生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)(內(nèi)容)

1、實(shí)驗(yàn)一 血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?）了解電泳的一般原理、撐握醋酸纖維素薄膜電泳操作技術(shù)。（2）測(cè)定人血清屮各種蛋白質(zhì)的相對(duì)百分含呆。實(shí)驗(yàn)原理帶電荷的膠體粒了在電場(chǎng)中移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳。醋酸纖維素薄膜電泳法是以醋酸纖維素薄膜作 為支持物。血清中含多種蛋口質(zhì)，當(dāng)在ph這&6時(shí)，這些蛋口質(zhì)均帶負(fù)電，它們?cè)陔妶?chǎng)中向陽(yáng)極移動(dòng)，由 于各種蛋白質(zhì)所帶負(fù)電荷多少及顆粒人少不同，所以在同一電場(chǎng)，同一 ph環(huán)境屮泳動(dòng)速度不同。木實(shí)驗(yàn)以醋酸纖維素為電泳支持物，分離各種血清蛋白。血清屮含有清蛋白，”球蛋白、卩-球蛋片、v球蛋片和各種脂蛋白等。各種蛋白質(zhì)由于氫基酸組分、立體構(gòu)象、分了量、等電點(diǎn)及形

2、狀不同（表17），在電場(chǎng)屮遷移速度不同。分了量小、等電點(diǎn)低、在和同堿性ph緩沖體系屮、帶負(fù)電荷表2人血清中12種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)及分子量蛋口質(zhì)名稱等電點(diǎn)（pl）分子量淸蛋白4.8869000a球蛋白5.060)200000a2300000卩-球蛋口5290000150000v球蛋白6.85-7.50156000300000多的蛋口質(zhì)顆粒在電場(chǎng)屮遷移速度快。例如，以醋酸纖維索薄膜為支持物，正常人血清小ph&6的緩 沖體系小電泳lh左右，染色后可顯示5條區(qū)帶。淸蛋口泳動(dòng)最快，其余依次為（x，af, 及y球蛋 口（如圖17.1）。這些區(qū)帶經(jīng)洗脫后可用分光光度法定量，也可直接進(jìn)行光吸收扌i措白動(dòng)

3、繪出區(qū)帶吸 收峰及相對(duì)百分比。臨床醫(yī)學(xué)常利用它們異常區(qū)帶的出現(xiàn)作為臨床鑒別診斷的依據(jù)。此法由于操作簡(jiǎn) 單，快速。目前，己成為臨床住化檢驗(yàn)的常規(guī)操作之一。圖3正常人血清醋酸纖維素薄膜電泳示意圖臨床意義為濟(jì)蛋白.2.3.4,5分別為0,心,0及廠球董白6為點(diǎn)樣原點(diǎn)清蛋口 62-72% （x1球蛋口 3-4% 血一球蛋口 6-10% 卩一一球蛋口 7-11% /9-18% 血清蛋口電泳的病理改變多半是清蛋口隆低和一種或二種以上球蛋口增加，其臨床意義表3血清蛋質(zhì)的臨床意義清蛋白球蛋白附注«1a2py妊娠t1中毒時(shí)更明顯，產(chǎn)后23個(gè)月正常嬰兒ttt6個(gè)月時(shí)丫正常，其它成分6-10歲時(shí)正常多發(fā)性

4、骨髓瘤tt廿異常球蛋白，可在卩和y區(qū)帶間出現(xiàn)m區(qū)帶糖尿病1肝硬變atttt在晚期失代償時(shí)阻塞性黃疸t無(wú)丙種球蛋口血癥u全身性紅斑狼瘡門t類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎t風(fēng)濕熱t(yī)t淀粉樣變性tt腎病ttt1試劑1.巴比妥緩沖液（ph8.6離子強(qiáng)度為0.06）：稱取巴比妥納12.76克，巴比妥1.66克，置于盛有200ml蒸憎水的燒杯屮稍加熱溶解示，移置100ml容址瓶屮，加蒸鎘水稀禪至刻度。2. 染色液：氨基黑10b.5克，加甲醇50ml,冰乙酸50ml,蒸館水40ml,溶示備用。3. 漂洗液：甲醇或乙醇45ml,加冰乙酸5ml,混勻即可。4. 洗脫液：0.4mnaoh5. 透時(shí)度：冰乙酸25ml,加95%乙醇

