Chapter8親和純化

1、 第八章第八章 親和色譜親和色譜v生物親和作用生物親和作用（bioaffinity）定義：定義：生物分子能夠生物分子能夠區(qū)分結構和性質非常相近的其他分子，區(qū)分結構和性質非常相近的其他分子，選擇性地與其中某一分子相結合，生物分子間的這種選擇性地與其中某一分子相結合，生物分子間的這種特異性相互作用稱為生物親和作用特異性相互作用稱為生物親和作用或簡稱親和作用?；蚝喎Q親和作用。通過親和作用發(fā)生的結合稱通過親和作用發(fā)生的結合稱特異性結合（特異性結合（specific binding）或親和結合（）或親和結合（affinity binding）。）。 概概 述述v親和純化技術親和純化技術定義：利用生物分子

2、間的定義：利用生物分子間的特異性結合作用（親特異性結合作用（親和作用和作用）的原理進行生物物質分離純化的技術。）的原理進行生物物質分離純化的技術。分類：分類：親和色譜技術親和色譜技術、親和膜分離技術、親和、親和膜分離技術、親和沉淀、親和反膠團、親和電泳等。沉淀、親和反膠團、親和電泳等。第一節(jié)第一節(jié) 生物親和生物親和作用作用一、親和作用的本質一、親和作用的本質v參與親和作用的兩個分子中，其中之一為蛋參與親和作用的兩個分子中，其中之一為蛋白質的情況占絕大多數(shù)，或者兩者均為蛋白白質的情況占絕大多數(shù)，或者兩者均為蛋白質。質。v蛋白質參與親和作用的機理蛋白質參與親和作用的機理一般認為蛋白質的立體結構中存

3、在結合位點，一般認為蛋白質的立體結構中存在結合位點，呈凹陷或凸起結構。呈凹陷或凸起結構。具有親和作用的分子間還需分子或原子水平的具有親和作用的分子間還需分子或原子水平的各種相互作用，主要包括各種相互作用，主要包括靜電作用、氫鍵力、靜電作用、氫鍵力、疏水性相互作用、配位鍵、弱共價鍵疏水性相互作用、配位鍵、弱共價鍵等。等。生物親和作用是一種復雜的生物現(xiàn)象，這也是生物親和作用是一種復雜的生物現(xiàn)象，這也是親和作用特異性高的主要原因。親和作用特異性高的主要原因。v1.1.離子強度離子強度(I(I，氫鍵力，氫鍵力，親和作用，親和作用 ； II，疏水性，疏水性相互作用相互作用，親和作用，親和作用 ）v2.p

4、H2.pH（根據(jù)蛋白質解離基團的根據(jù)蛋白質解離基團的pKapKa值而定值而定, ,如解離基團為羧基，如解離基團為羧基，pHpH應高于其應高于其pKapKa值，帶電量最高，靜電作用力大，值，帶電量最高，靜電作用力大， pHpH嚴重影嚴重影響親和作用，響親和作用，存在最佳存在最佳pHpH，使親和作用最大，使親和作用最大 ）v3.3.抑制氫鍵形成的物質抑制氫鍵形成的物質( (脲和鹽酸胍會抑制氫鍵形成，親和脲和鹽酸胍會抑制氫鍵形成，親和作用作用 ）v4.4.溫度（溫度（T T ,疏水性相互作用疏水性相互作用;靜電作用、氫鍵力、配位靜電作用、氫鍵力、配位鍵作用鍵作用）v5.5.離液液體離液液體（離子半徑

5、大、電荷密度低的陰離子如（離子半徑大、電荷密度低的陰離子如SCN-, I-SCN-, I- ，CLO4-CLO4-等減弱疏水性作用，親和作用等減弱疏水性作用，親和作用 ）v6.6.鰲合劑（鰲合劑（除去金屬離子，影響配位鍵的形成，抑制親和作除去金屬離子，影響配位鍵的形成，抑制親和作用用二、影響親和作用的因素二、影響親和作用的因素三、親和作用體系三、親和作用體系酶酶：底物底物、底物類似物、抑制劑、輔酶、金、底物類似物、抑制劑、輔酶、金屬離子；屬離子；抗體抗體：抗原抗原、病毒、細胞；、病毒、細胞；激素、維生素激素、維生素：受體蛋白、載體蛋白；：受體蛋白、載體蛋白；外源凝集素外源凝集素：多糖、糖蛋白、

