實驗一 光學顯微鏡的使用與微生物觀察

1、實驗一 光學顯微鏡的使用與微生物觀察第一節(jié) 普通光學顯微鏡的使用一、 實驗目的1、 了解普通光學顯微鏡的基本構(gòu)造和工作原理。2、 學習并掌握普通光學顯微鏡，重點是油鏡的使用技術(shù)和維護知識。3、 在油鏡下觀察微生物的幾種基本形態(tài)。二、基本原理（一）普通光學顯微鏡的構(gòu)造普通光學顯微鏡由機械系統(tǒng)和光學系統(tǒng)兩部分組成（圖1-1）。1、機械系統(tǒng)機械系統(tǒng)包括鏡座、鏡臂、鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、載物臺、調(diào)節(jié)器等。（1）鏡座：它是顯微鏡的基座，可使顯微鏡平穩(wěn)地放置在平臺上。（2）鏡臂：用以支持鏡筒，也是移動顯微鏡時手握的部位。（3）鏡筒：它是連接接目鏡（簡稱目鏡）和接物鏡（簡稱物鏡）的金屬圓筒。鏡筒上端插入目鏡，下

2、端與物鏡轉(zhuǎn)換器相接。鏡筒長度一般固定，通常是160mm。有些顯微鏡的鏡筒長度可以調(diào)節(jié)。（4）物鏡轉(zhuǎn)換器：它是一個用于安裝物鏡的圓盤，位于鏡筒下端，其上裝有35個不同放大倍數(shù)的物鏡。為了使用方便，物鏡一般按由低倍到高倍的順序安裝。轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器可以選用合適的物鏡。轉(zhuǎn)換物鏡時，必須用手旋轉(zhuǎn)圓盤，切勿用手推動物鏡，以免松脫物鏡而招致?lián)p壞。（5）載物臺：載物臺又稱鏡臺，是放置標本的地方，呈方形或圓形。載物臺上裝有壓片夾，可以固定被檢標本；有標本移動器，轉(zhuǎn)動螺旋可以使標本前后和左右移動。有些標本移動器上刻有標尺，可指示標本的位置，便于重復觀察。（6）調(diào)節(jié)器：調(diào)節(jié)器又稱調(diào)焦裝置，由粗調(diào)螺旋和細調(diào)螺旋組成，

3、用于調(diào)節(jié)物鏡與標本間的距離，使物像更清晰。粗調(diào)螺旋轉(zhuǎn)動一圈可使鏡筒升降約10mm，細調(diào)螺旋轉(zhuǎn)動一圈可使鏡筒升降約0.1mm。圖1-1  普通光學顯微鏡的構(gòu)造1. 鏡座  2. 鏡臂   3. 鏡筒    4. 轉(zhuǎn)換器    5. 載物臺   6. 壓片夾 7. 標本移動器   8. 粗調(diào)螺旋   9. 細調(diào)螺旋   10. 目鏡 11. 物鏡  12. 虹彩

4、光闌（光圈） 13. 聚光器   14. 反光鏡2、光學系統(tǒng)光學系統(tǒng)包括目鏡、物鏡、聚光器、反光鏡等。（1）目鏡：它的功能是把物鏡放大的物像再次放大。目鏡一般由兩塊透鏡組成。上面一塊稱接目透鏡，下面一塊稱場鏡。在兩塊透鏡之間或在場鏡下方有一光闌。由于光闌的大小決定著視野的大小，故它又稱為視野光闌。標本成像于光闌限定的范圍之內(nèi)，在光闌上粘一小段細發(fā)可用作指針，指示視野中標本的位置。在進行顯微測量時，目鏡測微尺被安裝在視野光闌上。目鏡上刻有5×、10×、15×、20×等放大倍數(shù)?？砂葱柽x用。（2）物鏡：它的功能是把標本

5、放大，產(chǎn)生物像。物鏡可分為低倍鏡（4或10×）、中倍鏡（20×）、高倍鏡（4060×）和油鏡（100×）。一般油鏡上刻有“OI”（oil immersion）或HI（homogeneous immersion）字樣，有時刻有一圈紅線或黑線，以示區(qū)別。物鏡上通常標有放大倍數(shù)、數(shù)值孔徑（numerical aperture，簡寫為NA）、工作距離（物鏡下端至蓋玻片間的距離，mm）及蓋玻片厚度等參數(shù)（圖1-2）。以油鏡為例，100/1.25分別表示放大倍數(shù)為100倍，NA為1.25；160/0.17分別表示鏡筒長度160mm，蓋玻片厚度等于或小于0.17mm。

6、圖1-2  XSP-I6型顯微鏡物鏡的主要參數(shù)（3）聚光器：聚光器又稱聚光鏡，它的功能是把平行的光線聚焦于標本上，增強照明度。聚光器安裝在鏡臺下，可上下移動。使用低倍物鏡（簡稱低倍鏡）時應降低聚光器，使用油鏡時則應升高聚光器。聚光器上附有虹彩光闌（俗稱光圈），通過調(diào)整光闌孔徑的大小，可以調(diào)節(jié)進入物鏡光線的強弱（物鏡焦距、工作距離與光圈孔徑之間的關(guān)系見圖1-3）。在觀察透明標本時，光圈宜調(diào)得相對小一些，這樣雖會降低分辨力，但可增強反差，便于看清標本。圖1-3  物鏡焦距、工作距離與光圈孔徑之間的關(guān)系（4）反光鏡：它是普通光學顯微鏡的取光設備，其功能是采集光線，并將光線射向聚光

