物的特異性引物，進(jìn)行pcr擴(kuò)增可用于同時檢測多種病原體或鑒定出是那一型病 原休感染，tij系統(tǒng)組合的有:肝炎病毒的感染，在同一病人或同一供血者體內(nèi)，有時存在 多種肝炎病毒重疊感染，有吋是甲乙內(nèi)型肝炎病毒重疊;有時可能是甲乙型肝炎病毒重疊;有 時是乙丙型肝炎病毒重疊.腸道致病性細(xì)菌的檢測，如傷寒，痢疾和霍亂，有時具有較相 同的腸道癥狀，有時痢疾霍亂同存一病人并同時發(fā)病.性病的檢測，如梅毒，淋病及艾滋 病的診斷戰(zhàn)傷細(xì)菌及生物戰(zhàn)劑細(xì)菌的檢測，如破傷風(fēng)桿菌，產(chǎn)氣莢膜桿菌，炭疽桿菌，