6、細胞表面受體：多糖、糖蛋白、細胞表面受體蛋白、細胞；蛋白、細胞；核酸（核酸（ DNADNA和和RNA RNA ）：互補堿基鏈段、組蛋：互補堿基鏈段、組蛋白、核酸聚合酶、核酸結合蛋白；白、核酸聚合酶、核酸結合蛋白；v親和作用體系的特異性親和作用體系的特異性高度特異性體系高度特異性體系：一對一關系，如：一對一關系，如抗原與其單克抗原與其單克隆抗體隆抗體的結合、的結合、酶與底物酶與底物的結合。的結合。群特異性體系群特異性體系：大多數(shù)親和體系大多數(shù)親和體系，親和作用不具，親和作用不具備絕對的特異性，如外源凝集素可與任何含有糖備絕對的特異性，如外源凝集素可與任何含有糖基的蛋白質結合、酶與輔酶或金屬輔基的

7、結合。基的蛋白質結合、酶與輔酶或金屬輔基的結合。結合常數(shù)結合常數(shù) LELEKeqEL EL 其中：其中：E、L和和EL分別表示蛋白、配基和二者形成的復合體。分別表示蛋白、配基和二者形成的復合體。Keq一般為一般為104108dm3/mol，太大，太大(接近不可逆結合）洗脫回收困接近不可逆結合）洗脫回收困難，太小則難于有效吸附目標物質。難，太小則難于有效吸附目標物質。結合常數(shù)越大，表示結合常數(shù)越大，表示親和作用越強親和作用越強在親和純化中，一般將親和作用分子對中被固定的分子稱為在親和純化中，一般將親和作用分子對中被固定的分子稱為親和結合對象（一般為蛋白質）的親和結合對象（一般為蛋白質）的配基配基

8、（ligand) 配基和目標蛋白的可逆性親和結合可表示為配基和目標蛋白的可逆性親和結合可表示為第二節(jié)第二節(jié) 親和色譜原理親和色譜原理一、原理一、原理利用鍵合了利用鍵合了親和配基親和配基的親和吸附介質為固定的親和吸附介質為固定相親和吸附目標產(chǎn)物，相親和吸附目標產(chǎn)物，不同蛋白質分子對固不同蛋白質分子對固定化在載體上的親和配基具有不同的識別和定化在載體上的親和配基具有不同的識別和結合能力結合能力，根據(jù)親和吸附作用力的差異，根據(jù)親和吸附作用力的差異，使使目標產(chǎn)物得到分離純化的液相色譜法。目標產(chǎn)物得到分離純化的液相色譜法。常用的配基有抗體、抗原、常用的配基有抗體、抗原、激素或受體蛋白、酶的底激素或受體蛋

9、白、酶的底物和抑制劑等物和抑制劑等v基本過程：基本過程： 固相化固相化 (ImmobiliseImmobilise)載體載體配基配基吸附吸附 (AdsorptionAdsorption)洗脫洗脫(ElutionElution )二、親和色譜操作二、親和色譜操作vv步驟：步驟：進樣、吸附進樣、吸附：含有目標產(chǎn)物的料液連續(xù)通過：含有目標產(chǎn)物的料液連續(xù)通過親親和色譜柱和色譜柱，直至目標產(chǎn)物在色譜柱出口穿透為，直至目標產(chǎn)物在色譜柱出口穿透為止（與固定床吸附操作相似）止（與固定床吸附操作相似）清洗清洗：用清洗液（與原料溶解液的組成相同的：用清洗液（與原料溶解液的組成相同的緩沖液）除去非特異性結合的雜蛋白

