天門冬氨酸生產(chǎn)工藝小總

1、天冬氨酸生產(chǎn)工藝的研究進(jìn)展一、天冬氨酸簡(jiǎn)介天冬氨酸 (aspartic acid)又稱氨基丁二酸，是構(gòu)成機(jī)體蛋白質(zhì)的主要氨基酸之一。結(jié)構(gòu)式為： hoocch2 ch(nh2) cooh，分子量133.10。它有兩種旋光異構(gòu)體： d型和 l 型。通常所說的天冬氨酸是指等量的d型和 l 型的混合物，為無(wú)色單斜棱柱形結(jié)晶，溶于水，微溶于75%(w/w)乙醇，不溶于乙醚，熔點(diǎn)278280； l 型為無(wú)色菱形片狀結(jié)晶， 溶于水， 微溶于醇，熔點(diǎn) 269271；d型溶于水、鹽酸，不溶于乙醇及乙醚，熔點(diǎn)251。二、合成方法2.1 化學(xué)合成法化學(xué)法主要用于生產(chǎn)天冬氨酸的外消旋體dl-天冬氨酸。順丁烯二酸酐和過

2、量氨水與nh4c反應(yīng)，反應(yīng)在一間歇反應(yīng)釜中，于140、0.4mpa下反應(yīng) 2.5h 。將得到的混合物冷卻至70后用鹽酸酸化至ph2.5，再冷卻至室溫，此時(shí)天冬氨酸沉淀析出，將沉淀過濾，4下水洗后得到產(chǎn)品，產(chǎn)率為 55% 。成都有機(jī)化學(xué)研究所的鄧潤(rùn)華等采用微波法合成的收率為61.4%。該方法采用苯亞甲氨基乙酸乙酯為原料，在相轉(zhuǎn)移催化劑（teba ）催化下進(jìn)行鹵化反應(yīng)，經(jīng)水解生成天冬氨酸外消旋體。2002年，浙江大學(xué)的邢亞軍等在一鈦材高壓釜中，對(duì)順丁烯二酸酐) 進(jìn)行氨化反應(yīng)合成了 dl-天冬氨酸。通過實(shí)驗(yàn)研究對(duì)原有合成工藝作出了改進(jìn)，使產(chǎn)品收率提高到 70% 以上，并且對(duì)產(chǎn)品的分離提純采用順丁烯二

3、酸( 馬來(lái)酸 )代替鹽酸進(jìn)行酸化結(jié)晶從而提高了反應(yīng)物的利用和減少反應(yīng)剩余物的污染。2003 年天津大學(xué)的王亞權(quán)等提出了一種簡(jiǎn)便的、不使用任何催化劑的化學(xué)合成法。實(shí)驗(yàn)在聚四氟襯里的250ml 高壓釜中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)步驟如下：將32.5g順丁烯二酸酐 ( 分析純 )溶于 70ml水中， 加入氨水 (分析純 ) 至 ph8 ， 充 1mpa 氮?dú)?，然后在電磁攪拌下加熱?53k，反應(yīng) 6h，反應(yīng)后冷卻至室溫，過濾后得無(wú)色晶體，收率 63.1%，熔點(diǎn) 338。產(chǎn)物的紅外光譜與dl-天冬氨酸的標(biāo)準(zhǔn)譜圖吻合，容量分析表明天冬氨酸含量98% 。2.2 生物酶法生物酶法ic 法（固定化細(xì)胞法或固定化酶法）1973

4、年，chibata i 等將大腸桿菌中提純的天冬氨酸酶，包埋在交聯(lián)聚丙烯酰胺中制成固定化酶， 富馬酸和氨水由固定化天冬氨酸酶催化合成l- 天冬氨酸。1974年，chibata i 等進(jìn)一步將高天門冬氨酸酶活力的大腸桿菌直接用聚丙烯酰胺包埋，制成固定化細(xì)胞。提高了酶的穩(wěn)定性，避免了酶提取的復(fù)雜過程，首次實(shí)現(xiàn)了由富馬酸轉(zhuǎn)化為l-天冬氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)， 轉(zhuǎn)化率達(dá)到 99% ，開創(chuàng)了細(xì)胞固定化應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的先例。1979 年，satot 等對(duì)固定化細(xì)胞的方法進(jìn)行了改進(jìn)，用天然產(chǎn)物- 角叉菜膠代替聚丙烯酰胺包埋大腸桿菌細(xì)胞，并用戊二醛、 戊二醛及環(huán)己二胺處理固定化細(xì)胞，以可溶性天冬氨酸酶為對(duì)照，研究了

