懷菊葉片組織培養(yǎng)技術(shù)的研究

1、論文分類號:淮北煤炭師范學(xué)院2009屆學(xué)士學(xué)位論文懷菊葉片組織培養(yǎng)技術(shù)的研究學(xué)院、專業(yè)生命科學(xué)學(xué)院生物科學(xué)研究方向植物生物技術(shù)學(xué)生姓名土維維學(xué)號 200515415148指導(dǎo)教師姓名薛建平指導(dǎo)教師職稱教授2009年5月26日懷菊葉片組織培養(yǎng)技術(shù)的研究壬維維（淮北煤炭師范學(xué)院生命科學(xué)院）（指導(dǎo)教師：薛建平老師）摘要：目的：研究不同植物生長物質(zhì)2,4d,6ba,naa,iaa和不同的 接種方式對誘導(dǎo)懷菊葉片分化成愈傷組織的彩響，以及研究這四種生 長物質(zhì)對不定芽的分化的影響，最終得出最佳的培養(yǎng)基以及最好的接 種方式。方法：將組培苗接種到組合為ms + 6-ba1.0 mg/l+naao.l mg/l

2、的培養(yǎng)基上快速繁殖擴人培養(yǎng)。將組培苗的葉片剪切后，以不 同的方式接種到附加不同植物生長物質(zhì)的培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)葉片分化為 愈傷組織，通過統(tǒng)計方法的計算選出最佳誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基。再 將上組實驗中得到的愈傷組織接種于新配制的培養(yǎng)基中，通過觀察記 錄篩選出最佳的誘導(dǎo)再分化的培養(yǎng)基。結(jié)論：誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基 組合 ms+2, 4-d 2.0mg/l + 6-ba0.1 mg/l+naa0.2 mg/l,2, 4-d 的作 用比較明顯。最好的接種方式是背接方式，即以葉片的背血接觸培養(yǎng)基。最佳誘導(dǎo)再分化的培養(yǎng)基是ms + 6-ba2.0 mg/l + naao5mg/l。關(guān)鍵詞:懷菊花;葉片；組織培養(yǎng)；

3、愈傷組織；發(fā)芽率tissue culture technology research of bosom chrysanthemumwang wei-wei(school of life science, huaibei coal industry teachers1 college)(tutored by xue jianping)abstract: objective: to study the influence of plant hormone2,4- d,6-ba, naa, iaa and different inoculated ways on inducing the bosom

4、 chrysanthemum leaf blade differentiation to callus, thus selected the most suitable medium, as well as studied the influence of2.4- d,6-ba, naa, iaa on inducing callus differentiation to bud. than selected the most suitable medium. method: the disinfected explants were inoculated onto the ms + 6-ba

5、1.0 mg/l+naao.l mg/l culture medium to propagate more then leaves were cut and cultured onto the same kind of media on different sides and different kinds media on the same side, and induced to form callus. and the preferable medium for the callus was chosen. again the callus which were obtained fro

6、m the former experiment were inoculated onto new medium, through observing and recording to choose the preferable medium for the bud sprouting. result and conclusion: the ms medium with 2, 4-d2.0 mg/l+6-ba0.1 mg/l+naa 0.2 mg/l were much better than others when callus were induced .the main factor wh

7、ich influenced callus differentiation was2.4- d； the preferable medium for bud sprouting was ms + 6-ba2.0 mg / l + naa0.5mg/lkey word: bosom chrysanthemum; leaf; tissue culture; callus; rate of bud differentiation目錄引言11 材料與方法11.1實驗材料11.2實驗方法11.2.1脫毒苗的快繁11.2.2愈傷組織的誘導(dǎo)1123芽的分化11.2.4生根培養(yǎng)與移栽21.2.5參數(shù)及分析21