7、器。反光鏡安裝在聚光器下方的鏡座上，可以在水平與垂直兩個方向上任意旋轉(zhuǎn)。反光鏡的一面是凹面鏡，另一面是平面鏡。一般情況下選用平面鏡，光量不足時可換用凹面鏡。（二）普通光學顯微鏡的性能1、數(shù)值孔徑數(shù)值孔徑（NA）又稱開口率，是指介質(zhì)折射率與鏡口角1/2正弦的乘積，可用式1-1表示。               （1-1）式中，n為物鏡與標本之間介質(zhì)的折射率，a為鏡口角（通過標本的光線延伸到物鏡邊緣所形成的夾角（圖1-4）。物鏡的性能與物鏡的數(shù)值孔徑

8、密切相關(guān)，數(shù)值孔徑越大，物鏡的性能越好。因為鏡口角a總是小于180，所以sin的最大值不可能超過1。又因為空氣的折射率為1，所以以空氣為介質(zhì)的數(shù)值孔徑不可能大于1，一般為0.050.95。根據(jù)式1-1，要提高數(shù)值孔徑，一個有效途徑就是提高物鏡與標本之間介質(zhì)的折射率（圖1-5）。使用香柏油（折射率為1.515）浸沒物鏡（即油鏡）理論上可將數(shù)值孔徑提高至1.5左右；實際數(shù)值孔徑值也可達1.21.4。   圖1-4  物鏡的鏡口角            

9、0;      圖1-5 介質(zhì)折射率對光線通路的影響2、分辨率分辨率是指分辨物像細微結(jié)構(gòu)的能力。分辨率常用可分辨出的物像兩點間的最小距離（D）來表征（式1-2）。D值愈小，分辨率愈高。（1-2）          式中，為光波波長。比較式1-1和式1-2可知，D可表示為：               

10、;（1-3）根據(jù)式1-3，在物鏡數(shù)值孔徑不變的條件下，D值的大小與光波波長成正比。要提高物鏡的分辨率，可通過兩條途徑： 采用短波光源。普通光學顯微鏡所用的照明光源為可見光，其波長范圍為400700nm?？s短照明光源的波長可以降低D值，提高物鏡分辨率。加大物鏡數(shù)值孔徑。提高鏡口角a或提高介質(zhì)折射率n，都能提高物鏡分辨率。若用可見光作為光源（平均波長為550 nm），并用數(shù)值孔徑為1.25的油鏡來觀察標本，能分辨出的兩點距離約為0.22m。3、放大率普通光學顯微鏡利用物鏡和目鏡兩組透鏡來放大成像，故又被稱為復式顯微鏡。采用普通光學顯微鏡觀察標本時，標本先被物鏡第一次放大，再被目鏡第二次放大（圖1-

11、6）。所謂放大率是指放大物像與原物體的大小之比。因此，顯微鏡的放大率（V）是物鏡放大倍數(shù)（V1）和目鏡放大倍數(shù)（V2）的乘積，即：V=V1×V2           （1-4）如果物鏡放大40倍，目鏡放大10倍，則顯微鏡的放大率是400倍。常見物鏡（油鏡）的最高放大倍數(shù)為100倍，目鏡的最高放大倍數(shù)為15倍，因此一般顯微鏡的最高放大率是1500倍。圖1-6 普通光學顯微鏡的成像原理4、焦深一般將焦點所處的像面稱為焦平面。在顯微鏡下觀察標本時，焦平面上的物像比較清晰，但除了能看

12、見焦平面上的物像外，還能看見焦平面上面和下面的物像，這兩個面之間的距離稱為焦深。物鏡的焦深與數(shù)值孔徑和放大率成反比，數(shù)值孔徑和放大率越大，焦深越小。因此，在使用油鏡時需要細心調(diào)節(jié)，否則物像極易從視野中滑過而不能找到。三、實驗器材1、 儀器 顯微鏡；2、 材料 ？標本片，香柏油，二甲苯，擦鏡紙。四、實驗程序（一）顯微鏡（油鏡）操作1、領(lǐng)取并檢查顯微鏡：按學號向?qū)嶒炛笇Ю蠋燁I(lǐng)取顯微鏡，所有實驗課均對號使用。從顯微鏡箱中取出顯微鏡時，用右手緊握鏡臂，左手托住鏡座，直立平移（圖1-7），輕輕放置在實驗臺上（圖1-8），檢查各部件是否齊全，鏡頭是否清潔，有問題及時報告老師。  

13、60;      圖1-7 顯微鏡的搬動           圖1-8 顯微鏡的放置光源：良好的照明是保證顯微鏡使用效果的重要條件。將低倍鏡旋轉(zhuǎn)到工作位置，用粗調(diào)螺旋提升鏡筒，使鏡頭距離載物臺10mm左右，降低聚光鏡的位置，完全打開虹彩光闌，一邊看目鏡，一邊調(diào)節(jié)反光鏡鏡面的角度（在正常情況下，一般用平面反光鏡；若自然光線較弱，則可用凹面反光鏡）。然后，調(diào)節(jié)聚光器的位置（酌予升降），直至視野內(nèi)得到均勻適宜的亮度。3、低倍鏡觀察：使用低倍鏡