10、緩沖液）除去非特異性結合的雜蛋白 洗脫洗脫：特異結合在配體上的靶蛋白最后可用能：特異結合在配體上的靶蛋白最后可用能使其與配基解離的溶液使其與配基解離的溶液（洗脫液）洗下。（洗脫液）洗下。再生：再生：用清洗液清洗，使色譜柱的用清洗液清洗，使色譜柱的PHPH和離子強和離子強度適合于親和吸附度適合于親和吸附洗脫液：含配洗脫液：含配體溶液體溶液收集目的蛋白收集目的蛋白 洗下未結合的蛋白洗下未結合的蛋白進樣、吸附進樣、吸附清洗液清洗液帶有配體的樹脂帶有配體的樹脂珠（或膠粒）珠（或膠粒）吸附吸附清洗清洗洗脫洗脫時間時間v注意事項注意事項1.1.）當兩種以上蛋白質同時被吸附時，可采用線性）當兩種以上蛋白質同

11、時被吸附時，可采用線性梯度洗脫或逐次洗脫法分離梯度洗脫或逐次洗脫法分離2 2）為提高分離度，應采取較小的進料量（遠低于）為提高分離度，應采取較小的進料量（遠低于發(fā)生穿透所需的進料量）發(fā)生穿透所需的進料量）第三節(jié)親和色譜介質第三節(jié)親和色譜介質v制備親和色譜介質的意義制備親和色譜介質的意義：親和吸附作用只有在特定配基的存在下才能實親和吸附作用只有在特定配基的存在下才能實現(xiàn)，多現(xiàn)，多數(shù)情況下需根據(jù)目標產(chǎn)物選擇合適的親和數(shù)情況下需根據(jù)目標產(chǎn)物選擇合適的親和配基修飾固定相粒子，制備所需的親和吸附介質配基修飾固定相粒子，制備所需的親和吸附介質。進行外源凝集素的親和純化時，無需自制親和吸進行外源凝集素的親和

12、純化時，無需自制親和吸附介質?？芍苯舆x用商品化凝膠介質（含有糖基附介質?？芍苯舆x用商品化凝膠介質（含有糖基介質）。介質）。v載體的選擇載體的選擇v配基的選擇配基的選擇親和吸附劑及其制備方法親和吸附劑及其制備方法（p322）載體應具備的特征載體應具備的特征：具有親水性多孔結構，無非特異性吸附，比表面積大；具有親水性多孔結構，無非特異性吸附，比表面積大；物理和化學穩(wěn)定性高，有較高的機械強度，使用壽命長；物理和化學穩(wěn)定性高，有較高的機械強度，使用壽命長；含有可活化的反應基團，用于親和配基的固定化；含有可活化的反應基團，用于親和配基的固定化；粒徑均一的球形粒子粒徑均一的球形粒子。v載體的選擇載體的選擇

13、可供選擇的載體可供選擇的載體v瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠v聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠v葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠親水性凝膠過濾介質均親水性凝膠過濾介質均可作為親和配基的載體可作為親和配基的載體 配基應具備的特性：配基應具備的特性： 1.1.對于欲純化的生物物質應具有專一親和性對于欲純化的生物物質應具有專一親和性 2.2.必須具備能被修飾的功能基團必須具備能被修飾的功能基團v配基的選擇配基的選擇配基可以是小分子物質：一些輔酶、輔基配基可以是小分子物質：一些輔酶、輔基 大分子物質：酶、抗體大分子物質：酶、抗體v純化酶的配基純化酶的配基: :底物、抑制劑、輔酶、輔基底物、抑制劑、輔酶、輔基等；等；v純化抗原抗

14、體的配基：互為配基純化抗原抗體的配基：互為配基v純化核酸的配基：純化核酸的配基：DNADNA和和RNARNA，蛋白質和，蛋白質和mRNAmRNA固相化技術：將配基以共價鍵連接于不溶于固相化技術：將配基以共價鍵連接于不溶于 水的固相基質上制成固相化吸附劑水的固相基質上制成固相化吸附劑 過程：載體活化過程：載體活化、接臂接臂 CNBrCNBr活化法活化法 環(huán)氧基活化法環(huán)氧基活化法 硅膠的活化硅膠的活化 接臂：在配基與載體之間連接一個接臂：在配基與載體之間連接一個“間隔臂間隔臂”，以增大小分，以增大小分子配基與在載體之間的距離子配基與在載體之間的距離, ,克服克服載體載體空間位阻空間位阻的影響，使的