5、75ml混勻。操作1. 準(zhǔn)備點(diǎn)樣：將薄膜條（8x2cm）浸入巴比妥緩沖液，再于薄膜的無(wú)光澤而的一端1.5cm處，用 毛細(xì)管或玻片取血清呈直線狀滴加，等滲入膜內(nèi)后，將薄膜有樣品的一而向下（以防蒸發(fā)干）貼在電 泳槽架上，兩端用浸濕的濾紙作橋貼緊。蓋嚴(yán)，平衡5分鐘。2. 通電：一般電壓為120-140v,電流約（0.4-0.6ma/cm）通電45-60分鐘，待電泳區(qū)帶展開約 25-35mm后關(guān)閉電源。3. 染色：通電完畢，將薄膜胃接浸于染色液屮：2-3分鐘示取出，用漂洗液清洗數(shù)次，脫色至背 景為無(wú)色。4. 定量：將漂洗凈的薄膜吸干，剪下各個(gè)蛋片色帶，同時(shí)按各區(qū)帶的平均寬度剪下一條空白區(qū)帶, 然后分別

6、浸入0.4mnaoh5ml的試管中，振搖數(shù)次，使色澤浸出。于50620毫微米波長(zhǎng)處比色，以空 白帶浸出液調(diào)整零點(diǎn)，測(cè)各部分光密度為：a、心、隊(duì)丫，按下列方法計(jì)算：光密度總和t= a+ai+a2+p+y各部分蛋白質(zhì)百分含量為：a清蛋口（） =-xl00%ta】球蛋口（） =x 100%t血球蛋白（） =-xl00%_t球蛋白（）=0x100%y 球蛋口（） =xl00%5. 透明：待薄膜完全干燥后，浸入透時(shí)液約510分鐘，取出平貼在玻璃板上，完全干燥后即成透 明的膜，可于光密度計(jì)上測(cè)定密度，或作標(biāo)本永遠(yuǎn)保存。結(jié)果分析：作業(yè)與思考根據(jù)人血清屮血清蛋片各組分等電點(diǎn)，如何估計(jì)它們?cè)趐h=8.6的巴比妥

7、緩沖液屮移動(dòng)的相對(duì)位 置？實(shí)驗(yàn)二 alt測(cè)泄標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私鈽?biāo)準(zhǔn)曲線制作的基本過程及使用標(biāo)準(zhǔn)曲線的意義。 波長(zhǎng)及在光電地色中濾光法的選擇九(nm)濾光片顏色測(cè)定介質(zhì)顏色400435青紫黃綠435480藍(lán)黃480490藍(lán)綠桔紅490500綠藍(lán)紅500560綠紫560580綠黃藍(lán)紫580595黃藍(lán)595610桔紅藍(lán)綠610'750紅綠藍(lán)alt測(cè)定實(shí)驗(yàn)原理及標(biāo)準(zhǔn)曲線制作血清屮alt在一定的反應(yīng)條件下，作用于丙氨酸及a酮戊二酸生成一定量的丙酮酸及谷氨酸。2, 4 一二硝基苯月井能與反應(yīng)產(chǎn)生的丙酮酸及剩余的基質(zhì)(x酮戊二酸生成札i應(yīng)的2, 4 一二硝基苯腺, 后者在堿性條件下呈棕色。以