14、觀察，視野較廣，焦深較大，便于搜尋目標，因此宜從低倍鏡開始觀察。將載玻片標本（涂面朝上）置于載物臺中央（圖1-9），用壓片夾固定（圖1-10），并將標本部位移到正中，轉(zhuǎn)動粗調(diào)螺旋（圖1-11），使鏡頭與標本的距離降到10mm左右。然后，一邊看目鏡內(nèi)的視野，一邊調(diào)節(jié)粗調(diào)螺旋緩慢升高鏡頭，至視野內(nèi)出現(xiàn)物像時，改用細調(diào)螺旋（圖1-12），繼續(xù)調(diào)節(jié)焦距和照明，以獲得清晰的物像，并將所需部位移到視野中央，再換中、高倍鏡觀察（圖1-13）。            圖1-9 將載玻片標本置于載物臺中

15、央     圖1-10 用壓片夾固定載玻片標本                 圖1-11 轉(zhuǎn)動粗調(diào)螺旋      圖1-12 轉(zhuǎn)動細調(diào)螺旋        圖1-13 轉(zhuǎn)換物鏡4、中、高倍鏡觀察：依次用中、高倍鏡觀察低倍鏡下鎖定的部位，并隨著物鏡放大倍數(shù)的增加，逐步提升聚光器增強

16、光線亮度。找出所需目標，將其移至視野中央。5、油鏡觀察：將聚光器提升至最高點，轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)換器，移開高倍鏡，使高倍鏡和油鏡成“八”字形，在標本中央滴一小滴香柏油，把油鏡鏡頭浸入香柏油中，微微轉(zhuǎn)動細調(diào)螺旋，直至看清物像。如果油鏡上升至離開油面還未看清物像，則需重新調(diào)節(jié)。可從側(cè)面注視，小心地轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器將油鏡重新浸在香柏油中，但不能讓油鏡壓在標本上，更不能用力過猛，擊碎玻片，損壞鏡頭。6、調(diào)換標本：觀察新標本片時，必須重新從第3步開始操作。7、用后復原：觀察完畢，轉(zhuǎn)動粗調(diào)螺旋提升鏡筒，取下載玻片，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的香柏油，然后用擦鏡紙蘸取少許二甲苯（香柏油可溶于二甲苯）擦去鏡頭上的殘留油跡，再用干凈

17、的擦鏡紙擦去殘留的二甲苯，最后用細軟的綢布擦去機械部件上的灰塵和冷凝水。降低鏡筒，將物鏡轉(zhuǎn)成“八”字形置于載物臺上。降低聚光器，避免聚光器與物鏡相碰。使反光鏡垂直于鏡座，以防受損。將顯微鏡放回顯微鏡箱中鎖好，并放入指定的顯微鏡柜內(nèi)。第二節(jié) 微生物形態(tài)觀察一、儀器和材料1、 顯微鏡、擦鏡紙、香柏油或液體石蠟、二甲苯。2、 示范片：大腸桿菌（桿狀）、小球菌（球狀）、硫酸鹽還原菌（弧形）、枯草芽孢桿菌、放線菌、顫藻、魚腥藻或念珠藻等。二、試驗內(nèi)容和操作方法1、 嚴格按照光學顯微鏡操作方法，依低倍、高倍和油鏡的次序觀察桿狀、球狀、弧狀和絲狀的細菌示范片，用鉛筆分別繪出各種細菌的形態(tài)圖。2、 同法逐個觀

18、察放線菌的示范片，分別繪出其形態(tài)圖。3、 同法逐個觀察顫藻、魚腥藻或念珠藻的示范片，分別繪出其形態(tài)圖。問題與思考1、使用顯微鏡的油鏡時，為什么必須使用鏡頭油？2、鏡檢標本時，為什么先用低倍鏡觀察，而不直接用高倍鏡或油鏡觀察？實驗二培養(yǎng)基的配制一、實驗目的 1. 學習制備培養(yǎng)基的基本技術(shù)。2. 制備牛肉膏蛋白瓊脂培養(yǎng)基。二、實驗基本原理培養(yǎng)基是將微 生物生長繁殖所需要的各種營養(yǎng)物質(zhì)，用人工方法配制而成的各種營養(yǎng)基質(zhì)。培養(yǎng)基為微生物的生長提供營養(yǎng)物質(zhì)和生存空間。它具有微生物正常生活所需的各種養(yǎng)料和適宜的環(huán)境條件；（1）適當組分和比例的營養(yǎng)物質(zhì)；（2）適宜的pH值；（3）合適的滲透壓；（4）保持無菌