15、影響，使配基與生物大分子有效親和結合配基與生物大分子有效親和結合v配基的固相化（親和吸附介質）配基的固相化（親和吸附介質）第四節(jié)親和吸附平衡第四節(jié)親和吸附平衡（略）（略）第五節(jié)親和色譜過程分析第五節(jié)親和色譜過程分析v親和色譜操作過程親和色譜操作過程上樣吸附上樣吸附清洗（洗滌）清洗（洗滌）洗脫洗脫再生再生1 1、進料吸附、進料吸附（p329)p329)親和色譜操作中可能存在的兩種吸附：親和色譜操作中可能存在的兩種吸附：v親和吸附親和吸附：親和配基與目標分子間的特異性結合：親和配基與目標分子間的特異性結合（選擇性高）（選擇性高）v非特異性吸附非特異性吸附：料液中各種溶質（包括目標產(chǎn)物）：料液中各種

16、溶質（包括目標產(chǎn)物）與固定相介質和配基分子中的某些部位的疏水性和與固定相介質和配基分子中的某些部位的疏水性和靜電相互作用（選擇性低）靜電相互作用（選擇性低）v基本要求：基本要求：1 1）親和吸附介質對目標產(chǎn)物有較高的親和吸附作用）親和吸附介質對目標產(chǎn)物有較高的親和吸附作用和吸附容量和吸附容量2 2）雜質的非特異性吸附需控制在最低水平）雜質的非特異性吸附需控制在最低水平緩沖液的離子強度要適當（緩沖液的離子強度要適當（0.1-0.5mol/l)0.1-0.5mol/l)緩沖液的緩沖液的pHpH應使配基和目標產(chǎn)物與雜質的靜電作用應使配基和目標產(chǎn)物與雜質的靜電作用較小較小加入表面活性劑減少雜質以及目標

17、產(chǎn)物的非特異性加入表面活性劑減少雜質以及目標產(chǎn)物的非特異性疏水性吸附疏水性吸附注意事項（注意事項（p330)v樣品液的濃度不宜過高樣品液的濃度不宜過高v上樣時流速比較慢上樣時流速比較慢v樣品緩沖液中有一定的的離子強度樣品緩沖液中有一定的的離子強度v上樣時選擇適當較低的溫度上樣時選擇適當較低的溫度 2.2.清洗清洗v目的：目的：洗去色譜柱空隙和吸附劑內部存在的雜質洗去色譜柱空隙和吸附劑內部存在的雜質v清洗液：清洗液：采用采用與吸附操作相同的緩沖液與吸附操作相同的緩沖液（PH和離子和離子強度相同），必要時加入表面活性劑強度相同），必要時加入表面活性劑v清洗操作時間：清洗操作時間：根據(jù)色譜流出液的組

18、成變化情況而根據(jù)色譜流出液的組成變化情況而定，避免定，避免過度清洗過度清洗（回收率降低）或（回收率降低）或清洗不充分清洗不充分（純度降低）純度降低）3 3、洗脫、洗脫v特異性洗脫特異性洗脫利用含有與親和配基或目標產(chǎn)物具有親和作用利用含有與親和配基或目標產(chǎn)物具有親和作用的小分子化合物溶液為洗脫劑，通過的小分子化合物溶液為洗脫劑，通過與親和配與親和配基或目標產(chǎn)物的競爭性結合基或目標產(chǎn)物的競爭性結合，脫附目標產(chǎn)物。，脫附目標產(chǎn)物。v非特異性洗脫非特異性洗脫通過調節(jié)洗脫液的通過調節(jié)洗脫液的pHpH值、離子強度、離子種類值、離子強度、離子種類或溫度等理化性質降低目標產(chǎn)物的親和作用，或溫度等理化性質降低目

