沙門氏菌檢測

1、沙門氏菌檢測1設(shè)備和材料除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：1.1 冰箱：2c5C。1.2 恒溫培養(yǎng)箱：36c 土C, 42c由C。1.3 均質(zhì)器。1.4 振蕩器。1.5 電子天平：感量0.1g。1.6 無菌錐形瓶：容量500ml, 250ml。1.7 無菌吸管：1ml （具0.01ml刻度）、10ml （具0.1ml刻度）或微量移液器及吸 頭。1.8 無菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。1.9 無菌試管：3mm< 50mm、10mm< 75mm。1.10 無菌毛細管。1.11 pH計或pH比色管或精密pH試紙。1.12 全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)。2培養(yǎng)基和試劑2.1 緩

2、沖蛋白陳水（BPW）:見附錄中1。2.2 四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液：見附錄中2。2.3 亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液：見附錄中3。2.4 亞硫酸鈿（BS）瓊脂：見附錄中4。2.5 HE瓊脂：見附錄中5。2.6 木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂：見附錄中6。2.7 沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基。2.8 三糖鐵（TSI）瓊脂：見附錄中7。2.9 蛋白陳水、靛基質(zhì)試劑：見附錄中8。2.10 尿素瓊脂（pH7.2）:見附錄中9。2.11 氟化鉀（KCN）培養(yǎng)基：見附錄中10。2.12 賴氨酸脫竣酶試驗培養(yǎng)基：見附錄中11。2.13 糖發(fā)酵管：見附錄中12。2.14 鄰硝基酚&D半乳糖甘（ONPG

3、）培養(yǎng)基：見附錄中13。2.15 半固體瓊脂：見附錄中14。2.16 丙二酸鈉培養(yǎng)基：見附錄中15。2.17 沙門氏菌。和H診斷血清。2.18 生化鑒定試劑盒。2.19 法3.1 試驗前準備3.1.1 將供試品及所有已滅菌的平皿、錐形瓶、勻漿杯、試管、量筒、吸管（1ml、 10ml）、稀釋劑等移至操作室內(nèi)。準備好足夠用量，避免操作中出入操作問。3.1.2 開啟無菌室紫外殺菌燈和潔凈工作臺的空氣過濾裝置30min。3.1.3 操作人員用肥皂洗手，關(guān)閉紫外殺菌燈，進入緩沖間，換工作鞋，用消毒 液洗手或用乙醇棉球擦手，穿戴好無菌衣、帽、口罩、手套等。3.1.4 操作前先用乙醇棉球擦手、工作臺面，再用

4、乙醇棉球擦拭供試品瓶、盒、 袋等的開口處周圍，待干后用滅菌剪刀或銀子將供試品啟封。3.2 前增菌稱取25g （ml）樣品放入盛有225ml BPW的無菌均質(zhì)杯中，以8000r/min 10000r/min均質(zhì)1min2min,或置于盛有225ml BPW的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式 均質(zhì)器拍打1min2min。若樣品為液態(tài)，不需要均質(zhì)，振蕩混勻。如需測定pH值，用1mol/ml無菌NaOH或HCl調(diào)pH至6.8 =0.2。無菌操作將樣品轉(zhuǎn)至500ml錐形 瓶中，如使用均質(zhì)袋，可直接進行培養(yǎng)，于 36c蟲C培養(yǎng)8 h18h。如為冷凍產(chǎn) 品，應(yīng)在45c以下不超過15min,或2c5c不超過18h解凍。

5、3.3 增菌輕輕搖動培養(yǎng)過的樣品混合物，移取1ml,轉(zhuǎn)種于10ml TTB內(nèi)，于42c 土 C 培養(yǎng)18 h24h。同時,另取1ml,轉(zhuǎn)種于10ml SC內(nèi)，于36C 土 C培養(yǎng)18h24h。 3.4分離分別用接種環(huán)取增菌液1環(huán)，劃線接種于一個BS瓊脂平板和一個XLD瓊脂平 板（或HE瓊脂平板或沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板）。于 36C分別培養(yǎng)18h 24h （XLD瓊脂平板、HE瓊脂平板、沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板）或 40h48h（BS瓊脂平板），觀察各個平板上生長的菌落。各個平板上的菌落特征見表1表1沙門氏菌屬在不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征選擇性瓊脂平板沙門氏菌BS瓊脂菌落為黑色有金屬光澤、