19、狀態(tài)。所以培養(yǎng)基是培養(yǎng)微生物所必需的最主要材料。培養(yǎng)基的配制是微生物學工作者的主要技術(shù)操作之一。培養(yǎng)基的種類：根據(jù)培養(yǎng)基的組成成分，可將培養(yǎng)基分為三類：合成培養(yǎng)基：由各種純化學物質(zhì)按一定比例配制而成。半合成培養(yǎng)基：由一部分純化學物質(zhì)和另一部分天然物質(zhì)配制而成。天然培養(yǎng)基：利用天然來源的有機物配制而成的。從培養(yǎng)基的物理狀態(tài)來分：液體培養(yǎng)基：不加凝固劑的液態(tài)狀培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入2左右的凝固劑的固體狀培養(yǎng)基或固體狀農(nóng)副產(chǎn)品培養(yǎng)基。半固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入0.2-0.5凝固劑而成的半固體狀培養(yǎng)基。微生物最常用的凝固劑為瓊脂（其次為明膠），又叫洋菜、凍粉。它不是一種營養(yǎng)物質(zhì)，

20、只能被極少數(shù)種類的細菌分解利用。瓊脂是從海藻中（主要是石花菜）提取而制成的。是一種多糖類化合物，主要成分是復雜的多糖硫酸酯鈣鹽，瓊脂是一種可逆性膠體，在常規(guī)濃度下加熱到96C以上即成溶膠狀態(tài)，融化的瓊脂，當溫度下降到42以下，又凝固為固體。牛肉膏蛋白培養(yǎng)基是一種應用最廣泛和最普通的細菌培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基中含有一般細菌生長繁殖所需要的最基本的營養(yǎng)物質(zhì)，可供作繁殖之用，制作固體培養(yǎng)基時須加2%瓊脂，培養(yǎng)細菌時，應用稀酸或稀堿將PH調(diào)至中性或微堿性。牛肉膏蛋白培養(yǎng)基的配方：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl0.5%，pH7.47.6。三、材料與儀器1. 試劑 牛肉膏，蛋白胨、NaCl、瓊脂、1mo

21、l/L NaOH、1mol/L HCl。2. 其它： 試管，三角燒瓶，燒杯，量筒，漏斗，乳膠管，彈簧夾，紗布，棉花，牛皮紙，線繩，pH試紙，電爐，臺秤。四、實驗步驟1.稱量 根據(jù)用量按比例依次稱取成分，牛肉膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶化后倒入燒杯，蛋白胨易吸濕，稱量時要迅速。2. 溶解 在燒杯中加入少于所需要的水量，加熱，逐一加入各成分，使其溶解，瓊脂在溶液煮沸后加入，融化過程需不斷攪拌。加熱時應注意火力，勿使培養(yǎng)基燒焦或溢出。溶好后，補足所需水分。3. 調(diào)PH 用1mol/L NaOH或1mol/L HCl把PH調(diào)至所需范圍。4. 過濾 趁熱用濾紙或多層紗布過濾，以利于

22、某些實驗結(jié)果的觀察，如無特殊要求時可省去此步驟。5. 分裝 按實驗要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管內(nèi)或三解瓶內(nèi)分裝時注意，勿使培養(yǎng)基沾染在容器口上，以免沾染棉塞引起污染。1）液體分裝 分裝高度以試管高度的1/4左右為宜，分裝三角瓶的量則根據(jù)需要而定，一般以不超過三角瓶容積的1/2為宜。2）固體分裝 分裝試管，其裝量不超過管高的1/5，滅菌后制成斜面，斜面長度不超過管長的1/2（圖1）。分裝三解瓶，以不超過容積的1/2為宜。3）半固體分裝 裝置以試管高度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝。圖1 滅菌的試管培養(yǎng)基趁熱擺成斜面6. 加棉塞 分裝完畢后，在試管口或三解瓶口塞上棉塞（或泡沫塑料塞及試管帽等，以

23、阻止外界微生物進入培養(yǎng)基而造成污染，并保證有良好的通氣性能。7. 包扎 棉塞頭上包一層牛皮紙，扎緊，即可進行滅菌。8. 保存 滅菌后的培養(yǎng)基放入37養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，以檢驗滅菌的效果，無污染方可使用。問題與思考：1培養(yǎng)基配制時應注意什么問題？為什么？2分裝培養(yǎng)基時為什么要使用彈簧夾？3培養(yǎng)基配好后，為什么要立即滅菌？實驗三 消毒和滅菌一、實驗目的了解干熱滅菌及高壓蒸汽滅菌的操作方法。二、實驗原理滅菌是用物理或化學的方法來殺死或除去物品上或環(huán)境中的所有微生物。消毒是用物理或化學的方法殺死物體上絕大部分微生物(主要是病原微生物和有害微生物)。消毒實際上是部分滅菌。在微生物實驗、生產(chǎn)和科研工作中，

24、需要進行純培養(yǎng) 不能有任何雜菌，因此，對所用器材、培養(yǎng)基要進行嚴格滅菌，對工作場所進行消毒，以保證工作順利進行。滅菌的方法，通?？梢苑譃樗拇箢悾海?）加熱滅菌：包括直接灼燒滅菌、干熱滅菌、加壓蒸汽滅菌、間歇滅菌和煮沸消毒；（2）過濾去菌；（3）射線滅菌和消毒；（4）化學藥劑滅菌和消毒。在本實驗中，介紹與培養(yǎng)基和玻璃器材滅菌有關(guān)的部份滅菌方法。干熱滅菌是利用高溫使微生物細胞內(nèi)的蛋白凝固變性而達到滅菌的目的，細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固性與其本身的含水量有關(guān)，在菌體受熱時，當環(huán)境和細胞內(nèi)含水量越大，則蛋白凝固越快，反之含水量越小凝固越慢。因此與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度高（160170），時間長（12h