8、.3培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件22 結(jié)果分析22.1懷菊愈傷組織的分化22芽的分化42.3生根培養(yǎng)與移栽6 3 討論3.1菊葉片類型及接種方式對懷菊組織培養(yǎng)的影響63.2植物生長物質(zhì)對誘導(dǎo)愈傷組織的影響63.3植物生長物質(zhì)對懷菊的芽分化的影響73.4懷菊葉片直接再生植株7參考文獻(xiàn)8圖版9圖版說明：10致謝:11引言懷菊花屈于菊科，產(chǎn)于河南溫縣一帶，是“四大懷藥” z。近年來隨著 藥用懷菊花功效的不斷驗證及其制品的不斷研制開發(fā)，市場對其數(shù)量的要求口益 提高，傳統(tǒng)的打插及分株等繁殖方法和靠111然變異的途徑已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)上 的需要，而且利用這兩種方法使得感染病毒嚴(yán)重，ft前侵襲懷菊的病毒不下十種， 如菊

9、花矮縮類病毒，煙草花葉病毒等，而且隨著種植時間的延長病情逐漸惡化， 許多優(yōu)良品種因此丟失，致使產(chǎn)量下降。所以為解決懷菊的病毒病保留優(yōu)良品種 基因，人們主要采用脫毒苗技術(shù)。王卉等的實驗結(jié)果表明用莖尖和腋芽作為外植 體的擴繁速度快，再生植株變異率高，但是選取花蕾作為外植體，常受季節(jié) 限制，莖尖或腋芽取材雖無季節(jié)的限制卻不易得到變異率較高的植株；而選用葉 片作外植體，既具有取材方便易于操作等優(yōu)點，同時，通過誘導(dǎo)愈傷組織再分化 又可望得到變異率較高的再生植株。但是縱觀前人的研究成果多是以單i大i素水 平來設(shè)計的，無法準(zhǔn)確理解多因素的相互作用。因此木研究設(shè)計了多因素正交試 驗，研究不同因素對懷菊的葉片誘

10、導(dǎo)為愈傷組織及分化成芽的影響，從中篩選出 適宜的培養(yǎng)基，為懷菊的快速繁殖提供理論和技術(shù)的幫助。近年來，以懷菊葉片為外植體脫分化誘導(dǎo)愈傷組織再分化形成植株的技術(shù)為 葉盤法基因工程改造懷菊的品質(zhì)提供了技術(shù)平臺，并為進一步篩選出藥用成分高 和抗逆性強的品種提供了可操作系統(tǒng)。1 材料與方法1.1實驗材料懷菊花脫毒苗，由資源植物生物學(xué)安徽省重點實驗室提供，經(jīng)薛建平教授鑒定為菊科植物藥用懷菊花的脫毒苗。1.2實驗方法1.2.1脫毒苗的快繁取五瓶無菌組織培養(yǎng)苗進行快繁，接到ms + 6-ba1.0 mg/l+naao.l mg/l培養(yǎng)基上，最終獲得十五瓶脫毒苗，放在培養(yǎng)室里，待用。1.2.2愈傷組織的誘導(dǎo)在

11、無菌超凈臺上，把脫毒苗的葉片剪卜然后剪成塊狀，盡量使每塊葉片上都 保留切口，然后分別接種到止交試驗表（見表1）設(shè)計的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織, 每種培養(yǎng)基接6瓶（每組中正接和背接各接三瓶，即正面接觸培養(yǎng)基的和背面接 觸培養(yǎng)基的各三瓶）每瓶接種5塊葉片。十天后觀察愈傷組織生長的狀況，二十 天后統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率。愈傷組織誘導(dǎo)率二分化出愈傷組織的葉片總數(shù)/接種葉片的總數(shù)x1o0%1.2.3芽的分化在無菌超凈臺上，將上述實驗后得到的愈傷組織按照原來的編號接到新配 制的培養(yǎng)基（見表1）中，每瓶接種5塊愈傷組織，一星期后觀察芽的分化情況, 并計算發(fā)芽率。芽的分化率二分化出芽的數(shù)目/接種的愈傷組織的塊數(shù)x 1

12、00%1.2.4生根培養(yǎng)與移栽當(dāng)培養(yǎng)的幼苗長至2. 5至3. 5cm,具2至3片葉時將其切成單株，接到生根 培養(yǎng)基1/2ms+naa0. 5mg/l.h繼續(xù)培養(yǎng)，大概一星期后，有小根出現(xiàn)，二十天后 形成發(fā)達(dá)根系。此時，再把培養(yǎng)瓶拿出培養(yǎng)室，放在室外于常溫問卜煉苗三天， 最后移栽到土壤中，將試管苗培養(yǎng)成植株。1.2.5參數(shù)及分析在測算愈傷組織誘導(dǎo)的影響因素時，采用lo（34）正交表，根據(jù)設(shè)計安排 組織了9次實驗。因子水平安排見表1中培養(yǎng)基按正交法設(shè)計。每組接種六瓶， 背接和止接齊3瓶，每瓶接種5塊葉片。觀察苗的葉片分化為愈傷組織的情況， 統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率。待轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)基后，培養(yǎng)一段時間后統(tǒng)計

