細胞實驗 MTT

1、 細胞生物學實驗 利用MTT比色法測定細胞群體的相對細胞數(shù)量 一、實驗?zāi)康?1.熟悉掌握細胞傳代培養(yǎng)2.學習和掌握細胞生長速率的測定3.學會用MTT法檢測細胞的生長狀況4.了解MTT法在生物學研究中的應(yīng)用二、實驗原理細胞生長曲線是觀測細胞在一代生長期內(nèi)增殖過程的重要指標，為培養(yǎng)細胞的細胞生物學參數(shù)之一。 圖一：體外培養(yǎng)細胞的一代生長曲線MTT全稱為3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，漢語化學名為 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍。是一種黃顏色的染料。MTT比色法

2、，是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)(OD值在0.7以內(nèi))，MTT結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經(jīng)濟?！咀ⅰ縈TT比色法的影響因素1.溶劑溶解甲瓚能力不同；2.培養(yǎng)基中的酚紅、血清和PH變化可能影響OD值；

3、3.DMSO溶解能力強，但是可能與殘留MTT發(fā)生反應(yīng)，隨著時間延長不斷加深。（改良方案：SDS+DMSO）；三、實驗材料1.實驗儀器：超凈工作臺，CO2 培養(yǎng)箱，熒光顯微鏡2.實驗材料：HeLa細胞，96孔板3.實驗試劑：PBS(Ph=7.4)，MTT母液(5mg/mL,溶于PBS)，裂解液（10%SDS-0.01N HCL于室溫保存），胰酶，DMEM培養(yǎng)基，血清四、實驗步驟1.取生長期的HeLa細胞，用胰酶消化計數(shù)，配制細胞懸液濃度為8×104/mL；2.每列都加完全培養(yǎng)基100L（除去第二列），取細胞懸液200L接種到第二列，在第二列取100L接種到第三列，依次類推；最終的細胞濃

4、度見下表；3.檢測：棄去舊培養(yǎng)基，加入100L含MTT的培養(yǎng)基（5mg/mL MTT:培養(yǎng)基=1:10）；4.孵育4hr，然后加100L裂解液過夜；5.用酶標儀測OD值，檢測波長為570nm；表一：96孔板設(shè)計（溶液為200L）123456A無細胞細胞原液2倍稀釋4倍稀釋8倍稀釋16倍稀釋B無細胞細胞原液2倍稀釋4倍稀釋8倍稀釋16倍稀釋C無細胞細胞原液2倍稀釋4倍稀釋8倍稀釋16倍稀釋D無細胞細胞原液2倍稀釋4倍稀釋8倍稀釋16倍稀釋E無細胞細胞原液2倍稀釋4倍稀釋8倍稀釋16倍稀釋F無細胞細胞原液2倍稀釋4倍稀釋8倍稀釋16倍稀釋G無細胞細胞原液2倍稀釋4倍稀釋8倍稀釋16倍稀釋H無細胞細

5、胞原液2倍稀釋4倍稀釋8倍稀釋16倍稀釋【注】第7至11列與第2至6列相同，第12列與第1列相同；五、實驗結(jié)果及分析實驗結(jié)果：表二：實驗組1 OD值結(jié)果123456A-0.0940.1130.0470.2410.033-0.030B-0.0960.1660.0240.3190.1740.111C-0.0870.2880.0250.3060.1920.096D-0.0970.4590.4070.3440.1830.143E-0.0740.5310.0570.3430.1840.163F-0.0740.3860.0000.3960.1910.126G-0.0920.3410.0470.2890.1

6、27-0.015H-0.0500.0300.0310.2980.162-0.138平均值-0.0830.2890.0800.3170.1560.057表三：實驗組2OD值結(jié)果789101112A0.1660.114-0.0270.056-0.059-0.063B0.3280.7950.0200.018-0.0060.057C0.7190.3360.0210.0550.0020.044D-0.0750.4210.0780.0650.0130.038E0.5350.9480.3010.0320.024-0.046F0.7940.1200.062-0.026-0.025-0.016G0.1260.1

7、280.002-0.060-0.042-0.035H0.358-0.044-0.041-0.072-0.049-0.648平均值0.3690.3520.0520.009-0.018-0.083/倍稀釋圖一：實驗組1的OD平均值曲線圖/倍稀釋圖二：實驗組2的OD平均值曲線圖結(jié)果分析：1、 由圖一可以得出我們小組的實驗組1的結(jié)果并不理想；實驗最后測得OD值沒有規(guī)律，較亂；而且在未加入裂解液之前，在顯微鏡下觀察時，并沒有松針，而且細胞有可能被污染；分析原因應(yīng)該是在接種細胞的時候細胞沒有混勻?qū)е掠械牡胤郊毎^于密集而死亡；也有可能是在加藥或者接種的時候被污染；2、由圖二可以看出實驗組2的實驗結(jié)果較為理想；隨著接種細胞濃度的降低，OD值也在減少；細胞密度偏大測出的吸光度也會偏大，細胞密度小吸光度也會偏??；另外跟細胞狀態(tài)也有關(guān)系，細胞狀態(tài)不好的話，吸光度值也會低的；六、實驗思考題可以通過哪些措施保證接種細胞時均勻分布？1、 因細胞在混勻后仍要繼續(xù)沉降，因此接種的過程中要反復(fù)多次混勻，如每加8個孔就混 勻一次，以確保接種的細胞密度在各孔之間完全相同；加樣器操作要熟練，盡量避免人為誤差；2、 吹打時懸液總量不能太多，達到吸管吸液量的3到4倍，比較容易混勻；吸液量過多的話，一下吸起很多液體，管中所剩就很少，這樣吹打容易起泡，吸液量過少，吹打的力度就不夠，吹打就會