25、）。高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放入一個密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過加熱，使滅菌鍋內(nèi)水沸騰產(chǎn)生蒸汽，水蒸汽急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時由于水蒸汽不能溢出而增加了滅菌鍋內(nèi)的壓力，從而使沸點升高，得到高于100的溫度，導致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達到滅菌的目的。一般培養(yǎng)基用0.1MPa、121.1.1530min可達到徹底滅菌,滅菌的溫度及維持的時間隨滅菌物品的性質(zhì)和容量等具體情況而有所改變.三、材料與儀器吸管、培養(yǎng)皿、試管、電熱干燥箱，手提試高壓蒸汽滅鍋，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、蒸餾水。四、實驗步驟（一）干熱滅菌法 適用于空的、干燥的玻璃器皿的滅菌。培養(yǎng)基不適用。1將包

26、好的待滅菌物品（培養(yǎng)皿、試管、吸管等）放入電熱干燥箱（注意留有一定的間隙），關(guān)好箱門。2接通電源，打開排氣孔，使箱內(nèi)濕空氣能逸出，旋動恒溫調(diào)節(jié)器，保持加熱升溫狀態(tài)，至箱內(nèi)達到100時關(guān)閉排氣孔。3當溫度升到160170時，借恒溫調(diào)節(jié)器的自動控制，保持此溫度2h。4切斷電源，冷卻至70時，打開箱門，取出滅菌物品（未降至70度以前，切勿打開箱門，否則溫度驟降導致玻璃器皿炸裂）。（二）高壓蒸汽滅菌1首先將內(nèi)層鍋取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，使水面與三角架相平為宜。2放回內(nèi)層鍋，并裝入待滅菌物品（內(nèi)裝培養(yǎng)基或小的三角瓶），不要裝得太擠，以免妨礙汽流通影響滅菌效果，三角瓶口不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋

27、溫包口的紙而透入棉塞。加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層鍋的排氣槽內(nèi)，再以兩兩對稱的方式同時旋緊相對的兩個棉栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。3用電爐或其他方法加熱，并同時打開排氣閥，使水沸騰以排除鍋內(nèi)的冷空氣，待冷空氣排盡后，關(guān)上排氣閥讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升，當鍋內(nèi)達到所需壓力時，控制熱源，維持壓力至所需時間。4停止加熱，待壓力表的壓力降至零位時，打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。注意：當壓力不為零時，不能開蓋取物否則由于壓力突然下降，容器內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染而發(fā)生污染，甚至灼傷操作者。5高壓滅菌鍋上的安全閥，是保障安全使用的重要機構(gòu)，不得隨意

28、調(diào)節(jié)。問題與思考1干熱滅菌操作過程中應注意哪些問題，為什么？2為什么干熱滅菌所需溫度要比濕熱滅菌高？3高壓蒸汽滅菌時，為什么要排盡鍋內(nèi)的空氣？實驗四、微生物接種技術(shù)一、實驗目的1. 掌握微生物各種接種方法。2. 掌握無菌操作的基本環(huán)節(jié)。二、實驗原理在自然界中，各種微生物是在互為依賴的關(guān)系下共同生活的。因此，為了取出特定的微生物進行純培養(yǎng)，必須把它們分離出來。將一種微生物移到另一種滅菌的培養(yǎng)基上稱為接種。在接種、培養(yǎng)過程中，均需嚴格的無菌操作，防止雜菌侵入，所用的器具必須經(jīng)過滅菌，接種工具無論使用前后都要經(jīng)過火焰滅菌，且在無菌室或無菌箱中進行。三、材料與儀器（一）菌種大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡

29、萄球菌、酵母菌、青霉菌（二）緩沖葡萄糖肉湯培養(yǎng)基試管垂直；緩沖葡萄糖肉湯半固體培養(yǎng)基試管垂直；緩沖葡萄糖肉湯固體培養(yǎng)基試管斜面；緩沖葡萄糖肉湯固體培養(yǎng)基平板；察氏培養(yǎng)基試管斜面；察氏培養(yǎng)基平板。（三）接種環(huán)、接種針、接種鉤。鑷子、酒精燈、火柴、酒精棉、試管架、漿糊、標簽紙、恒溫培養(yǎng)箱等。四、實驗步驟1接種前的準備工作（1）檢查接種工具。（2）在欲接種的培養(yǎng)基試管或平板上貼好標簽，標上接咱的菌名、操作者、接種日期等。（3）將培養(yǎng)基、接種工具和其他用品全部放在實驗臺上擺好，進行環(huán)境消毒。2接種方法（1）試管接種方法將菌種試管與待接種的試管培養(yǎng)基依次排列，挾于左手的拇指與食指之間，用右手的中指與食指