13、在統(tǒng)計發(fā)芽率。運用正交設(shè)計助手iiv3.1（專業(yè)版）軟件進行培養(yǎng)基配方設(shè)計。統(tǒng)計分析方法 為極差分析和方差分析。1.3培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件懷菊的快繁培養(yǎng)基：ms + 6-ba 2.0 mg/l + naa 0.5 mg/lo誘導(dǎo)愈 傷組織的培養(yǎng)基：在基木培養(yǎng)基ms+su3%+ag75%上按照表1中三種植物激素的 組合及濃度配比添加，配成9組不同的培養(yǎng)基（見表3）每種培養(yǎng)基接六瓶，每 瓶接5塊葉片，在黑暗條件下誘導(dǎo)。誘導(dǎo)分化出芽的培養(yǎng)基：同上表1中的培養(yǎng) 基，每種培養(yǎng)基接三瓶，每瓶接5塊愈傷組織，培養(yǎng)室的溫度為（25土 1）°c,每 天光照12 h，光照強度為1 5002 000 lx。培

14、養(yǎng)基配制好以后都耍在高壓滅菌 鍋中滅菌15mirio表1 l9 ( 34 )正交設(shè)計表table 1 orthogonal array l9 ( 34 )因素factorabcd2,4-d mg/l6-ba mg/lnaa mg/liaa mg/l水平 1 level 12.02.0().5().5水平 2 level 21.()().50.20.2水平 3 level 300.1002.結(jié)果分析2. 1懷菊愈傷組織的分化在研究中將培養(yǎng)好的幼苗葉片接種于表1所列的9種培養(yǎng)基上，于黑暗條件 下培養(yǎng)10 d左右，發(fā)現(xiàn)接種的葉片上有塊狀的愈傷組織形成，特別是在葉片的切 口處愈傷組織形成明顯。15d統(tǒng)

15、計了愈傷組織的誘導(dǎo)率。從表2中可以得出背面接觸培養(yǎng)基的葉片脫分化形成愈傷組織早于止面接 觸培養(yǎng)基的葉片。且誘導(dǎo)的成功率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正接方式，所以背面接觸培養(yǎng)基的接 種方式是最適合的方式。從表3的極差分析中可以看出，2, 4d是影響懷菊葉片愈傷組織分化的主耍 因素，影響最大，naa次之，6-ba比較小，iaa的影響最小。正交表中均值越 大，則說明代表該因了的某水平越好，從分化率的角度看，極羞分析的結(jié)果可以 得出誘導(dǎo)懷菊愈傷組織分化的較適宜培養(yǎng)基組合為ms+2, 4-d 2.0mg/l + 6-ba0mg/l+ naa0.2 mg/lo正交設(shè)計是一種均一性設(shè)計，不可能含有所有處 理組合，所以a1b3c

16、2d3在實驗中沒有顯示出來。用此種配比的培養(yǎng)基進行了 驗證實驗，結(jié)杲表明，懷菊愈傷組織誘導(dǎo)快，誘導(dǎo)率高，從而證明實驗結(jié)果是止 確的。表2懷菊愈傷組織誘導(dǎo)率及芽分化率table 2differentiating rate of callus and bud of bosom chrysanthemum處理treatment因索factora2,4-dmg/lb6-bamg/lcnaamg/ldiaamg/l愈傷誘導(dǎo)率(正接)(%)愈傷誘導(dǎo)率(背接)(%)芽分化率(背接)(%)12.02.00.50.5093.360.022.00.50.20.2010026.732.00006.753.313.3