6、 棕褐色或灰色，菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色； 有些菌株形成灰綠色的菌落，周圍培養(yǎng)基不變。HE瓊脂藍綠色或藍色，多數(shù)菌落中心黑色或幾乎全黑色；有些菌株為黃色，中心 黑色或幾乎全黑色。XLD瓊脂菌落呈粉紅色，帶或不帶黑色中心，有些菌株可呈現(xiàn)大的帶光澤的黑色中 心，或呈現(xiàn)全部黑色的菌落；有些菌株為黃色菌落，帶或不帶黑色中心。沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基按照顯色培養(yǎng)基的說明進行判定。3.5生化試驗3.5.1 自選擇性瓊脂平板上分別挑取2個以上典型或可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂， 先在斜面劃線，再于底層穿刺；接種針不要滅菌，直接接種賴氨酸脫竣酶試驗培 養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂平板，于36c蟲C培養(yǎng)18h24h,必要時可延長

7、至48h。在三糖 鐵瓊脂和賴氨酸脫竣酶試驗培養(yǎng)基內(nèi)，沙門氏菌屬的反應(yīng)結(jié)果見表 2。表2沙門氏菌屬在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫竣酶試驗培養(yǎng)基內(nèi)的反應(yīng)結(jié)果三糖鐵瓊脂賴氨酸脫竣酶試驗培養(yǎng)基初步判斷斜面底層產(chǎn)氣硫化氫KA十（一）十（一）十可疑沙門氏菌屬KA十（一）十（一）一可疑沙門氏菌屬AA十（一）十（一）十可疑沙門氏菌屬AA+ / 一+ / 一一非沙門氏菌KK+ / 一+ / 一+ / 一非沙門氏菌注：K:產(chǎn)堿，A:產(chǎn)酸，十：陽性，一：陰性；十（一）多數(shù)陽性，少數(shù)陰性；十/:陽性或陰性。3.5.2 接種三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫竣酶試驗培養(yǎng)基的同時，可直接接種蛋白陳水（供做靛基質(zhì)試驗）、尿素瓊脂（pH7.2）、

8、氟化鉀（KCN）培養(yǎng)基，也可在初 步判斷結(jié)果后從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落接種。于 36C 土 C培養(yǎng)18h24h, 必要時可延長至48h,按表3判定結(jié)果。將已挑菌落的平板儲存于2c5c或室溫 至少保留24h,以備必要時復(fù)查。表3沙門氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表反應(yīng)序 號硫化氫（H2S）靛基質(zhì)pH7.2尿素氧化鉀（KCN）賴氨酸脫竣酶A1十一一一十A2十十一一十A3一一一一+ / 一注：十：陽性，一：陰性，十 /:陽性或陰性。3.5.2.1 反應(yīng)序號A1 :典型反應(yīng)判定為沙門氏菌屬。如尿素、KCN和賴氨酸脫竣 酶3項中有1項異常，按表4可判定為沙門氏菌。如有2項異常為非沙門氏菌。表4沙門氏菌屬生化

9、反應(yīng)初步鑒別表pH7.2尿素氧化鉀（KCN ）賴氨酸脫竣酶判定結(jié)果一一一甲型副傷寒沙門氏菌（要求血清學(xué)鑒定結(jié) 果）一十十沙門氏菌IV或V （要求符合本群生化特 性）十一十沙門氏菌個別變體（要求血清學(xué)鑒定結(jié) 果）注：十：陽性，一：陰性。3.5.2.2 反應(yīng)序號A2:補做甘露醇和山梨醇試驗，沙門氏菌靛基質(zhì)陽性變體兩項 試驗結(jié)果均為陽性，但需要結(jié)合血清學(xué)鑒定結(jié)果進行判定。3.5.2.3 反應(yīng)序號A3:補做ONPG。ONPG陰性為沙門氏菌，同時賴氨酸脫竣酶 陽性。甲型副傷寒沙門氏菌為賴氨酸脫竣酶陰性。3.5.2.4 必要時按表5進行沙門氏菌生化群的鑒別。表5沙門氏菌屬各生化群的鑒別項目IIIIIIIV