30、或食指與小指拔出棉塞并挾出。置試管口于酒精火焰附近；將接種工具垂直插入酒精火焰中燒紅，再橫過火焰三次，然后再放入有菌試管壁內(nèi)，于無菌的培養(yǎng)基表面待其冷卻。用接種工具取少許菌種置于另一支試管中，按一定的接種方式把菌種接種到新的培養(yǎng)基上。取出接種工具，試管口和棉塞進行火焰滅菌。重新塞上棉塞。燒死接種工具上殘留余菌，把試管和接種工具放回原處。（2）試管菌種接到平板培養(yǎng)基的方法左手持平板和試管菌種，右手松動試管試管棉塞，燒接種工具。右手小指與四指取下棉塞，取菌，打開平皿。將菌種接種到平皿上，立即蓋上平皿。酒精燈火焰上燒接種工具滅菌棉塞過火，重新塞上試管。3. 培養(yǎng)1）將接種的細菌培養(yǎng)基放在3237恒溫

31、箱內(nèi)培養(yǎng)24h后觀察。 2）將接種分離后的酵母菌和霉菌放在2528的恒溫箱內(nèi)，酵母菌培養(yǎng)48h，霉菌培養(yǎng)72h后觀察。3）平板培養(yǎng)基置于恒溫箱內(nèi)倒置培養(yǎng)。問題與思考1為什么從事微生物實驗工作的最基本要求是無菌操作？2大腸桿菌接種于葡萄糖肉湯培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)24小時后，會出現(xiàn)什么情況？ 實驗五、細菌的簡單染色和革蘭氏染色一、實驗目的了解革蘭氏染色的原理，學習并掌握革蘭氏染色的方法。、細菌簡單染色法一、實驗原理細菌的涂片和染色是微生物學實驗中的一項基本技術(shù)。細菌的細胞小而透明，在普通光學顯微鏡下不易識別，必須對它們進行染色，使經(jīng)染色后的菌體與背景形成明顯的色差，從而能更清楚地觀察到其形態(tài)和結(jié)構(gòu)。所謂簡

32、單染色法是利用單一染料對細菌進行染色的一種方法。此法操作簡便，可用以觀察微生物的形狀、大小及細胞排列狀態(tài)，是微生物技術(shù)中應用廣泛，操作簡便的染色法。用于生物染色的染料主要有堿性染料、酸性染料和中性染料三大類。堿性染料的離子帶正電荷，能和帶負電荷的物質(zhì)結(jié)合。因細菌蛋白質(zhì)等電點較低，當它生長于中性、堿性或弱酸性的溶液中時常帶負電荷，所以通常采用堿性染料使其著色。例如，美藍(亞甲藍)實際上是氯化亞甲藍鹽(methylene blue chloride，縮寫為M B C)；它可被電離成正、負離子：M B C®methylene blue+ chloride-帶正電荷的染料離子可使細菌細胞染成

33、藍色。常用的堿性染料除美藍外，還有結(jié)晶紫(crystal violet)、堿性復紅(basic fuchsin)、番紅(又稱沙黃，safranine)等。酸性染料的離子帶負電荷，能與帶正電荷的物質(zhì)結(jié)合。當細菌分解糖類產(chǎn)酸使培養(yǎng)基pH下降時，細菌所帶正電荷增加，因此易被伊紅、酸性復紅或剛果紅等酸性染料著色。中性染料是前兩者的結(jié)合物又稱復合染料，如伊紅美藍、伊紅天青等。染色前必須先固定細菌，其目的有二：一是殺死細菌，使細胞質(zhì)凝固，菌體粘附于玻片上；二是增加其對染料的親和力。常用的有加熱和化學固定兩種方法。固定時應盡量維持細胞原有形態(tài)，防止細胞膨脹或收縮。二、實驗器材1、  菌種 巨大芽孢

34、桿菌(Bacillus megaterium)或蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)；2、  儀器 顯微鏡；3、  材料 接種環(huán)，酒精燈，火柴，載玻片，洗瓶，廢液缸，擦鏡紙，吸水紙；4、  染料 草酸銨結(jié)晶紫或石碳酸復紅。三、操作步驟1、涂片 在潔凈無油膩的玻片中央放一小滴蒸餾水，用灼燒滅菌冷卻后的接種環(huán)挑取少量菌體與水滴充分混勻，涂成極薄的菌膜。2、干燥 將涂片于空氣中自然晾干，或?qū)⑼科糜诨鹧娓咛幬岷娓?，但不能直接在火焰上烘烤，以免菌體變形。 3、固定 手執(zhí)玻片一端，有菌膜的一面朝上，通過迅速通過火焰2-3次(用手指觸涂片反面，以不燙手為宜)。待玻

35、片冷卻后，再加染料； 4、染色 玻片置于玻片擱架上，加適量(以蓋滿菌膜為度)結(jié)晶紫染色液(或石炭酸復紅液)于菌膜部位，染l-2min。 5、水洗 傾去染色液，用洗瓶中的自來水自玻片一端輕輕沖洗，至流下的水中無染色液的顏色時為止。 6、干燥 自然干燥或用吸水紙 蓋在涂片部位以吸去水分(注意勿擦去菌體)。 7、鏡檢 用油鏡觀察并繪出細菌形態(tài)圖。 8、清理 實驗完畢，擦凈顯微鏡。有菌的玻片置消毒缸中，清洗、晾干后備用。四、注意事項 1、玻片要潔凈無油，否則菌液涂不開。 2、挑菌量宜少，涂片宜薄，過厚則不易觀察。、革蘭氏染色法 一、實驗原理 革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學家CGram所