8、相同克分子濃度計(jì)算，丙酮酸所形成的苯腺在505波長(zhǎng)下的od值為a- 酮戊二酸的三倍，根據(jù)此特點(diǎn)可計(jì)算出alt作用反生成的丙酮酸的量，從而推算出酶的活力。其反 應(yīng)式如下：丙氨酸+cl啊戊二酸內(nèi)酮酸+谷氨酸內(nèi)酮酸+2, 4二硝基苯腓a丙酮酸2, 4二硝基苯腺+水試劑1. 基質(zhì)液(含適量防腐劑)2.2, 4二硝基苯冊(cè)溶液(lmmol/l)3. naoh 溶液(4m)使用前用蒸鎘水釋10倍成0.4mnaoh溶液4. 丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液(2mol/l)操作方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作1. 按表5于各管屮加入和應(yīng)試劑表501234ph7.4磷酸緩沖液0000.10.1丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液(ml)00.050.10050.20基質(zhì)

9、液(ml)0.500.450.400350.302. 在每一管屮各加入2,4 硝基苯月井溶液0.5ml混勻，于3tc水浴放置20分鐘后加入0.4mnaoh 溶液5.0ml再混勻。3. 室溫放置10分鐘后，于505nm波長(zhǎng)比色，以0號(hào)管調(diào)零點(diǎn)，讀取各管的吸光度，分別用各管 的吸光度值少對(duì)應(yīng)的卡門氏酶活力單位作圖，即成標(biāo)準(zhǔn)曲線。血清alt酶活力的測(cè)定（賴氏法）實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆辗止夤舛扔?jì)的正確使用方法，了解使用標(biāo)誰(shuí)曲線的竟義。實(shí)驗(yàn)原理同alt標(biāo)準(zhǔn)|11|線制作實(shí)驗(yàn)操作取試管2支按表6操作表6空白管測(cè)定管血清（ml）0.1蒸懈水或生理鹽水（ml）0.1-基質(zhì)液（ml）0.50.53. 將各管分別混勻，置3

10、7 c水浴中30分鐘后各加入2, 4二硝基苯臍溶液0.5ml混勻。4. 再置37* c水浴中20分鐘，然后各加入0.4mnaoh溶液5.0ml再混勻。5. 宗溫放置10分鐘后比色，波長(zhǎng)為505mm,以空口管調(diào)零點(diǎn)，讀取測(cè)定管的吸光度。6計(jì)算：以測(cè)定管的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的酶活力單位。四、正常值：525賴氏單位實(shí)驗(yàn)三紙層析分離、鑒定氨基酸實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆盏蛯游龅幕炯夹g(shù)，了解分配層析在科研等方而的使用價(jià)值。實(shí)驗(yàn)原理將各種氨基酸點(diǎn)在濾紙一端，使層析劑經(jīng)過點(diǎn)樣處，各種氨基酸遷移率不同，經(jīng)過一段時(shí)間后， 逐漸在濾紙上集中在不同位置通過測(cè)定各種氨棊酸的r值，與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，即可知該成分，其中展層后斑點(diǎn)

11、屮心與原點(diǎn)之間的距離1原點(diǎn)與溶劑前緣間距離在分離樣品組分時(shí)，還會(huì)遇到單向展層分離不好的悄況，此時(shí)可采用雙向展層。即第一相展層示, 除去紙上的溶劑，將濾紙干燥，沿溶劑前沿裁去沒有擴(kuò)展到的部分，轉(zhuǎn)動(dòng)90度后再用第二和溶劑展 層。實(shí)驗(yàn)操作1. 取一張剪好的濾紙（勿用手摸）。2. 分別用毛細(xì)管吸取各氨基酸溶液點(diǎn)在各處點(diǎn)樣處（斑點(diǎn)肯徑不得超過0.5cm）,邊點(diǎn)邊用吹風(fēng) 機(jī)吹干，反復(fù)3次。3. 取層析劑100ml于標(biāo)木缸底，將濾紙懸于標(biāo)木缸層析液屮，點(diǎn)樣端朝下（點(diǎn)樣處不得浸入層 析劑屮），上端濾紙兩解用線固定，并蓋好蓋了，以防濾紙受潮變軟，墮入層析劑屮。4. 層析劑展層至上端約lcm時(shí)停止，取岀標(biāo)木，用鉛