5、這三種固定化細(xì)胞中酶的性質(zhì)。三種固定化細(xì)胞的酶促反應(yīng)的最適ph為 9，而可溶性天冬氨酸酶的最適反應(yīng)ph為9.5 。固定化酶的最適溫度比可溶性天冬氨酸酶高510。固定化細(xì)胞的表觀 km值大約為可溶性天門冬氨酸酶的km值的 5 倍。細(xì)胞經(jīng)固定化后， 熱穩(wěn)定性得到提高。固定化細(xì)胞柱在ph8.5 時(shí)比在天冬氨酸酶反應(yīng)最適ph下操作穩(wěn)定性高。1981 年1983 年居乃琥等利用大腸桿菌菌株，制備固定化大腸桿菌細(xì)胞，用于連續(xù)生產(chǎn)天冬氨酸，小試每g 濕細(xì)胞的天冬氨酸的產(chǎn)量最高可達(dá)1007g（30天） 。中試每 g 濕細(xì)胞的天冬氨酸產(chǎn)量為722g（25 天） 。該法所用的戊二醛的濃度和添加量，比一般方法的低。

6、由于戊二醛用量少，交聯(lián)不充分，所以固定化細(xì)胞酶活力的回收率高，成本低，但穩(wěn)定性較差，使用壽命短，所以要適當(dāng)增加戊二醛的用量。1995 年胡永紅，歐陽(yáng)平凱建立了固定化細(xì)胞分離l 一蘋果酸生產(chǎn)中殘留富馬酸并將其轉(zhuǎn)化成l-天門冬氨酸的新方法。對(duì)生成l-天門冬氨酸的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化 , 結(jié)果表明 , 當(dāng) l- 蘋果酸反應(yīng)液ph 調(diào)至 89,l- 天門冬氨酸添加量為6-8g/l, 碳酸銨加量為 15-20g/l,mg2+、 mn2+、 ca2+等二價(jià)陽(yáng)離子加量為1mmol/l 時(shí),固定化細(xì)胞可將 l一蘋果酸反應(yīng)液中殘留的20% 左右的富馬酸幾乎全部轉(zhuǎn)化成l-天門冬氨酸 , 且 l 一蘋果酸含量的損失小于

7、5% 。1996 年張波采用三種不同發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)過不同發(fā)酵時(shí)間取樣測(cè)定酶活(ea)、ph、生物量 (biomass) ，確定選用培養(yǎng)基a；經(jīng)不同底物濃度、不同金屬離子對(duì)固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響的實(shí)驗(yàn)，確定使用較高濃度底物及含mg2+ 的底物為佳，經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)得固定化細(xì)胞的使用壽命為3 個(gè)月，即 3 個(gè)月之內(nèi)能保持轉(zhuǎn)化率在 85% 以上，固定化細(xì)胞的轉(zhuǎn)化時(shí)間為3.5h 。1997年石屹峰等 21 設(shè)計(jì)了用于固定游離細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的反沖式膜反應(yīng)器（圖1） ，利用膜將游離細(xì)胞阻擋于反應(yīng)器內(nèi)，同樣達(dá)到固定化目的而又不損傷細(xì)胞(酶)。菌種采用研究者自己選育的含高活力天冬氨酸酶的escherichia coli

8、 sf-d4,培養(yǎng)基為 1% 反丁烯二酸胺 ,1%玉米漿 ,0.7%蛋白胨,0.1%kh2po4,0.5%(nh4)2so4,0.02%mg2so4。ph 7.2,37 , 搖床培養(yǎng) 24 h。細(xì)胞離心10,000 r/min 、10 min收集, 用生理鹽水洗 2次。選擇 0.22lm微濾膜，最佳細(xì)胞濃度為 35 mg/ml。張今等圍繞天冬氨酸酶的活性部位、末端缺失突變、 蛋白質(zhì)工程菌的固定化等方面進(jìn)行了研究。將突變菌株用瓊脂凝膠包埋法進(jìn)行固定，固定菌量為95% ，表觀酶活力為82000 單位，半衰期184d。實(shí)驗(yàn)表明， 1kg 固定化細(xì)胞，每24h約得 l- 天冬氨酸 30kg，日本三菱石