36、創(chuàng)立的。革蘭氏染色法可將所有的細菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌(G+)和革蘭氏陰性菌(G-)兩大類，是細菌學上最常用的鑒別性染色法。 革蘭氏染色法的主要步驟是先用結(jié)晶紫進行初染；再加媒染劑-碘液，以增加染料與細胞間的親和力，使結(jié)晶紫和碘在細胞膜上形成分子量較大的復合物；然后用脫色劑(乙醇或丙酮)脫色；最后用蕃紅復染。凡細菌不被脫色而保留初染劑的顏色(紫色)者為革蘭氏陽性菌，如被脫色后又染上復染劑的顏色(紅色)者為革蘭氏陰性菌。該染色法所以能將細菌分為G+菌和G-菌，是由這兩類菌的細胞壁結(jié)構(gòu)和成分的不同所決定的。G-菌的細胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì)，而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，故用乙醇或丙酮脫色時

37、溶解了類脂質(zhì)，增加了細胞壁的通透性，使結(jié)晶紫和碘的復合物易于滲出，結(jié)果細菌就被脫色，再經(jīng)蕃紅復染后就成紅色。G+菌細胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細菌仍保留初染時的顏色。二、實驗器材1、菌種 牛肉膏瓊脂斜面28培養(yǎng)24h的大腸桿菌(Escherichia coli)斜面菌種，牛肉膏瓊脂斜面28培養(yǎng)16h的枯草桿菌(Bacillus subtilis)斜面菌種；2、儀器 顯微鏡； 3、材料 載玻片，香柏油，二甲苯，擦鏡紙，吸水紙，染色缸等。4、染料 草酸銨結(jié)晶紫染色液，路哥氏(Lugol)碘液，95%乙醇，0.5%番紅染色液；三

38、、操作步驟1、  涂片 在一張載玻片上加兩滴蒸餾水后，分別涂布枯草芽孢桿菌和大腸桿菌(注意涂片切不可過于濃厚)。2、  固定 將制成的涂片干燥固定，固定時通過火焰1-2次即可，不可過熱，以載玻片不燙手為宜。3、 染色初染 將玻片置于玻片擱架上，加草酸銨結(jié)晶紫染色液(加量以蓋滿菌膜為度)，染色1-2min。傾去染色液，用自來水小心地沖洗。 媒染 滴加(Lugol)碘液，染1-2min，水洗。 脫色 滴加95%乙醇，脫色20-25s立即水洗，以終止脫色。 復染 滴加蕃紅，染色2-3min，水洗。最后用吸水紙輕輕吸干。 4、 鏡檢 干燥后，置油鏡觀察。被染成紫色者即為革蘭氏陽性菌

39、(G+)；被染成紅色者是革蘭氏陰性菌(G-)。四、注意事項1、革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是脫色時間。如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而被誤認為是革蘭氏陰性菌；如脫色時間過短，革蘭氏陰性菌也會被認為是革蘭氏陽性菌。脫色時間的長短還受涂片厚薄、脫色時玻片晃動的快慢及乙醇用量多少等因素的影響，難以嚴格規(guī)定。一般可用已知革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌作練習，以掌握脫色時間。當要確證一個未知菌的革蘭氏反應時，應同時做一張已知革蘭氏陽性菌和陰性菌的混合涂片，以資對照。2、染色過程中勿使染色液干涸。用水沖洗后，應吸去玻片上的殘水，以免染色液被稀釋而影響染色效果。3、選用培養(yǎng)16-24h菌齡的細菌為宜。若菌齡太老，由

40、于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應。問題與思考（1）作革蘭氏染色涂片為什么不能過于濃厚？其染色成敗的關(guān)鍵一步是什么？（2）當你對一株未知菌進行革蘭氏染色時，怎樣能確證你的染色技術(shù)操作正確，結(jié)果可靠？實驗六、藻類的培養(yǎng)、觀察、計數(shù)一、實驗目的：1、通過實驗了解藻類生長的基本條件和方法，掌握淡水微藻的基本培養(yǎng)方法；2、顯微鏡下觀察并識別幾種常見淡水微藻；3、了解血球計數(shù)板的計數(shù)原理，掌握血球計數(shù)板的計數(shù)方法。二、實驗材料：斜生柵藻、小球藻、銅綠微囊藻；三、主要實驗儀器和器皿顯微鏡，血球計數(shù)板，計數(shù)器 培養(yǎng)瓶（三角瓶） ，量筒； 四、試劑培養(yǎng)液： BG11 培養(yǎng)液 碘固定液五、培養(yǎng)條件：光

