實(shí)驗(yàn)2分離以尿素為氮源的微生物2實(shí)用教案

1、一一. .實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)(shyn)(shyn)原理原理 尿素尿素 NH3 中性中性 堿性堿性 酚紅顏色：酚紅顏色： (酸性酸性)黃色黃色(hungs) 紅色紅色( (變色(bins)(bins)范圍 pH6.4-8.2) pH6.4-8.2)第1頁(yè)/共13頁(yè)第一頁(yè)，共13頁(yè)。二二. .實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)(shyn)(shyn)目的目的 使用以尿素使用以尿素(nio s)(nio s)為唯一氮源的培養(yǎng)基分離細(xì)菌為唯一氮源的培養(yǎng)基分離細(xì)菌( (有脲酶有脲酶) ) 通過(guò)指示劑（酚紅）顏色的變化通過(guò)指示劑（酚紅）顏色的變化(binhu)(binhu)檢知培養(yǎng)基檢知培養(yǎng)基pHpH的變化的變化(binhu)(binhu

2、)(脲酶催化的化脲酶催化的化學(xué)反應(yīng)學(xué)反應(yīng)) )第2頁(yè)/共13頁(yè)第二頁(yè)，共13頁(yè)。三三. .實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)(shyn)(shyn)步驟步驟. .倒平板倒平板(pngbn)(pngbn). .制備一定制備一定(ydng)(ydng)濃度梯度的細(xì)菌懸液濃度梯度的細(xì)菌懸液g g土壤土壤m(xù)lml無(wú)菌水，振蕩，為無(wú)菌水，振蕩，為-2-2稀釋液，依次制備稀釋液，依次制備-3-3、-4-4、-5-5的土壤稀釋液。的土壤稀釋液。.稀釋涂布分離法分離細(xì)菌稀釋涂布分離法分離細(xì)菌. .制備無(wú)菌的固體培養(yǎng)基和尿素固體培養(yǎng)基制備無(wú)菌的固體培養(yǎng)基和尿素固體培養(yǎng)基P26P26. .培養(yǎng)觀察培養(yǎng)觀察（倒置，（倒置，37 24-48h

3、37 24-48h）（無(wú)菌，0.1ml，玻璃刮刀）第3頁(yè)/共13頁(yè)第三頁(yè)，共13頁(yè)。配制配制(pizh)培養(yǎng)基培養(yǎng)基 尿素尿素(nio s)(nio s)培養(yǎng)基培養(yǎng)基 葡萄糖葡萄糖 0.025g 0.025g NaCl 0.12g NaCl 0.12g K2HPO4 0.12g K2HPO4 0.12g 瓊脂糖瓊脂糖 0.5g 0.5g 酚紅酚紅 0.25g 0.25g 尿素尿素(nio s) (nio s) 10ml10mlLBLB培養(yǎng)基培養(yǎng)基 蛋白胨：蛋白胨： 0.25g0.25g 酵母提取液：酵母提取液： 0.12g0.12g NaCl NaCl： 0.25g0.25g 瓊脂糖瓊脂糖：

4、0.5g 0.5g 對(duì)照組對(duì)照組選擇選擇(xunz)培養(yǎng)基培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)組為什么用瓊脂糖代替瓊脂？怎么獲得無(wú)菌的尿素溶液？為什么用瓊脂糖代替瓊脂？怎么獲得無(wú)菌的尿素溶液？第4頁(yè)/共13頁(yè)第四頁(yè)，共13頁(yè)。接種(jizhng) 取0.1ml菌懸液第5頁(yè)/共13頁(yè)第五頁(yè)，共13頁(yè)。涂布分離(fnl)第6頁(yè)/共13頁(yè)第六頁(yè)，共13頁(yè)。涂布分離(fnl)第7頁(yè)/共13頁(yè)第七頁(yè)，共13頁(yè)。37倒置(dozh)培養(yǎng)按濃度按濃度(nngd)捆成一摞捆成一摞恒溫恒溫(hngwn)37培養(yǎng)培養(yǎng)第8頁(yè)/共13頁(yè)第八頁(yè)，共13頁(yè)。1 1、為什么要用瓊脂糖代替、為什么要用瓊脂糖代替(dit)(dit)瓊脂配瓊脂配置

