實驗細(xì)胞化學(xué)染色POX實用教案

1、 細(xì)胞化學(xué)染色，是一種以形態(tài)為基礎(chǔ)，結(jié)合運用化學(xué)或生物化學(xué)技術(shù)(jsh)對血細(xì)胞內(nèi)各種化學(xué)成分作定位、定性及半定量分析的方法。 用于研究血細(xì)胞生理、病理和化學(xué)結(jié)構(gòu)； 臨床上為某些血液病的診斷、鑒別診斷、療效觀察、預(yù)后監(jiān)測和發(fā)病機(jī)制的探討，提供重要依據(jù)。第1頁/共73頁第一頁，共73頁。血細(xì)胞化學(xué)染色的基本要求是在原位顯示細(xì)胞成分和結(jié)構(gòu)(jigu)，反應(yīng)產(chǎn)物應(yīng)是有色沉淀物，具有一定的穩(wěn)定性。血細(xì)胞化學(xué)染色可顯示糖原、脂類、酶、蛋白質(zhì)等。第2頁/共73頁第二頁，共73頁。（一）固定固定有物理法與化學(xué)法，物理法為干燥和火焰固定，化學(xué)法最常用的是甲醛、乙醇(y chn)、丙酮和醋酸等。血細(xì)胞化學(xué)(hu

2、xu)染色流程第3頁/共73頁第三頁，共73頁。（二）顯示 1、偶氮偶聯(lián)法：利用人工合成的酶底物，在酶作用下，產(chǎn)生分解產(chǎn)物，再與重氮鹽結(jié)合引起偶氮偶聯(lián)，使其形成不溶性的偶氮色素，以此(y c)證明酶的存在。 2、聯(lián)苯胺法：粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中的過氧化物酶作用于過氧化氫，釋放新生態(tài)氧，使無色的聯(lián)苯胺形成藍(lán)色沉淀。第4頁/共73頁第四頁，共73頁。 3、普魯士藍(lán)法：細(xì)胞內(nèi)、外鐵與酸性亞鐵氰化鉀作用，形成(xngchng)藍(lán)色亞鐵氰化鐵沉淀。 4、雪夫反應(yīng)：過碘酸氧化細(xì)胞內(nèi)糖類中乙二醇基形成(xngchng)乙醛基，醛基與雪夫試劑作用，使無色品紅形成(xngchng)紅色沉淀。 5、金屬沉著法 其他尚

3、有物理學(xué)方法，如脂溶性染料染色（顯示脂質(zhì)）、熒光顯示、放射自顯影以及體外活體染色亦常用于臨床血液細(xì)胞學(xué)診斷。第5頁/共73頁第五頁，共73頁。（三）細(xì)胞化學(xué)(huxu)定量粗略估量，以染色反應(yīng)的強(qiáng)弱，受色的深淺，人為地區(qū)別為陰性和各種程度的陽性。百分法，只能反映細(xì)胞陽性率，不能反映受色強(qiáng)弱。積分法，是常用的半定量法，將等級估量與百分率相結(jié)合它既反映了細(xì)胞陽性率的高低，又反映了細(xì)胞受色的強(qiáng)弱。第6頁/共73頁第六頁，共73頁。下面介紹幾種常用的細(xì)胞化學(xué)染色方法這些方法學(xué)在白血病的鑒別診斷上具有(jyu)重要意義。第7頁/共73頁第七頁，共73頁。一、過氧化物(u yn hu w)酶染色（POX）

4、 （一）四甲基聯(lián)苯胺法(TMB)【原理】 粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的胞漿內(nèi)的髓過氧化物酶（POX orMPO）分解過氧化氫，釋放新生態(tài)氧，使無色聯(lián)苯胺氧化成藍(lán)色聯(lián)苯胺，后者進(jìn)一步變成棕色(zngs)化合物沉著于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。第8頁/共73頁第八頁，共73頁。POX 新生態(tài)(shngt(shngti)i)氧 O O過氧化氫( (u ynu yn hu qn hu qn) )（基質(zhì)中）四甲基聯(lián)苯胺TMBTMB （無色(w (w s)s)）聯(lián)苯胺藍(lán)（藍(lán)色）亞硝基鐵氰化鈉 藍(lán)色顆粒藍(lán)色顆粒（漿內(nèi)酶部位）（漿內(nèi)酶部位）粒、單核粒、單核細(xì)胞胞漿細(xì)胞胞漿【原理原理】第9頁/共73頁第九頁，共73頁?！驹噭?%TMB亞

5、硝基鐵氰化鈉飽和溶液1%過氧化氫(u yn hu qn)溶液稀過氧化氫(u yn hu qn)溶液瑞氏染色液第10頁/共73頁第十頁，共73頁。 【操作】 1. 取0.1%TMB乙醇溶液lml，加亞硝基鐵氰化鈉飽和溶液10l，混合溶液呈淡棕黃色。 2. 在新鮮干燥(gnzo)的血片上，加混合溶液0.5ml, 放置lmin后，再加稀過氧化氫溶液0.7ml，染色6min 。 3. 瑞氏染液復(fù)染1520min 。 4. 油鏡鏡檢。第11頁/共73頁第十一頁，共73頁。 【結(jié)果】 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有藍(lán)黑色顆粒者為陽性。（） 無顆粒沉著；（） 顆粒細(xì)小(xxio) ，分布稀疏；（+） 顆粒較粗，局灶分布； （+