19、標產(chǎn)物的親和作用，使之脫附，較多采用使之脫附，較多采用特異性洗脫特異性洗脫v v優(yōu)點：優(yōu)點： 特異性強，可以進一步消除非特異性吸附的影響，特異性強，可以進一步消除非特異性吸附的影響，從而得到較高的分辨率。從而得到較高的分辨率。 洗脫條件溫和，可避免目標產(chǎn)物失活洗脫條件溫和，可避免目標產(chǎn)物失活v缺點：缺點：洗脫時間較長洗脫時間較長v改善方法：改善方法： 選擇親和力強的物質洗脫、加大洗脫液濃度選擇親和力強的物質洗脫、加大洗脫液濃度 特異性洗脫特異性洗脫非特異性洗脫非特異性洗脫v 與配體親和力較小時與配體親和力較小時 連續(xù)連續(xù)大體積平衡緩沖液沖洗大體積平衡緩沖液沖洗，不影響活性，但洗脫體積較，不影響

20、活性，但洗脫體積較大，待分離物質濃度較低。大，待分離物質濃度較低。v 配體結合較強時配體結合較強時 適當?shù)倪m當?shù)膒HpH、離子強度洗脫、離子強度洗脫，注意盡量不影響待分離物質的活，注意盡量不影響待分離物質的活性性v 與配體結合非常牢固時與配體結合非常牢固時 使用較強的使用較強的酸、堿酸、堿或在洗脫液中加入或在洗脫液中加入脲、胍等變性劑脲、胍等變性劑，使，使蛋白質等待分離物質變性，洗脫后再復性（需慎用）蛋白質等待分離物質變性，洗脫后再復性（需慎用） 逐次降低洗脫液逐次降低洗脫液PHPH的非特異性洗脫的非特異性洗脫3 3、吸附劑的再生和保存、吸附劑的再生和保存 v再生再生 用大量清洗液洗滌用大量清

21、洗液洗滌 嚴重的不可逆吸附時，使用嚴重的不可逆吸附時，使用高濃度的鹽溶液、尿高濃度的鹽溶液、尿素等變性劑素等變性劑或加入適當?shù)幕蚣尤脒m當?shù)姆菍Ｒ恍缘鞍酌阜菍Ｒ恍缘鞍酌竩保存保存 加入加入0.01%0.01%的疊氮化鈉，的疊氮化鈉，4 4C C 下保存下保存 親和色譜的特點親和色譜的特點v優(yōu)點：優(yōu)點：純化過程簡單、迅速；純化過程簡單、迅速；分離效率最高。分離效率最高。條件溫和（適用于含量極少又不穩(wěn)定的活性物質）。條件溫和（適用于含量極少又不穩(wěn)定的活性物質）。v缺點：缺點：必須針對某一分離對象，制備專一的配基和尋求層必須針對某一分離對象，制備專一的配基和尋求層析的穩(wěn)定條件析的穩(wěn)定條件，親和吸附劑價

22、格昂貴，親和吸附劑價格昂貴，其應用范圍，其應用范圍受到限制。受到限制。是一種高度分離純化是一種高度分離純化蛋白的方法，蛋白的方法，有時只用親和色譜即可使純度提有時只用親和色譜即可使純度提高高1000至至10000倍。）倍。）三、應用三、應用1.1.酶、酶抑制劑、抗體和干擾素等的分離和精制酶、酶抑制劑、抗體和干擾素等的分離和精制（組織纖溶酶原激活劑，干擾素，脫氫酶，淀粉酶（組織纖溶酶原激活劑，干擾素，脫氫酶，淀粉酶抑制劑，基因重組蛋白）抑制劑，基因重組蛋白） 2.2.分辨化學或遺傳學上修飾的酶分辨化學或遺傳學上修飾的酶 3.3.純化親和標記的活性中心肽段和蛋白質純化親和標記的活性中心肽段和蛋白質