10、VVI衛(wèi)矛醇十十一一十一山梨醇十十十十十一水楊昔一一一十一一ONPG一一十一十一丙二酸鹽一十十一一一KCN一一一十十一注：十：陽性，一：陰性。3.5.3如選擇生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)，可根據(jù) 3.5.1的初步 判斷結(jié)果，從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落，用生理鹽水制備成濁度適當?shù)木鷳?液，使用生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)進行鑒定。3.6 血清學(xué)鑒定3.6.1 抗原的準備一般采用1.2%1.5%瓊脂培養(yǎng)物作為玻片凝集試驗用的抗原。血清不凝集時，將菌株接種在瓊脂量較高的（如2%3%）培養(yǎng)基上再檢查；如果是由于 Vi抗原的存在而阻止了 O凝集反應(yīng)時，可挑取菌苔于1ml生理鹽水

11、中做成濃菌 液，于酒精燈火焰上煮沸后再檢查。H抗原發(fā)育不良時，將菌株接種在0.55%0.65%半固體瓊脂平板的中央，俟菌落蔓延生長時，在其邊緣部分取菌檢查；或 將菌株通過裝有0.3%0.4%半固體瓊脂的小玻管1次2次，自遠端取菌培養(yǎng)后 再檢查。3.6.2 多價菌體抗原（O）鑒定在玻片上劃出2個約1cmK2cm的區(qū)域，挑取1環(huán)待測菌，各放1/2環(huán)于玻片上 的每一區(qū)域上部，在其中一個區(qū)域下部加 1滴多價菌體（O）抗血清，在另一區(qū) 域下部加入1滴生理鹽水，作為對照。再用無菌的接種環(huán)或針分別將兩個區(qū)域內(nèi) 的菌落研成乳狀液。將玻片傾斜搖動混合1 min,并對著黑暗背景進行觀察，任 何程度的凝集現(xiàn)象皆為陽

12、性反應(yīng)。3.6.3 多價鞭毛抗原（H）鑒定同3.623.7 結(jié)果與報告綜合以上生化試驗和血清學(xué)鑒定的結(jié)果，報告 25g （ml）樣品中檢出或未檢 出沙門氏菌。附錄培養(yǎng)基和試劑1緩沖蛋白陳水（BPW）1.1 成分蛋白陳10.0g氯化鈉5.0g磷酸氫二鈉（含12個結(jié)晶水）9.0g磷酸二氫鉀1.5g蒸儲水1000mlpH7.2 0.21.2 制法將各成分加入蒸儲水中，攪混均勻，靜置約10 min,煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH,高 壓滅菌 121 C, 15min。2四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液2.1 基礎(chǔ)液蛋白陳10.0g牛肉膏5.0g氯化鈉3.0g碳酸鈣45.0g蒸儲水1000mlpH7.0 0.2除碳酸

13、鈣外，將各成分加入蒸儲水中，煮沸溶解，再加入碳酸鈣，調(diào)節(jié) pH,高壓滅菌 121 C, 20 min。2.2 硫代硫酸鈉溶液硫代硫酸鈉（含5個結(jié)晶水）50.0g蒸儲水加至100ml高壓滅菌121C, 20 min。2.3 碘溶液碘片20.0g碘化鉀25.0 g蒸儲水力口至100 ml將碘化鉀充分溶解于少量的蒸儲水中，再投入碘片，振搖玻瓶至碘片全部溶解為止，然后加蒸儲水至規(guī)定的總量，貯存于棕色瓶內(nèi)，塞緊瓶蓋備用。2.4 0.5%煌綠水溶液煌綠0.5g蒸儲水100ml溶解后，存放暗處，不少于1d,使其自然滅菌。2.5 牛膽鹽溶液牛膽鹽10.0g蒸儲水100ml加熱煮沸至完全溶解，高壓滅菌121 C