6、） 顆粒粗大，分布較密，占胞質(zhì) 1/22/3；（+） 顆粒粗大，呈團(tuán)塊分布；（+） 全部胞質(zhì)均部滿顆粒，可覆蓋胞核。第12頁/共73頁第十二頁，共73頁。第13頁/共73頁第十三頁，共73頁。骨髓骨髓( su)( su)片片POXPOX染色染色第14頁/共73頁第十四頁，共73頁。 【臨床意義】 （1）粒系： POX主要分布在粒細(xì)胞和單核細(xì)胞內(nèi)，隨著粒細(xì)胞成熟的程度而逐漸增強(qiáng)，中性分葉核粒細(xì)胞為強(qiáng)陽性(yngxng)。 嗜酸性粒細(xì)胞陽性(yngxng)程度最強(qiáng)，其陽性(yngxng)顆粒比中性粒細(xì)胞粗大，有折光。 堿性粒細(xì)胞為陰性。第15頁/共73頁第十五頁，共73頁。（2）單核細(xì)胞： 原始單

7、核細(xì)胞為陰性反應(yīng)， 幼稚單核細(xì)胞和成熟單核細(xì)胞呈弱陽性反應(yīng)，顆粒(kl)細(xì)小，彌散分布。第16頁/共73頁第十六頁，共73頁。（ 3 ） 其 他 細(xì) 胞淋 巴 細(xì) 胞 、 漿 細(xì) 胞 、 幼 紅 細(xì) 胞 、 組 織 細(xì) 胞 、 巨 核 細(xì) 胞 均 呈 陰 性 反 應(yīng) 。（ 4 ） 血 小 板 過 氧 化 物 酶主 要 定 位 于 幼 稚 型 巨 核 細(xì) 胞 的 核 膜 ( h m ) 上 ， 可 作 為 原 巨 核 細(xì) 胞 的 一 種 標(biāo) 志 物 ， 有 助 于 F A B M 7 的 識 別 。第17頁/共73頁第十七頁，共73頁。 （5）過氧化物酶染色 主要用于鑒別急性白血病類型， 急性髓

8、細(xì)胞白血病多呈陽性反應(yīng)(fnyng)，以M3和M2型反應(yīng)(fnyng)最強(qiáng)，MI和M5型反應(yīng)(fnyng)較弱， 故有助于區(qū)別M3和M5型。 急性淋巴細(xì)胞白血病呈POX陰性反應(yīng)(fnyng)，故為急性髓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞白血病鑒別的重要指標(biāo)。第18頁/共73頁第十八頁，共73頁。 注意事項注意事項 涂片應(yīng)新鮮制作、厚薄適宜。涂片應(yīng)新鮮制作、厚薄適宜。TMB TMB 配制在配制在85858888的乙醇溶液中染色效果較好，勿用的乙醇溶液中染色效果較好，勿用90909595乙醇，否則細(xì)乙醇，否則細(xì)胞表面蛋白質(zhì)很快凝固，妨礙試劑向胞內(nèi)滲入而使顯色反應(yīng)減弱或消失。胞表面蛋白質(zhì)很快凝固，妨礙試劑向胞內(nèi)滲入而使

9、顯色反應(yīng)減弱或消失。過氧化氫溶液需新鮮配制，其濃度與加入量不能隨意更改。涂片中粒細(xì)胞看不見陽過氧化氫溶液需新鮮配制，其濃度與加入量不能隨意更改。涂片中粒細(xì)胞看不見陽性顆粒，紅細(xì)胞呈棕色或綠色，即表示過氧化氫過濃。若過氧化氫加于血片上性顆粒，紅細(xì)胞呈棕色或綠色，即表示過氧化氫過濃。若過氧化氫加于血片上不產(chǎn)生氣泡，則示無效。不產(chǎn)生氣泡，則示無效。染色液適宜染色液適宜pHpH值應(yīng)為值應(yīng)為5.55.5，若，若pHpH值值 5.0 10個鐵顆粒。 正常(zhngchng)范圍：30% 90% ，平均60%， 多見型，少見型，無、型。第65頁/共73頁第六十五頁，共73頁。細(xì)胞(xbo)內(nèi)鐵第66頁/共7

10、3頁第六十六頁，共73頁。 （3）環(huán)形鐵粒幼紅細(xì)胞： 指含鐵顆粒6個，其中2/3以上(yshng)鐵顆粒圍繞核周排列成完整環(huán)形或不完整環(huán)形。 正?；蚍氰F粒幼細(xì)貧血無環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞，鐵粒幼細(xì)貧血中環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞6% 。第67頁/共73頁第六十七頁，共73頁。環(huán)形(hun xn)鐵粒幼細(xì)胞第68頁/共73頁第六十八頁，共73頁?！九R床意義】1 1缺鐵性貧血時，骨髓( su)( su)細(xì)胞外鐵明顯減少，為“一” “士”，細(xì)胞內(nèi)鐵平均5.9%5.9%，僅為I I型。經(jīng)有效鐵劑治療后，外鐵增多。因此骨髓( su)( su)鐵染色是診斷缺鐵性貧血及指導(dǎo)鐵劑治療的重要方法。第69頁/共73頁第六十九頁，共73頁。2鐵粒幼細(xì)胞性貧血時，外鐵“2”一“3”，內(nèi)鐵平均70%，其鐵粒粗大，以 型為主，出現(xiàn)較多環(huán)形(hun xn)鐵粒幼細(xì)胞。因此，本實驗是診斷鐵粒幼細(xì)胞貧血的有效方法。MDS也可出現(xiàn)環(huán)形(hun xn)鐵粒幼細(xì)胞。 第70頁/共73頁第七十頁，共73頁。 3. 非缺鐵性貧血如 巨 幼 細(xì) 胞 貧 血 、 溶 血 性 貧 血 、 再 生 障 礙 性 貧 血 等 骨 髓 鐵 正 常 或 不 同 程 度(ch