41、照強度：1200Lux、溫度：20-25、光照時間：24h連續(xù)光照六、方法和步驟1、前期準備：各種器皿的消毒、培養(yǎng)液的配制、準備并培養(yǎng) 3 種不 同的淡水微藻：斜生柵藻、小球藻、銅綠微囊藻；2、接種：將不同的實驗藻種分別接種到盛有培養(yǎng)液的不同三角瓶 (100ml)中,接種的藻容量和新培養(yǎng)液之間的比例為 1：21：3。培養(yǎng)量與總?cè)萘康谋刃∮?2/3；3、培養(yǎng) ：按上述培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)的過程中，每天搖瓶 3 次，使藻類充分見接觸氧氣和光照； 4、換代：5-7 天換代 1 次，換代濃度同上； 5、固定：將藻液搖勻，用小三角瓶分別倒取一定量(20-30ml)的上述3種藻液加入幾滴碘液，搖勻殺死

42、細胞； 6、取樣：搖勻后，用吸管吸取上述不同的藻液分別滴到蓋有蓋玻片的血球計數(shù)板的邊緣，使藻液慢慢進入蓋有蓋玻片的區(qū)域，避免蓋玻片浮起，用吸水紙輕輕吸走多余的藻液，每種藻液取樣 2 次； 7、觀察計數(shù)：顯微鏡下觀察不同的藻種并分別計數(shù)。 1）血球計數(shù)板計數(shù)原理 血球計數(shù)板是一塊特制的載玻片，板的中部一“H” 型的凹槽， 橫槽兩邊的平臺上各有一個有九個大方格的方格網(wǎng)。每個大格：邊長 為，深為 0.1mm，容積為 0.1mm3(10-4ml)。中間大方格為計數(shù) 室以計數(shù)室為中心，對角線兩端各有一個有 16 個中格組成的大格。 2）計算藻細胞密度 數(shù)出對角線上的 4 個大方格中的總藻數(shù) A，若藻液的

43、稀釋倍數(shù)為 B，則計算公式如下：細胞密度A÷4×B×104（個ml）（單位：個ml）七、實驗結(jié)果按下表記錄實驗數(shù)據(jù)。 次數(shù)各大格中的藻數(shù)112342八、問題與思考 用此法計數(shù)的結(jié)果是活藻體還是死、活菌體的總和？實驗七 土壤細菌、放線菌、霉菌及纖維素降解菌的分離及提純一、目的要求 通過平板涂布法學習土壤中一般異養(yǎng)性細菌、放線菌、霉菌及纖維素降解菌的分離以及純化方法二、基本原理 微生物分離培養(yǎng)的基本原理是：選用不同成分和酸堿度的培養(yǎng)基，在不同的濕度和不同的通氣條件下進行培養(yǎng)，使只有適合該條件的微生物得以生長。微生物在固體培養(yǎng)基上生長形成的單個菌落可以是由一個細胞繁殖而

44、成的集合體。因此可通過挑取單菌落而獲得一種純培養(yǎng)。由于土壤中菌數(shù)高，常需進行一定量稀釋，使微生物能在培養(yǎng)基上長成單個菌落，以達到分離的目的。本實驗將采用四種不同的培養(yǎng)基從土壤中分離不用的微生物三、器材 1、培養(yǎng)基：牛肉蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基、馬丁培養(yǎng)基、赫奇遜培養(yǎng)基 2、土壤懸液、無菌玻璃棒、無菌吸管、盛有9ml無菌水的試管、無菌試管四、操作步驟 1、選定采土地點后，鏟去表涂層23cm，取310cm深層土壤10g。稱取土樣1g，加入盛有99ml無菌水的錐形瓶中，振蕩10min，使土壤中菌體、芽孢或孢子均勻分散，制成102稀釋度的土壤稀釋液。然后按10倍稀釋法進行稀釋分離，以制備107

45、稀釋度為例，具體操作過程如下：取4.5ml無菌水試管6支，按103107順序編號，放置在試管架上。取移液管一支，準確吸取0.5ml102土壤稀釋液，此為103稀釋度的土壤稀釋液，依次操作，制成104、105、106、107的土壤稀釋液。 2、用無菌吸管分別吸取適宜濃度的土壤稀釋液0.1ml，接種于相應的培養(yǎng)基平板上。每一稀釋度至少有兩個平板重復。接種時每一稀釋度用一支無菌吸管，菌液注入平板后，應立即用無菌涂棒將該菌液均勻地涂布于平板表面，注意勿刮破瓊脂。 通常，細菌采用10-4、10-5、10-6三種稀釋液接種于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)；放線菌采用10-3、10-4、10

46、-5三種稀釋液接種于高氏一號培養(yǎng)基。28°C培養(yǎng)；霉菌則采用10-2、10-3、10-4三種稀釋度接種于馬丁培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)；纖維素降解菌采用10-2、10-3、10-4三種稀釋度接種于赫奇遜培養(yǎng)基，28°C。 3、當單菌落長出時，用接種環(huán)挑菌落接到相應的斜面培養(yǎng)基上，在相應的溫度下培養(yǎng)五、問題與思考 1、你所涂布的平板是否較好的得到了單菌落？ 2、在四種不同的平板上你得到了哪些類群的微生物？簡述它們的菌落特征？實驗八、微生物實驗常用玻璃器皿清洗一、 實驗目的1.熟悉實驗所需各種常用玻璃器皿的名稱和規(guī)格2.掌握玻璃器皿等器材的清洗、包扎技術(shù)二、實驗原理 為確保實驗順利地進行，要求把實驗所用的玻璃器皿清洗干凈。為保持滅菌后和無菌狀