17、41.02.00.202073.3106.751.00.500.5026.7100.061.000.50.206.746.7702.000.200133.3800.50.50020166.79000.20.513.346.786.7表3菊愈傷誘導(dǎo)率的極差分析table 3mean deviation of callus of bosom chrysanthemumiiiw-riabcd因索factor2, 4-d mg/l6-ba mg/lnaa mg/liaa mg/l均值1 meanl82. 20055. 53340. 00048. 867均值2 mean235. 56748. 90073

18、. 33345. 567均值3 mean322. 23335. 56726. 66755. 567極差range59. 96719. 96646. 66610. 000表4懷菊愈傷組織誘導(dǎo)率的方差分析table 4variance analysis of induction rate of culls of bosom chrysanthemum因素factor偏差平方和sum ofsquares自由度degree offreedomf比顯著性significancef valuef 臨界(0. 05)f critical valuea5594. 669220. 87519.000b266.

19、66920. 99519. 000c3822.222214. 26219. 000誤差26& 002error注t表示在0. ()5水平上差異顯著note:*means significant difference at p=().()5為了進一步反映各因了z間的茅異，以便尋求最佳水平，我們進行了方差分 析。由極差分析可知，因子方差分析表明(見表4)因子a (2,4-d)對愈傷組織的誘 導(dǎo)作用顯著，因為因子d(iaa)的影響最不顯著，可以設(shè)為空白對照。由此可見，2, 4-d是影響懷菊愈傷組織誘導(dǎo)率大小的主要因素，而且此結(jié)杲與極差分析的結(jié)杲 基本相吻合2.2芽的分化木試驗將上述實驗所獲得

20、的愈傷組織仍接種到新配制的表1所列的9種培養(yǎng) 基上，于光照強度15()0200() lx的條件下培養(yǎng)10 d左右，發(fā)現(xiàn)接種的愈傷組織 上有不定芽分化川來，。20d左右發(fā)現(xiàn)8號培養(yǎng)基中不定芽分化明顯，幼苗長勢 很好。4、5、7號培養(yǎng)基中均有不定芽的分化，但是不定芽的分化較少，莖段細(xì) 長，葉淺綠。2、3號培養(yǎng)基中懷菊芽分化的最少而且長勢比較差，葉發(fā)黃o將 4、5、7號培養(yǎng)基中的苗轉(zhuǎn)接到8號培養(yǎng)基中，苗的長勢恢復(fù)正常，莖段變化明 顯變長，葉墨綠，苗長勢很好（見圖版h）從表5可以看出：因了 a的極差最大，因了 d的極差最小。說明a因了（2, 4-d）的影響最大，根據(jù)各因子均值的大小可以得出誘導(dǎo)懷菊愈傷

21、組織分化出芽 的培養(yǎng)基以a3b1c1d3為最優(yōu)組合，即ms + 6-ba2.0 mg/l + naa0.5mg/l。說 明誘導(dǎo)芽的分化時不需要2, 4-d參與，當(dāng)加入2, 4-d時對芽分化的影響較明顯, 研究結(jié)果也顯示高濃度的2, 4-d也會抑制芽的形成。雖然iaa對誘導(dǎo)芽的分化 作用不明顯，實驗中并不能顯示出高濃度的iaa是否對芽的分化產(chǎn)生影響，還 需要進一步的實驗驗證。如上所述，正交設(shè)計是一種均一性設(shè)計，所以a3b1c1d3在實驗中沒有顯 示出來。用此種配比的培養(yǎng)基進行了驗證實驗，結(jié)果表明，懷菊的不定芽分化快， 苗質(zhì)好，分化率高，從而證明實驗結(jié)果是止確的。表5芽分化的極差分析table 5

22、 mean deviation of bud of bosom chrysanthemum因素factorabcd2, 4-dmg/l6-ba mg/lnaa mg/liaa mg/l均值1 meanl33. 333100. 00091. 13389. 233均值2 mean284.46797. 80073. 3678& 900均值3 mean312& 90048. 90082. 20095. 567極差range95. 56751. 10017. 7666. 667表6懷菊芽分化的方差分析table 6variance analysis of induction rate o

23、f bud of bosom chrysanthemum因素factor偏差平方和sum of squares自由度degree offreedomf比f valuef臨界(0. 05f critical value顯著性significaneea13721.927228. 98119. 000*b5007.260210. 57519. 000c473. 48721.00019. 000誤差error473. 492注t表示在0. 05水平上差異顯著note:*means significant difference at p=0.()5從表6的方差分析表中可以看出a （2, 4-d）的作用顯