14、, 20min。2.6 制法基礎(chǔ)液900ml硫代硫酸鈉溶液100ml碘溶液20.0ml煌綠水溶液2.0ml牛膽鹽溶液50.0ml臨用前，按上列順序，以無菌操作依次加入基礎(chǔ)液中，每加入一種成分，均應(yīng)搖 勻后再加入另一種成分。3亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液3.1 成分蛋白陳5.0g乳糖4.0g磷酸氫二鈉10.0g亞硒酸氫鈉4.0gL-胱氨酸0.01g蒸儲水1000mlpH7.0 0.23.2 制法除亞硒酸氫鈉和L-胱氨酸外，將各成分加入蒸儲水中，煮沸溶解，冷至 55c 以下，以無菌操作加入亞硒酸氫鈉和1g/L L-胱氨酸溶液10m 1（稱取0.1g L-胱氨酸, 加1mo1/L氫氧化鈉溶液15ml

15、,使溶解，再加無菌蒸儲水至100ml即成，如為DL- 胱氨酸，用量應(yīng)加倍）。搖勻，調(diào)節(jié)pH。4亞硫酸鈿（BS）瓊脂4.1 成分蛋白陳10.0g牛肉膏5.0g葡萄糖5.0g硫酸亞鐵0.3g磷酸氫二鈉4.0g煌綠0.025破5.0g/L水溶液5.0ml檸檬酸鈿俊2.0g亞硫酸鈉6.0g瓊脂18.0g20g蒸儲水1000mlpH7.5 0.24.2 制法將前三種成分加入300 ml蒸儲水（制作基礎(chǔ)液），硫酸亞鐵和磷酸氫二鈉 分別加入20ml和30ml蒸儲水中，檸檬酸鈿俊和亞硫酸鈉分別加入另一 20ml和 30ml蒸儲水中，瓊脂加入600ml蒸儲水中。然后分別攪拌均勻，煮沸溶解。冷至 80 C左右時，

16、先將硫酸亞鐵和磷酸氫二鈉混勻，倒入基礎(chǔ)液中，混勻。將檸檬 酸鈿俊和亞硫酸鈉混勻，倒入基礎(chǔ)液中，再混勻。調(diào)節(jié) pH,隨即傾入瓊脂液中， 混合均勻，冷至50C-55Co加入煌綠溶液，充分混勻后立即傾注平皿。注：本培養(yǎng)基不需要高壓滅菌，在制備過程中不宜過分加熱，避免降低其選擇性， 貯于室溫暗處，超過48h會降低其選擇性，本培養(yǎng)基宜于當天制備， 第二天使用。5 HE瓊脂（Hektoen Enteric Agar）5.1 成分蛋白陳12.0g牛肉膏乳糖蔗糖水楊素膽鹽氯化鈉瓊脂蒸儲水0.4 %澳麝香草酚藍溶液Andrade指示劑甲液乙液pH5.2 制法3.0g12.0g12.0g2 .0g20.0g5.0

17、g18.0g 20.0g1 000ml16.0ml20.0ml20.0ml20.0ml7.5 0.2將前面七種成分溶解于400 ml蒸儲水內(nèi)作為基礎(chǔ)液；將瓊脂加入于600 ml蒸儲水內(nèi)。然后分別攪拌均勻，煮沸溶解。加入甲液和乙液于基礎(chǔ)液內(nèi)，調(diào)節(jié)pH。再加入指示劑，并與瓊脂液合并，待冷至50c55c傾注平皿。注:本培養(yǎng)基不需要高壓滅菌，在制備過程中不宜過分加熱，避免降低其選擇 性。甲液的配制硫代硫酸鈉34.0g檸檬酸鐵俊4.0g蒸儲水100ml乙液的配制去氧膽酸鈉10.0g蒸儲水100mlAndrad的旨示劑酸性復(fù)紅0.5g1mol/L氫氧化鈉溶液16.0ml蒸儲水100ml將復(fù)紅溶解于蒸儲水中

