微生物限度方法學(xué)驗(yàn)證

1、微生物限度檢查方法學(xué)驗(yàn)證一、檢驗(yàn)方法依據(jù)微生物計(jì)數(shù)法 （中國藥典 2015 年版四部 1105） ；控制菌檢查法（中國藥典 2015年版四部 1106） ；非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)（中國藥典2015年版四部 1107） ；抑菌效力檢查法（中國藥典2015 年版四部 1121）檢查。二、菌種、培養(yǎng)基及稀釋液表 1 菌種菌種名稱菌種代數(shù)菌種狀態(tài)廠家大腸埃希菌 cmcc(b)44102 3 正常浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院金黃色葡萄球菌cmcc(b)26003 3 正?？莶菅挎邨U菌cmcc(b)63501 3 正常白色念珠菌 cmcc(f)98001 3 正常黑曲霉 cmcc(f)98003 3 正常乙

2、型副傷寒沙門菌cmcc(b)50094 3 正常表 2 培養(yǎng)基培養(yǎng)基名稱批號(hào)廠家營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基150222 北京三藥科技開發(fā)公司改良馬丁培養(yǎng)基150134 北京三藥科技開發(fā)公司改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基150215 北京三藥科技開發(fā)公司營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基150317 北京三藥科技開發(fā)公司玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基150323 北京三藥科技開發(fā)公司膽鹽乳糖培養(yǎng)基150127 北京三藥科技開發(fā)公司膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基150214 北京三藥科技開發(fā)公司四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基150416 北京三藥科技開發(fā)公司mug 培養(yǎng)基150122 北京三藥科技開發(fā)公司曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基150137 北京三藥科技開發(fā)公司三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基

3、150207 北京三藥科技開發(fā)公司表 3 對(duì)照用培養(yǎng)基對(duì)照培養(yǎng)基名稱批號(hào)廠家營養(yǎng)肉湯對(duì)照培養(yǎng)基135004-201103 中國食品藥品檢定研究院營養(yǎng)瓊脂對(duì)照培養(yǎng)基135003-201002 中國食品藥品檢定研究院玫瑰紅鈉瓊脂對(duì)照培養(yǎng)基135005-201002 中國食品藥品檢定研究院膽鹽乳糖對(duì)照培養(yǎng)基135006-201404 中國食品藥品檢定研究院膽鹽硫乳瓊脂對(duì)照培養(yǎng)基135010-201102 中國食品藥品檢定研究院四硫磺酸鈉亮綠對(duì)照培養(yǎng)基135020-201101 中國食品藥品檢定研究院mug 對(duì)照培養(yǎng)基135012-201001 中國食品藥品檢定研究院曙紅亞甲藍(lán)瓊脂對(duì)照培養(yǎng)基13500

4、9-201102 中國食品藥品檢定研究院三糖鐵瓊脂對(duì)照培養(yǎng)基表 4 試劑試劑名稱批號(hào)級(jí)別磷酸二氫鉀130826 分析純氫氧化鈉20150117 分析純氯化鈉20140714 分析純聚山梨酯 80 20141011 化學(xué)純95% 乙醇15070722 藥用級(jí)二甲氨基苯甲醛20140402 分析純鹽酸20140533 分析純稀釋液：（1）ph6.8緩沖液取0.2mol/l 磷酸二氫鉀溶液250ml, 加0.2mol/l 氫氧化鈉溶液118ml, 用水稀釋至1000ml，搖勻，既得。（2）0.9%無菌氯化鈉溶液取氯化鈉 9.0g ，加水溶解使成1000ml，過濾，分裝、滅菌。（3）0.05 （ml/

5、ml ）聚山梨酯 80 的 0.9%無菌氯化鈉溶液取聚山梨酯 80 0.5ml ，用 0.9 無菌氯化鈉溶液溶解并稀釋至1000ml， 濾過，分裝，滅菌，備用。（4）靛基質(zhì)試液取對(duì)二甲氨基苯甲醛1.0g ，加入 95% 乙醇 95ml，充分振搖，使完全溶解后，取鹽酸20ml 徐徐滴入。三、菌液的制備1 細(xì)菌、霉菌、酵母菌接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 24 小時(shí)；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48 小時(shí)。上述培養(yǎng)物用 0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml 含菌數(shù)為 50100cfu 的菌懸液備用。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬

6、丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7 天，加入 5ml 含 0.05（ml/ml）聚山梨酯 80 的 0.9%無菌氯化鈉溶液 ,將孢子洗脫，然后吸出孢子懸液（用帶有無菌棉花的能過濾菌絲的無菌毛細(xì)吸管）用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml 含孢子數(shù) 50100cfu 的孢子懸液。 菌液制備后若在室溫下放置， 應(yīng)在 2 小時(shí)內(nèi)使用， 若保存在28可在 24 小時(shí)內(nèi)使用。2 控制菌接種大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 24 小時(shí)。用 0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml 含菌數(shù)為 10100cfu 的菌懸液。菌懸液在室溫下放置應(yīng)在2 小時(shí)內(nèi)使用，若保存在28可在

7、24小時(shí)內(nèi)使用。四、驗(yàn)證內(nèi)容1、計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證將制備好的菌懸液用0.9%無菌氯化鈉溶液以每10倍體積分別稀釋成一系列濃度菌懸液，利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)， 確定具體菌懸液濃度， 取接近于 10cfu-100cfu 的稀釋濃度，選取各項(xiàng)試驗(yàn)項(xiàng)下的規(guī)定濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。稀釋及觀察均應(yīng)在陽性室內(nèi)完成。經(jīng)過驗(yàn)證當(dāng)原液稀釋至10-6時(shí)，菌液濃度接近 100cfu/ml。2、適用性檢查2.1 細(xì)菌、霉菌、酵母菌取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌各1ml(內(nèi)含菌約 50100cfu)，分別注入無菌平皿中，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2 個(gè)平皿，混勻，凝固， 置 3035培養(yǎng) 48 小時(shí)， 計(jì)數(shù)；

8、取白色念珠菌、黑曲霉 1ml(內(nèi)含菌約 50100cfu)，注入無菌平皿中（取用黑曲霉時(shí)應(yīng)注意自身安全），立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2 個(gè)平皿，混勻，凝固，置2328培養(yǎng) 72 小時(shí)，計(jì)數(shù)。同時(shí)，用相應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)，作為對(duì)照。其大小、形態(tài)應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基一致，且數(shù)量應(yīng)不小于對(duì)照培養(yǎng)基的70%。細(xì)菌、霉菌及酵母菌培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基名稱菌種名稱測(cè)試培養(yǎng)基（cfu）對(duì)照培養(yǎng)基（cfu）回收率(%) 大小形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)論碟 1 碟 2 平均碟 1 碟 2 平均營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌87 83 85 95 99 97 87.6 一致大小形態(tài)一致且回收率 7

9、0%符合規(guī)定金黃色葡萄球菌88 82 85 94 98 96 88.5 一致大 小 形 態(tài)一 致 且 回收率 70%符合規(guī)定大腸埃希菌83 86 84.5 95 95 95 88.9 一致大 小 形 態(tài)一 致 且 回收率 70%符合規(guī)定玫瑰紅鈉培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌84 87 85.5 99 94 96.5 88.6 一致大 小 形 態(tài)一 致 且 回收率 70%符合規(guī)定金黃色葡萄球菌90 86 88 97 101 99 88.9 一致大 小 形 態(tài)一 致 且 回收率 70%符合規(guī)定大腸埃希菌88 83 85.5 92 99 95.5 89.5 一致大 小 形 態(tài)一 致 且 回收率 70%符合規(guī)定培

10、養(yǎng)基中細(xì)菌、霉菌、酵母菌的生長情況良好，回收率在80%，且與對(duì)照培養(yǎng)基狀態(tài)一致，證明此批次培養(yǎng)基可以準(zhǔn)確的檢測(cè)出相應(yīng)微生物情況。2.2 控制菌2.2.1促生長能力取大腸埃希菌菌懸液 0.1ml （內(nèi)含菌約 10100cfu） ，分別置于膽鹽乳糖培養(yǎng)基、 mug培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中； 取乙型副傷寒沙門菌 0.1ml（內(nèi)含菌約 10100cfu） ，分別接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基，取乙型副傷寒沙門菌 0.1ml （內(nèi)含菌約 10100cfu）涂布于膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基、 曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基中； 于 35培養(yǎng) 18 小時(shí)，同時(shí)，用相應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)，作為對(duì)