24、著，說明2, 4d對 誘導(dǎo)芽分化的影響很大，2, 4-d的加入對芽的分化會起到反作用，抑制芽的分 化。同樣，因為因了 d (iaa)的影響最不顯著，可作為空口對照。2. 3生根培養(yǎng)與移栽待分化培養(yǎng)基上的苗長到4-5 cm時，將健壯的從生苗在無菌條件下分成單 株后，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基l/2ms+naa0.5mg/l+蔗糖3()g/l, 25d后開始生根。 待根長至4-5 cm時先在室內(nèi)煉苗，即將封口膜打開放置3d后再拿岀培養(yǎng)室，仍將 苗放在培養(yǎng)瓶中，置于常溫下煉苗23d,接著再向瓶中加入少量溫水，軟化培 養(yǎng)基后取出試管苗，洗去基部培養(yǎng)基，移栽至土壤中培養(yǎng)。3 討論3.1菊葉片類型及接種方式對懷菊組

25、織培養(yǎng)的影響在試驗中還發(fā)現(xiàn)葉齡對葉片組織培養(yǎng)也是一個重要的因素，葉齡過老，再生 困難；葉齡過小的嫩葉往往培養(yǎng)后易壞死。i大i此應(yīng)選擇植株上部的2-3片幼齡健 壯葉作培養(yǎng)材料，而且不管是止接還是背接的葉片在靠近葉柄的近端再生能力 明顯高于葉頂部。所以在懷菊葉片組織培養(yǎng)的快速繁殖和愈傷組織誘導(dǎo)過程中， 應(yīng)選擇合適的葉片，才能提高實驗的正確率。木研究采用懷菊葉片作為實驗材料，15d以后在接入的葉片切口處有愈傷被 誘導(dǎo)出來，但是在沒有切i i或只有很小的切i i的葉片的周圍就很難發(fā)現(xiàn)愈傷組織 的生成，有時直到葉子干枯而死也沒有愈傷的生成，說明做實驗時，應(yīng)將剪下的 葉片切成小塊，留有更多的切口，這樣能夠

26、快速的誘導(dǎo)出愈傷組織i。在懷菊葉片組織培養(yǎng)中，當(dāng)葉片背接時愈傷的誘導(dǎo)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于止接的方式， 這可能與葉片的極性有關(guān)。當(dāng)葉片背接時，葉片向下反卷生長，葉柄和尖端插入 培養(yǎng)基中，葉片也可以從培養(yǎng)基中吸收水分；而且背面氣孔多，也有助于水分和 養(yǎng)分的吸收。但是當(dāng)葉片止接時，葉片向上反卷生長，葉柄和葉尖不能接觸培養(yǎng) 基，使得葉片無法從培養(yǎng)基中吸收養(yǎng)分，從而造成生長停滯，出現(xiàn)壞死現(xiàn)象愈傷 的誘導(dǎo)率和芽的分化率較低i。所以在做懷菊葉片組織培養(yǎng)時應(yīng)選擇背面接觸培 養(yǎng)基的方式，才能提高效率。3.2植物生長物質(zhì)對誘導(dǎo)愈傷組織的影響植物的組織培養(yǎng)、細(xì)胞分化是一個復(fù)朵的生理生化過程。大量實驗表明， 在組織培養(yǎng)中，植物

27、激素和植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類、濃度以及它們之間的組合 直接影響著愈傷組織的誘導(dǎo)，而口對試驗結(jié)果有相當(dāng)大的影響。從對6-ba、2, 4-d. naa、iaa四種植物生長物質(zhì)對誘導(dǎo)愈傷組織影響的研 究中，初步得出以 ms+2, 4-d 2.0mg/l + 6-ba0.1 mg/l+naa0.2 mg/l 較為適宜。 添加2.0 mg/l的2, 4d較易誘導(dǎo)愈傷組織，并ii 2, 4d的添加可使愈傷組織 的誘導(dǎo)時間減短，效果明顯優(yōu)于6-bao3. 3植物生長物質(zhì)對懷菊的芽分化的影響植物組織或細(xì)胞在離體條件卜，通常需要添加外源生長物素和細(xì)胞分裂素， 來調(diào)節(jié)內(nèi)源激素平衡和代謝，促進器官的形態(tài)建成“譏植物