18、，加入氫氧化鈉溶液。數(shù)小時后如復(fù)紅褪色不全，再加氫氧 化鈉溶液1ml2ml。6木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD ）瓊脂6.1 成分酵母膏L-賴氨酸木糖乳糖蔗糖去氧膽酸鈉 檸檬酸鐵錢 硫代硫酸鈉 氯化鈉 瓊脂酚紅 蒸儲水pH6.2 制法3.0g5.0g3.75g7.5g7.5g2.5g0.8g6.8g5.0g15.0g0.08g1 000ml7.4 0.2除酚紅和瓊脂外，將其他成分加入400ml蒸儲水中，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH。另 將瓊脂加入600ml蒸儲水中，煮沸溶解。將上述兩溶液混合均勻后，再加入指示 劑，待冷至50 C55 C傾注平皿。注:本培養(yǎng)基不需要高壓滅菌，在制備過程中不宜過分加熱，避免降低其

19、選擇性， 貯于室溫暗處。本培養(yǎng)基宜于當天制備，第二天使用。7三糖鐵（TSI）瓊脂7.1 成分蛋白陳20.0g牛肉膏5.0g乳糖10.0g蔗糖10.0g葡萄糖1.0g硫酸亞鐵錢（含6個結(jié)晶水）0.2g酚紅0.025破 5.0 g/L 溶液 5.0ml氯化鈉5.0g硫代硫酸鈉0.2g瓊脂12.0g蒸儲水1000mlpH7.4 0.27.2 制法除酚紅和瓊脂外，將其他成分加入400ml蒸儲水中，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH。另將瓊脂加入600ml蒸儲水中，煮沸溶解。將上述兩溶液混合均勻后，再加入指示 劑，混勻，分裝試管，每管約2ml4ml,高壓滅菌121c 10 min或115c 15min, 滅菌后置成高層

20、斜面，呈桔紅色。8蛋白陳水、靛基質(zhì)試劑8.1 蛋白陳水蛋白陳（或胰蛋白陳）20.0g氯化鈉5.0g蒸儲水1000mlpH7.4 0.2將上述成分加入蒸儲水中，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH,分裝小試管，121C高壓滅菌15min8.2 靛基質(zhì)試劑8.2.1 柯凡克試劑：將5g對二甲氨基甲醛溶解于75ml戊醇中，然后緩慢加入濃鹽酸25ml o8.2.2 歐-波試劑：將1g對二甲氨基苯甲醛溶解于95ml95%乙醇內(nèi)。然后緩慢加入濃鹽酸20ml 08.3 試驗方法挑取小量培養(yǎng)物接種，在36cHe培養(yǎng)1d2d,必要時可培養(yǎng)4d5d。力口入 柯凡克試劑約0.5ml,輕搖試管，陽性者于試劑層呈深紅色；或加入歐-波試劑

21、約0.5ml,沿管壁流下，覆蓋于培養(yǎng)液表面，陽性者于液面接觸處呈玫瑰紅色。注：蛋白陳中應(yīng)含有豐富的色氯酸。每批蛋白陳買來后，應(yīng)先用已知菌種鑒定后方可使用。9尿素瓊脂（pH 7.2）9.1 成分蛋白陳1.0g氯化鈉5.0g葡萄糖1.0g磷酸二氫鉀2.0g0.4% 酚紅3.0ml瓊脂20.0g蒸儲水1000ml20%尿素溶液100mlpH7.2 0.29.2 制法除尿素、瓊脂和酚紅外，將其他成分加入 400ml蒸儲水中，煮沸溶解，調(diào)節(jié) pH。另將瓊脂加入600 ml蒸儲水中，煮沸溶解。將上述兩溶液混合均勻后，再 加入指示劑后分裝，121c高壓滅菌15min。冷至50c55C ,加入經(jīng)除菌過濾的 尿