12、筆標(biāo)岀層析劑前沿，用吹風(fēng)機(jī)吹干再將前 三酮均勻噴在濾紙上并吹干。5. 標(biāo)出各斑點(diǎn)的中心點(diǎn)，用尺量出點(diǎn)樣處至溶劑前沿以及至斑點(diǎn)中心的距離。6. 計(jì)算rf值。7. 根據(jù)各已知氨基酸的值，確定混介標(biāo)木屮各氨基酸的成分。8. 結(jié)果分析。實(shí)驗(yàn)四核酸的提取和鑒泄實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^此實(shí)驗(yàn)要求掌握成分分離的一般原理，并熟練掌握離心機(jī)的使用。實(shí)驗(yàn)原理核酸是生物人分了，根據(jù)其分了屮所含戊糖不同而分為dna和rna兩人類。根據(jù)rna能溶于 0.14mnacl溶液屮，而將rna與其它物質(zhì)分開，又根據(jù)dna能溶于im nacl溶液屮，而將dna 與其它物質(zhì)分開。在加入蛋口質(zhì)變性沉淀劑氯仿異丙醇后，經(jīng)離心可分成三層，上層為dn

13、a或 rna溶液，中層為蛋口質(zhì)凝膠，下層為氯仿。所得dna、rna溶液分別用h2so4在沸水屮水解，可 得其各種化學(xué)成份，再根據(jù)各化學(xué)成分特性分別予以鑒定。試劑1. 0.14m nacl2. lmnacl。3. 氯仿異丙醇。4. 95%乙醇。5. 5%h2s04o6. 3.5二羥甲苯:稱取3.5二疑甲苯1.5克，加入濃鹽酸500ml,再加入10%氯化高鐵2030滴, 貯于冰箱。此試劑應(yīng)在臨用前配制。7. 二苯胺：稱取1.5克二苯胺，溶于100ml冰醋酸（a、r）屮，再加入濃h2so41.5ml搖勻貯在 棕色瓶屮放冰箱內(nèi)保存。8. 5%hgnoso9. 濃氨水。10. 酸鍍：稱取相酸餒5克溶于1

14、00 ml蒸鎘水中，再加入濃h2so415ml待冷卻示加蒸鐳水 1000mlc此試劑可于冷處保存一月不變 質(zhì)。11. 氯化亞錫:實(shí)驗(yàn)操作（一）分離提取取肝組織3克,研磨成勻漿，加入0.14m nacl 5ml,充分混勻,3500r/min,離心10,后分成兩部分：沉淀加 im nao5nil 搖勻，|離心ktii1棄去沉淀上渚液加等體積氯仿-異丙醇.蠱勻離心10*上層液加等體積氯仿一異丙醇搖勻.離心kf棄去下兩層上清液棄去下兩層上戒液加尊體積95%乙醇.丨搖勻，離心ktiin棄去上淸液沉淀加 5%h2so44ml搖勻置梯水裕15'冷卻，離心5；11j棄去沉淀上清液棄去上淆液棄去沉淀沉淀

15、加 5%h2so44ml, 搖勻鑫怫水浴 15冷卻，離心5加等體枳95%乙醇,搖勻離心10#上淸液a分別按下衣進(jìn)行鑒定（二）鑒定1 嚓吟堿鑒定：嚓吟堿在堿性條件下可與硝酸銀作用生成h色沉淀。表1412水解液（滴）205%h2so4 （滴）-20濃氨水（滴）33結(jié)果判斷結(jié)果分析：2. 磷酸鑒定：h3po4+12 h2mo04->h3p041 2m0o3+12h2o磷酸 鉗酸磷鉗酸h2po4 i2m0o3 圧從別h3po46m0o3 3m02o5 鉗藍(lán)表1512水解液（滴）10-5%h2so4 （滴）-10鉗酸鞍（滴）55氯化亞錫（滴）33結(jié)果判斷結(jié)果分析:3.核糖鑒定： 強(qiáng)酸仝核糖一糠醛-

