DNA合成常見問題解答

1、DNA合成常見問題解答1 DNA合成粗產物中含有什么雜質？DNA合成儀合成的粗產物經過濃氨水氨解以后， 其中除了含有所需的目的 DNA片段 (n) 以外， 還含有合成反應過程中產生的目的片段短的失敗片段 (n-1,n-2, ) 以及脫保護基團產生的 銨鹽。需要通過純化去除短片段、通過脫鹽去除鹽分。2 如何進行合成產物的純化？目前公認和大多采用的 DNA粗產物后處理方式有 4 種：A) C18柱脫鹽，這是一種活性炭柱子，有人稱其為簡易反相柱，它對 DNA有特異性的吸附， 可以被有機溶解洗脫，但不會被水洗脫，所以能有效地去除鹽分。但是它不能有效去除比 目的片段短的小片段。實際上，它是一種脫鹽的作用

2、。這種方法處理的產物中雖然含有比 目的片段少 5' 端一個或兩個或多個堿基的產物，卻一般不會對普通 PCR反應產生影響。但 是對于需要用于測序、用于克隆的引物不能使用這個級別，以免后患無窮。B) OPC柱純化， OPC柱中裝有對 Dmt具有親和力的樹脂，合成 DNA片段時保留 5'端最后一 個堿基上的 Dmt，所有合成產物吸附在 OPC柱上以后，用稀的有機溶劑洗柱，帶有 Dmt 的 片段吸附能力強，不易被洗脫，不帶有 Dmt 的片段吸附能力弱，被洗脫。然后用三氟乙酸 TFA或三氯乙酸 TCA脫去 Dmt基團，再用濃一點的有機溶劑洗脫 DNA。這種方法的優(yōu)點是快 速，簡易。但是其

3、專一性吸附 Dmt 能力有限，不免仍然有短片段帶入的可能，而且負載量 小。特別是對長于 25 堿基以上的片段純化效果不好。C) HPLC 純化，這是國外廠家常常使用的辦法。它是依據(jù)不同大小的片段帶有的凈電荷多 少來分離產物的。合成粗產物中不同長度的 DNA片段決定了它帶有不同的凈電荷，較長的 片段帶有高電荷比帶電荷低的短片段在離子交換柱中流動得慢。 先將粗產物檢測主峰位置， 再增加加樣量，回收主峰位置的部分。它的優(yōu)點是自動化程度高、省人力；缺點是純化量 小、不能純化長片段 （ 對于長于 40 堿基的片段，無法純化 ） 。D）PAGE純化，幾乎所有專業(yè)書籍上介紹的最佳純化方法。它是依據(jù)DNA片段

4、在變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時的遷移率不同來分離大小片段的。由于各分子所帶電荷和大小不同， 綜合影響其在凝膠中的遷移速度，大片段遷移得慢，經過一定時間的電泳，大小片段會分 開，然后停止電泳，剝離凝膠，置于熒光 TLC 板上在紫外燈下切割目的條帶，浸泡碎膠， 并從泡膠的鹽溶液中回收目的 DNA。優(yōu)點是純化效果很好、尤其是純化長鏈效果更好、而 且是可以直觀看見 DNA片段合成情況的質控環(huán)節(jié)。 通常認為的缺點是實驗室水平的 PAGE純 化實驗步驟多費人工、電泳及后處理過程樣品損失量大、電泳裝置局限或電泳時間如果不 夠會影響純化效果。但這些缺點完全可以克服。我們通過擴大規(guī)模流水作業(yè)使實驗過程便 于掌握和

5、節(jié)省人力；在粗樣品中加入尿素飽和液增加樣品比重減少電泳上樣的損失；改用 C18 柱回收產物，使得回收效率大大提高；通過特制電泳裝置，增加凝膠厚度和長度來增 加負載量和分離效果等等。所以我們一直使用 PAGE純化方式保證合成產物的純度。為了保障您的后續(xù)實驗， 請您選用 PAGE純化的產品， 特別是現(xiàn)在 DNA合成不同純化方式的 價格相差不多的情況下。3 如何測定引物的 OD值？用紫外分光光度計在 260nm波長測定溶液的光密度來定量。 請注意紫外分光光度計的使用， 測定時溶液的光密度最好稀釋到 0.2-0.8 之間。 DNA干粉用一定體積的水充分振蕩溶解以 后，取部分溶液稀釋到 1ml 并在 1

6、ml 標準比色杯中測定其光密度，即為所測體積的 OD值， 進而可以計算出母液的 OD值。舉例：您拿到一管干粉的 DNA，用1ml水溶解成母液，取該母液 50微升稀釋成 1ml并在 1ml 標準比色杯中測定的光密度為 0.25 ，說明該 50微升中含有 0.25OD的 DNA，也即說明原來 1ml 母液中含有 5OD的 DNA。4 如何檢測引物的純度？實驗室方便的作法是用 PAGE方法。使用加有 7M尿素的 16%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。 取 0.2-0.5OD 的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和，上樣前加 熱變性 （95oC,2mins） 。加入尿素的目的一是變性，二是

7、增加樣品比重，容易加樣。 600V電 壓進行電泳，一定時間后 （約 2-3 小時） ，剝膠，用熒光 TLC板在紫外燈下檢測帶型，在主 帶之下沒有雜帶，說明純度是好的。 （ 有時由于變性不充分，主帶之上可能會有條帶，乃是 引物二級結構條帶。 ）5 怎樣按照使用濃度溶解引物？記住幾個參數(shù)：1OD引物干粉約為 33 微克；堿基的平均分子量為 324.5 ；引物的分子量 =堿基數(shù) x 堿基的平均分子量；引物的摩爾數(shù) =質量數(shù) / 引物分子量舉例：如果您拿到一管標明為 2OD的 20 堿基的引物，分子量=20 x 324.5=6490 質量數(shù)=2 x 33 =66 g摩爾數(shù) =66 / 6490 =0.