9、化公司已用黃色短桿菌(brevibacteriumflavum)發(fā)酵法生產(chǎn)l-天門冬氨酸。以往常用的細(xì)菌是大腸桿菌(e.coli),因它的細(xì)胞壁脆弱 , 要循環(huán)使用必須將菌固定化于載體上, 而該公司所用黃色短桿菌有堅(jiān)韌的細(xì)胞壁, 故無(wú)需用昂貴的固定化方法 , 經(jīng)離心分離反復(fù)可供反應(yīng)使用。 所以, 用這種制造方法生產(chǎn)成本下降。fwc 法（游離細(xì)胞法或游離酶法）1996 年，南京化工大學(xué)徐虹等使用發(fā)酵培養(yǎng)基：富馬酸2% ， , 玉米漿4%,kh2po4;0.2%,mgso4,0.025%, 用氨水調(diào)節(jié) ph至 7.27.5 。培養(yǎng)溫度為 37c ，培養(yǎng)時(shí)間為 26h 左右。以大腸桿菌培養(yǎng)液作酶源，

10、 采用游離酶法由富馬酸轉(zhuǎn)氨生成天冬氨酸。取培養(yǎng)26h 左右的培養(yǎng)液， 37酶反應(yīng) 6d，可轉(zhuǎn)化富馬酸 9kg/l 。2000年， 王雪根、徐虹等又實(shí)現(xiàn)了游離整體細(xì)胞法工業(yè)化生產(chǎn)l-天冬氨酸，發(fā)酵培養(yǎng)基 : 富馬酸銨 0.4%,富馬酸鈉2.0%,蛋白胨 0.9%,牛肉膏 0.4%,玉米漿1.4%,kh2po40.05%,mgso4#7h2o 0.05%泡敵 0.01%;ph 7.07.5 。發(fā)酵工藝：在搖床上培養(yǎng) 5-10 l 種子, 接種于 800 l 氣升式發(fā)酵罐。發(fā)酵條件 : 初始 ph 6.5-7.0,風(fēng)量 0.6 vvm,溫度 37, 裝液量 500-550 l 。l-天冬氨酸的生產(chǎn)流

11、程見下圖。游離整體細(xì)胞可以在較短的時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化為較多的富馬酸，且轉(zhuǎn)化較為徹底， 轉(zhuǎn)化率平均在 99以上，有的接近l00 。2003 年北京化工大學(xué)唐芳等利用較為便宜的水解棉籽蛋白代替蛋白胨作為氮源，用葡萄糖部分代替富馬酸作為復(fù)合碳源，培養(yǎng)產(chǎn)天冬氨酸酶的大腸桿菌。結(jié)果表明，改變培養(yǎng)基配比后， 對(duì)菌體的總體酶活力 ( 即對(duì)底物轉(zhuǎn)化能力 ) 影響不大，轉(zhuǎn)化率可達(dá) 99% 以上，通過上罐發(fā)酵初步估算可以節(jié)約培養(yǎng)基碳氮源成本大約 60% 2.3 生物拆分法生物拆分法主要用來(lái)合成d-天冬氨酸利用 l-asp- - 脫羧酶進(jìn)行拆分自然界中含高活性l-asp- - 脫羧酶的微生物較多。該酶能專一催化l-asp

12、脫除位羧基生成 l- 丙氨酸 (l-ala) ，因此可以利用該酶把 dl-asp中的 l-asp 轉(zhuǎn)化成 l-ala ，而獲得 d-asp。利用 l-asp- -脫羧酶進(jìn)行的拆分是目前研究較為成熟的一種方法。2008 年韓銘海等提出了一種利用l- 天冬氨酸 -脫羧酶生物轉(zhuǎn)化拆分dl-天冬氨酸得到 d-天冬氨酸的方法。當(dāng)牛肉膏濃度為0.2%、玉米漿為 1.0%、蛋白胨為 1.0%時(shí)，發(fā)酵液酶活力可以達(dá)到最高。 轉(zhuǎn)化過程最適 ph值為 67，轉(zhuǎn)化過程最適溫度 50， 濃度 6.0%以上的丙氨酸能顯著提高轉(zhuǎn)化過程中酶的熱穩(wěn)定性。利用 d-天冬氨酸和 l- 丙氨酸的等電點(diǎn)的差異來(lái)分離提取d-天冬氨酸的