16、3h2o力洌苯綠色化合物表1612水解液（滴）4-5%h2so4 （滴）-43.5二耗甲苯（滴）66結(jié)果判斷結(jié)果分析：4. 脫氧核糖鑒定:強(qiáng)酸-集眇脫氧核®w-基丫酮基戊醛一 藍(lán)色化合物n20表1712水解液（滴）20-5%h2so4 （滴）-20二苯胺（滴）3030結(jié)果判斷結(jié)果分析:實(shí)驗(yàn)五 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)原理唾液淀粉陸能將淀粉水解，牛成各種糊梢，最后可牛成麥芽糖。淀粉與碘反應(yīng)呈蘭色，糊梢根據(jù) 分子大小，與碘反應(yīng)呈蘭紫、紅等不等顏色。麥芽糖不與碘呈色。根據(jù)以上特征，可用來(lái)判斷淀粉水 解的進(jìn)程，并判斷在不同條件下（溫度、ph、激動(dòng)劑、抑制劑）刈帝活性的影響。試劑1. 0.5%淀

17、粉液（不含cl）。2. 0.5%含cl淀粉液：每100ml淀粉溶液中加nacl0.3克。3. ph6.8 磷酸緩沖液：1/15m na2hpo449.6ml 加入 1/15m kh2po450.4ml 混勻即可。4. 2%在碘液。5. ph5.0磷酸緩沖液：0.2m na2hpo4在ph計(jì)下以0.2mhcl調(diào)節(jié)至ph5.0。6. ph8.0 酸緩沖液：1/15m na2hpo494.7ml 加入 l/15mkh2po45.3mlo7. l%na2so4溶液。8. 1%cuso4 溶液。實(shí)驗(yàn)操作溫度對(duì)唾液淀粉酶活性的影響1. 收集唾液、并用蒸帑水稀釋5001000倍（依個(gè)人的酚活性而定）。2.

18、取試管2支，各加稀解唾液5ml, 管肓接加熱煮沸，另一管置冰水浴屮預(yù)冷5分鐘。3. 另取試管4只，編號(hào)，按下表操作。表18管號(hào)步驟1234ph6.8緩沖液1ml1ml1ml1ml0.5%含cl淀粉液0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml置于冰水浴5分鐘置于37°c水浴5分鐘稀釋唾液預(yù)冷唾液各加2ml室溫唾液2ml煮沸唾液2ml搖勻仍置冰浴10分鐘搖勻仍置37°c水浴10分鐘碘液2滴移置37°c水浴10 分鐘后加碘液2滴2滴結(jié)果結(jié)果分析:ph對(duì)唾液淀粉酶活性的影響収試管3支編號(hào)按下表操作:管號(hào)步驟123磷酸緩沖液ph5.01mlph6.81mlph8.01ml0.

19、5%含cl淀粉液0.5ml0.5ml0.5ml稀釋唾液2ml2 ml2 ml保溫均置于37°c水浴保溫10分鐘碘液2滴2滴2滴結(jié)果結(jié)果分析:激動(dòng)劑、抑制劑對(duì)唾液淀粉酶活性的影響取試管5支、編號(hào)按下表操表:管號(hào)步驟12345ph6.8緩沖液1ml1ml1ml1ml1ml0.5%含cl淀粉液0.5ml0.5ml0.5ml0.5%不含cl淀粉液0.5ml0.5mll%na2so42滴2滴2%cuso42滴稀釋唾液2ml2ml2ml2ml2ml保溫均置于37°c水浴10分鐘碘液2滴2滴2滴2滴2滴結(jié)果結(jié)杲分析:實(shí)驗(yàn)六動(dòng)物肝糖元的提取和鑒定實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^實(shí)驗(yàn)要求掌握糖代謝的和關(guān)理論，并在科研技能方血得到一定的培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)原理用三氯酷酸破壞肝組織的輛并沉淀蛋白質(zhì)而保留糖元，糖元不溶于乙醇而溶于熱水。糖元溶液呈現(xiàn)乳樣光澤，遇碘呈紅棕色，本身無(wú)還原性，在酸性溶液中加熱可水解為具有還原性 的衙萄糖，后者可將堿性銅溶液（