8、010 mol= 10 nmol若您需要溶解為 10M(=10pmol/ l) 的溶液，只需加 1mlddH2O充分溶解即可同時請您注意：真空干燥的 DNA呈干膜狀或粉末狀在離心管底部，開啟瓶蓋時小心不要丟 失；請加入足量的水充分振蕩溶解。6 如何保存引物？我們提供的干粉 DNA從有機溶劑中干燥出來，無菌，無核酸酶。可以室溫或 -20oC 密閉長 期保存；溶解以后的 DNA最好保存在 -20oC, 溶解引物的水的 PH要求大于 7，并且無菌。帶有熒光標 記的引物請注意避光保存。7 已經溶解的引物，為什么原先使用正常，而過一段時間再使用就不好了？如果您溶解引物的水 PH過低或污染了菌或核酸酶，

9、會使引物降解。 我們發(fā)現(xiàn)不少實驗室用 的雙蒸水 PH<6，請您也查查。使用時沒有充分解凍振蕩混合，液體不均勻也可能會造成引物加入量不準確。8 為什么公司可以提供較多產物？與所有化學制備反應一樣，最終產物的多少取決于起始反應物的量以及合成效率。 我們使用的儀器和生產規(guī)程使我們可以調整合成的起始量，而且合成的高效率使我們可以 得到較多粗產物。我們的改良的 PAGE純化與 C18柱回收結合的方法使得我們得到的最終產物能夠滿足您的要求。9 為什么說用 EB染色合成 DNA片段來定量是不正確的？通?？梢杂?EB染色的方法來判斷雙鏈 DNA的量（ 如質粒 DNA），是因為 EB可以嵌合到雙鏈 DNA

10、中。而合成的單鏈 DNA，由于堿基組成不同，形成二級結構的可能性不同， EB 的染色 程度也會不同，比如 Oligo（dT） 等不形成二級結構， EB根本無法染色。所以不要用 EB染色 的方法來定量，而用紫外分光光度計檢測。同樣道理，用 EB染色來照片不適合所有引物。10 PCR擴增沒有成功，懷疑是引物不好，怎么辦？PCR擴增不成功的因素很多，需要您耐心地分析，最好在實驗時設置對照來判定原因。 如果您懷疑引物的問題， 請您首先測定您溶解的引物的 OD值，看實驗時加入的引物量是否 正確。如果量是正常的，請您告訴博亞公司您的引物編號，我們會復查留存樣品。如不明 原因，我們免費為您重新合成一次。如果

11、仍然不能擴增，請您查找其它原因。也可以將引 物和模板寄給我們幫助您進行 PCR。11 引物不純會造成什么后果？引物不純可能會導致： 1）非特異性擴增； 2）無法用預先設計在引物 5' 端酶切位點的酶切開， 特別是沒有保護堿基的引物； 3） 用于測序出現(xiàn)雙峰或亂峰。12 普通合成的 DNA片段 5' 末端是磷酸基團嗎？普通合成的 DNA片段 5' 末端與 3' 末端都是羥基，可直接用于 PCR。如果需要您可以用多核 苷酸激酶進行 5' 端磷酸化，或者要求我們合成時直接在 5' 或 3' 端進行磷酸化，需要另外 收費（參見價目表 ）。13 P

12、CR產物經過克隆以后測序發(fā)現(xiàn)引物區(qū)與合成序列不相符合，怎么辦？我們認為這多數(shù)是 PCR過程和克隆過程中引入的錯誤。遇到這種情況，請您：1) 可以要求我們重新免費合成引物。2) 重新挑取克隆測序，會有找到正確克隆的可能；3) 要求我們免費為您做點突變予以改正。14 公司可以合成多長的序列？由于用戶和基因拼接的要求，我們很好地合成過不少 100 堿基左右長度的長片段。因為我 們可以提高起始合成數(shù)量、加大合成用的試劑量、用 PAGE純化。如果您的實驗需要，我們 愿意接受 110 堿基以下的訂單。15 我訂購了兩條可以退火的引物，您可以幫助退火嗎？可以。您也可以自己退火。用退火緩沖液 (10mMT r

13、is, pH 7.5 - 8.0, 50mMN aCl, 1mME DTA) 溶解引物 , 將要退火的引物等摩爾數(shù)混合， 總體積不要超過 500 微升，加熱到 95oC 2mins， 然后緩慢冷卻至室溫 ( 低于 30oC)即可。退火的產物可以放在 4oC待用。16 公司幫助設計引物嗎？ 我們可以幫助您設計引物，需要您按照要求提供具體資料。但是由于您提供資料的準確信 以及我們水平的限制，我們不能保證每一個設計的引物一定工作。我們不承擔設計引物失 敗的責任。您如果信任我們，我們愿意幫助設計。17 各種標記的熒光染料的名稱、吸收波長和發(fā)射波長、可見光中顏色是怎樣的？簡稱全稱吸收波長發(fā)射波長顏色6-FAM6-carboxy-fluorescein494nm518nmGreenTET5-tetrachloro-fluorescein521nm