28、生長物質(zhì)對誘導(dǎo)芽的 分化的影響中，naa和6-ba的影響比較大，其較適合分化培養(yǎng)基組合為ms + 6-ba 2.0 mg/l+ naa0.5 mg/lo木實驗的結(jié)果表明，6-ba質(zhì)量濃度為2.0 mg/l時 誘導(dǎo)芽最佳，而適當(dāng)提高6-ba濃度有利于懷菊側(cè)芽的生成。而高濃度的naa含 量會抑制苗的生長，naa含量達(dá)到2.5mg/l時，會使芽的生長受到影響。但是 沒有naa時就沒有芽的分化現(xiàn)象，所以低濃度的naa適合誘導(dǎo)芽的分化。低濃 度的生長素配合高濃度的細(xì)胞分裂素還是有利于懷菊花苗的生長，而高濃度的生 長素則不利于菊花苗的生長，這與李彬naa對梔了組織培養(yǎng)繁殖效應(yīng)的研究有 相似z處。當(dāng)生長素濃

29、度接近最適時，生長素開始誘導(dǎo)乙烯的形成，隨著生長素 濃度的繼續(xù)增加，植物組織逐漸受到所形成乙烯的抑制說】，所以高濃度的生長素 會影響幼苗的生長。細(xì)胞分裂素類物質(zhì)腺瞟吟與生長素naaz間的比例關(guān)系非常 重要，可以有效地控制植物組織培養(yǎng)時芽及根的發(fā)生，在一定范圍內(nèi)，這一比例 高時有利于芽的分化，即懷菊的葉片可直接再生植株（如圖版c）比例低時有利 于根的分化，這時生長素起主導(dǎo)作用（如圖版e）懷菊脫毒苗的成活率低、育苗周期長、運輸極不便利，從而限制了其在農(nóng)業(yè) 生產(chǎn)上的推廣。近年來，隨著植物生物技術(shù)的發(fā)展，人們先后在試管中誘導(dǎo)出半 夏、試管馬鈴薯等，其中半夏塊莖的培養(yǎng)技術(shù)口趨成熟，完全可以替代試管苗作

30、為商品供應(yīng)。本研究是出于能將懷菊脫毒苗應(yīng)用于生產(chǎn)上，從根本上降低生產(chǎn) 成本。3.4懷菊葉片直接再生植株利用懷菊葉片可直接再生植株（如圖版c）在實驗研究中發(fā)現(xiàn)只有背接時才 有直接誘導(dǎo)成為植株的現(xiàn)象，而正接時沒有發(fā)現(xiàn)直接再生植株苗。此情況與誘導(dǎo) 愈傷組織相似，背面接觸培養(yǎng)基時誘導(dǎo)率高。這可能同樣是與葉片的極性有關(guān)， 背接時有利于對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，因此也有利于直接再生植株。全息胚胎學(xué)的觀點認(rèn)為，生物體由處于不同發(fā)育階段的具有不同特化程度的 全息胚胎組成，對于誘導(dǎo)不定芽的發(fā)生，一定濃度的6-ba是不可缺少的，植物 的枝、葉都是特化的全息胚。從葉中重新誘導(dǎo)芽，也就是全息胚的重演性，重演 性需要全息胚分化

31、促進劑。6-ba可能就是一種全息胚分化促進劑，其效應(yīng)因濃 度而異口0,但是在研究中不能得出最適宜的培養(yǎng)基，所以懷菊的再生體系仍有 待進一步研究。參考文獻(xiàn)1 侯寬昭中國種子植物科屬詞典m北京:科學(xué)出版社,1982, 422-4242 趙長新，廉美蘭，樸炫春梔子組織培養(yǎng)與快速繁殖j.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報，2005, 27(3)： 159-1623 羅春梅，邱璐，楊清輝等小紅參愈傷組織的誘導(dǎo)及分化j華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2006, 25(2)： 182-1854 蔣細(xì)旺，薛建平菊花生物技術(shù)m武漢出版社，2005, 140-1415 .薛建平，于淼，張愛民安徽藥菊葉片愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生技術(shù)的研究j.中國

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