23、 結構研究結構研究 4.4.純化人工合成的多肽和蛋白質純化人工合成的多肽和蛋白質 5.5.解釋酶作用機理解釋酶作用機理第三節(jié)第三節(jié) 親和膜親和膜一、原理一、原理v利用親和配基修飾的微濾膜為親和吸附介質親和利用親和配基修飾的微濾膜為親和吸附介質親和純化目標蛋白質，是親和層析的變形，故又稱膜純化目標蛋白質，是親和層析的變形，故又稱膜親和層析。親和層析。二、應用及特點二、應用及特點v應用應用：單克隆抗體的純化、葡萄糖單克隆抗體的純化、葡萄糖-6-磷酸脫磷酸脫氫酶（氫酶（G6PDH）的純化等。）的純化等。v特點特點優(yōu)點優(yōu)點v傳質阻力小，達到吸附平衡時間短，配基利用傳質阻力小，達到吸附平衡時間短，配基利

24、用率高；率高；v壓降小，流速高，設備體積小，配基用量低。壓降小，流速高，設備體積小，配基用量低。缺點缺點v理論板數(shù)很低，吸附和清洗效率低；理論板數(shù)很低，吸附和清洗效率低；v膜的污染會使操作速度、吸附效率和親和膜的膜的污染會使操作速度、吸附效率和親和膜的壽命下降。壽命下降。第四節(jié) 親和錯流過濾一、原理和操作一、原理和操作v原理：原理：ACFF又稱親和過濾或親和超濾，是生物親和又稱親和過濾或親和超濾，是生物親和作用與膜分離相結合的蛋白質類生物大分子的分離純作用與膜分離相結合的蛋白質類生物大分子的分離純化技術，是親和層析的另一種變形?；夹g，是親和層析的另一種變形。v操作：進料吸附、清洗、洗脫和再生

25、等步驟。操作：進料吸附、清洗、洗脫和再生等步驟。二、應用和特點二、應用和特點v應用：應用：如伴刀豆球蛋白（如伴刀豆球蛋白（con A）的純化，連）的純化，連續(xù)親和循環(huán)提?。ɡm(xù)親和循環(huán)提取（CARE）純化）純化 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶等。等。v特點特點優(yōu)點優(yōu)點v以壓差為推動力，速度快，易于放大和實現(xiàn)連續(xù)以壓差為推動力，速度快，易于放大和實現(xiàn)連續(xù)化操作；化操作；v選擇性高，純化水平接近或達到親和層析；選擇性高，純化水平接近或達到親和層析；v載體一般為水溶性聚合物或無孔微粒，無內擴散載體一般為水溶性聚合物或無孔微粒，無內擴散傳質阻力，目標分子的親和結合速度快；傳質阻力，目標分子的親和結合速度快；v不

26、需使用高壓設備，可彌補高效親和層析設備昂不需使用高壓設備，可彌補高效親和層析設備昂貴、放大困難的缺點。貴、放大困難的缺點。缺點缺點v相當于層析過程的一個理論板，分離效率較低相當于層析過程的一個理論板，分離效率較低。 第五節(jié)第五節(jié) 其他親和純其他親和純 化技術化技術一、親和雙水相分配一、親和雙水相分配v原理：原理：利用偶聯(lián)親和配基的利用偶聯(lián)親和配基的PEG為成相聚合物進為成相聚合物進行目標產(chǎn)物的雙水相萃取，可在親和配基的親和結行目標產(chǎn)物的雙水相萃取，可在親和配基的親和結合作用下促進目標產(chǎn)物在合作用下促進目標產(chǎn)物在PEG相的分配，提高目標相的分配，提高目標產(chǎn)物的分配系數(shù)和選擇性。產(chǎn)物的分配系數(shù)和選擇性。v操作：操作：包括親和分配（進料）、雜蛋白反萃?。ㄇ灏ㄓH和分配（進料）、雜蛋白反萃?。ㄇ逑矗┖湍繕水a(chǎn)物反萃?。ㄏ疵摚┑炔襟E。洗）和目標產(chǎn)物反萃?。ㄏ疵摚┑炔襟E。二、親和反膠團萃取二、親和反膠團萃取v原理：原理：在反膠團相中除通常的表面活性劑（如在反膠團相中除通常的表面活性劑（如AOT）以外，添加另一種親水頭部為目標分子的）以外，添加另一種親水頭部為目標分子的親和配基的助表面活性劑，通過親和配基與目標親和配基的助