22、素溶液。尿素的最終濃度為2%。分裝于無菌試管內(nèi)，放成斜面?zhèn)溆谩?.3 試驗方法挑取瓊脂培養(yǎng)物接種，在36C+C培養(yǎng)24h,觀察結(jié)果。尿素酶陽性者由于產(chǎn) 堿而使培養(yǎng)基變?yōu)榧t色。10氟化鉀（KCN）培養(yǎng)基10.1 成分蛋白陳10.0g氯化鈉5.0g磷酸二氫鉀0.225g磷酸氫二鈉5.64g1000ml蒸儲水0.5% 氟化鉀20.0ml10.2 制法將除氟化鉀以外的成分加入蒸儲水中，煮沸溶解，分裝后121c高壓滅菌15min。放在冰箱內(nèi)使其充分冷卻。每100ml培養(yǎng)基加入0.5%氟化鉀溶液2.0ml （最后濃度為1:10000）,分裝于無菌試管內(nèi)，每管約4ml,立刻用無菌橡皮塞塞緊 放在4c冰箱內(nèi)，

23、至少可保存兩個月。同時，將不加氟化鉀的培養(yǎng)基作為對照培養(yǎng) 基，分裝試管備用。10.3 試驗方法將瓊脂培養(yǎng)物接種于蛋白陳水內(nèi)成為稀釋菌液，挑取 1環(huán)接種于氟化鉀 （KCN）培養(yǎng)基。并另挑取1環(huán)接種于對照培養(yǎng)基。在36C+C培養(yǎng)1 d2 d, 觀察結(jié)果。如有細菌生長即為陽性（不抑制），經(jīng)2d細菌不生長為陰性（抑制） 注:氟化鉀是劇毒藥，使用時應(yīng)小心，切勿沾染，以免中毒。夏天分裝培養(yǎng)基應(yīng)在 冰箱內(nèi)進行。試驗失敗的主要原因是封口不嚴，氟化鉀逐漸分解，產(chǎn)生氫氟酸氣 體逸出，以致藥物濃度降低，細菌生長，因而造成假陽性反應(yīng)。試驗時對每一環(huán) 節(jié)都要特別注意。11賴氨酸脫竣酶試驗培養(yǎng)基11.1成分蛋白陳酵母浸膏

24、葡萄糖蒸儲水1.6%澳甲酚紫-乙醇溶液L-賴氨酸或DL-賴氨酸pH11.2制法5.0g3.0g1.0g1000ml1.0ml0.5g/100ml 或 1.0g/100ml6.8 0.2除賴氨酸以外的成分加熱溶解后，分裝每瓶100ml,分別加入賴氨酸。L-賴氨 酸按0.5%加入，DL-賴氨酸按1%加入。調(diào)節(jié)pH。對照培養(yǎng)基不加賴氨酸。分 裝于無菌的小試管內(nèi)，每管0.5ml,上面滴加一層液體石蠟，115c高壓滅菌10min 11.3試驗方法從瓊脂斜面上挑取培養(yǎng)物接種， 于36c蟲C培養(yǎng)18h24h,觀察結(jié)果。氨基 酸脫竣酶陽性者由于產(chǎn)堿，培養(yǎng)基應(yīng)呈紫色。 陰性者無堿性產(chǎn)物，但因葡萄糖產(chǎn) 酸而使培養(yǎng)基變?yōu)辄S色。對照管應(yīng)為黃色。12糖發(fā)酵管12.1 成分牛肉膏5.0g蛋白陳10.0g氯化鈉3.0g磷酸氫二鈉（含12個結(jié)晶水）2.0g0.2%澳麝香草酚藍溶液12.0ml蒸儲水1000mlpH7.4 0.212.2 制法12.2.1 葡萄糖發(fā)酵管按上述成