5、固體培養(yǎng)基置固體培養(yǎng)基 因?yàn)榄傊驗(yàn)榄傊?qingzh)是未被純化的混合物，內(nèi)是未被純化的混合物，內(nèi)含一定量的含氮化合物。如果用瓊脂含一定量的含氮化合物。如果用瓊脂(qingzh)固化培養(yǎng)基，會(huì)為細(xì)菌提供一定量固化培養(yǎng)基，會(huì)為細(xì)菌提供一定量的非尿素類氮源，這樣會(huì)在尿素固體培養(yǎng)上產(chǎn)的非尿素類氮源，這樣會(huì)在尿素固體培養(yǎng)上產(chǎn)生大量以非尿素為氮源的細(xì)菌，不利于以尿素生大量以非尿素為氮源的細(xì)菌，不利于以尿素為氮源的細(xì)菌的篩選，故用純化的瓊脂為氮源的細(xì)菌的篩選，故用純化的瓊脂(qingzh)糖而不用瓊脂糖而不用瓊脂(qingzh)做固化劑做固化劑思考題：第9頁(yè)/共13頁(yè)第九頁(yè)，共13頁(yè)。2 2、有脲酶的細(xì)

6、菌在生態(tài)、有脲酶的細(xì)菌在生態(tài)(shngti)(shngti)穩(wěn)態(tài)上起穩(wěn)態(tài)上起什么作用什么作用 土壤中的尿素在較高溫度下會(huì)被水解成氨，氨使土壤中的尿素在較高溫度下會(huì)被水解成氨，氨使土壤堿化，氨還與土壤堿化，氨還與SO42-SO42-等離子形成化合物，使等離子形成化合物，使土壤板結(jié)。而脲酶的細(xì)菌不僅使動(dòng)植物尸體降解，土壤板結(jié)。而脲酶的細(xì)菌不僅使動(dòng)植物尸體降解，而且而且(r qi)(r qi)利用了所形成的氨，有利于自然利用了所形成的氨，有利于自然界中氮的循環(huán)。界中氮的循環(huán)。第10頁(yè)/共13頁(yè)第十頁(yè)，共13頁(yè)。3 3、有脲酶的細(xì)菌菌落周圍、有脲酶的細(xì)菌菌落周圍(zhuwi)(zhuwi)為什么有著色

7、的環(huán)帶出現(xiàn)。為什么有著色的環(huán)帶出現(xiàn)。 細(xì)菌向胞外分泌脲酶，使培養(yǎng)基中尿素水解，水解后產(chǎn)生氨，氨為細(xì)菌向胞外分泌脲酶，使培養(yǎng)基中尿素水解，水解后產(chǎn)生氨，氨為堿性，酚酞在酸性環(huán)境里呈黃色堿性，酚酞在酸性環(huán)境里呈黃色(hungs)，堿性里呈紅色。培養(yǎng)，堿性里呈紅色。培養(yǎng)基中酸堿指示劑產(chǎn)生顏色變化（變紅），標(biāo)志著存在脲酶水解尿素基中酸堿指示劑產(chǎn)生顏色變化（變紅），標(biāo)志著存在脲酶水解尿素的作用，從而證明這一菌株以尿素為氮源。的作用，從而證明這一菌株以尿素為氮源。第11頁(yè)/共13頁(yè)第十一頁(yè)，共13頁(yè)。4 4、與全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上的菌落數(shù)比較、與全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上的菌落數(shù)比較(bjio)(bjio)，為什，為什么尿素培養(yǎng)基上只有少數(shù)菌落么尿素培養(yǎng)基上只有少數(shù)菌落 表明能利用尿素表明能利用尿素(nio s)的細(xì)菌在土壤菌落中只占有極少數(shù)。的細(xì)菌在土壤菌落中只占有極少數(shù)。5.5.本實(shí)驗(yàn)分離出來(lái)的細(xì)菌本實(shí)驗(yàn)分離出來(lái)的細(xì)菌(xjn)(xjn)一定都是以尿素為氮源的細(xì)菌一定都是以