11、照，每個(gè)培養(yǎng)基平行制備 2 個(gè)平皿。膽鹽乳糖培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、 mug 培養(yǎng)基與對(duì)照管比較，被檢培養(yǎng)基管試驗(yàn)菌應(yīng)生長良好；膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基、曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基與對(duì)照培養(yǎng)基上生長的菌落大小、形態(tài)特征應(yīng)一致。2.2.2抑制能力取金黃色葡萄球菌 100 cfu左右，注入無菌平皿中，立即傾注膽鹽乳糖培養(yǎng)基、 四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基，每個(gè)培養(yǎng)基平行制備2 個(gè)平皿，混勻，凝固，置 35培養(yǎng) 18 小時(shí)，應(yīng)不得有菌生長。2.2.3指示能力取乙型副傷寒沙門菌 10100cfu，接種于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基中，每個(gè)培養(yǎng)基平行制備2 個(gè)平皿，混勻，凝固，置 3035培養(yǎng) 18 小時(shí)；膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基、曙紅亞甲

12、藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基指示能力見 2.2.1中乙型副傷寒沙門菌測(cè)試結(jié)果，mug 培養(yǎng)基指示能力見 2.2.1中大腸埃希菌測(cè)試結(jié)果。與對(duì)照培養(yǎng)基管比較，被檢培養(yǎng)基管試驗(yàn)菌生長的菌落大小、形態(tài)特征、指示劑反映情況等應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基一致。控制菌培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基名稱促生長性（與對(duì)照比較）抑制性（與對(duì)照比較）金黃色平葡萄球菌指示性（與對(duì)照比較）乙型副傷寒沙門菌結(jié)論菌種名稱形態(tài)大小形態(tài)大小指示反應(yīng)膽鹽乳糖培養(yǎng)基大腸埃希菌一致一致無生長- - - 符合規(guī)定mug 培養(yǎng)基大腸埃希菌一致一致- 一致一致一致符 合規(guī)定營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基大腸埃希菌一致一致- - - - 符 合規(guī)定乙型副傷寒沙門菌一致一致- - - - 符

13、合規(guī)定四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基乙型副傷寒沙門菌一致一致無生長- - - 符 合規(guī)定膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基乙型副傷寒沙門菌一致一致- 一致一致一致符 合規(guī)定曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基乙型副傷寒沙門菌一致一致- 一致一致一致符 合規(guī)定三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基- - - - 一致一致一致符 合規(guī)定培養(yǎng)基的促生長性及指示性菌落生長狀態(tài)一致，抑制性均無菌落生長，說明培養(yǎng)基適用性良好。3、抑菌性：取連續(xù)生產(chǎn)的三批樣品進(jìn)行測(cè)定3.1 細(xì)菌 、霉菌、酵母菌3.1.1供試液的制備：稱取本品10g，加 ph6.8 緩沖液 100ml，混勻，制成 1：10 的供試液。3.1.2 試驗(yàn)組：取大腸埃希菌菌懸液、金黃色葡萄球菌菌懸液和枯草芽孢

14、桿菌菌懸液各1ml，分別加上述供試液1ml，注入平皿中， 立即傾注 1520ml 溫度不超過 45溶化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，每株試驗(yàn)菌平行制備2 個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。31.3 菌液組：取上述各試驗(yàn)菌液1ml，加入相應(yīng)的培養(yǎng)基培養(yǎng)，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。3.1.4供試品對(duì)照組：取供試液1ml，分別注入 1520ml 溫度不超過 45溶化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，每個(gè)培養(yǎng)基平行制備2 個(gè)平皿。3.1.5回收率標(biāo)準(zhǔn)以供試品對(duì)照組為樣品空白(c0)、以菌液組為對(duì)照 (t)、以試驗(yàn)組為測(cè)試品 (c)計(jì)：(c-c0)/t70% 細(xì)菌、霉菌及酵母菌抑菌性檢測(cè)

15、結(jié)果統(tǒng)計(jì)批號(hào)培養(yǎng)基名稱菌種培養(yǎng)時(shí)間（h）菌液組菌數(shù)cfu 試驗(yàn)組菌數(shù)cfu 供試品對(duì)照組菌數(shù)回收率 % 數(shù)值平均數(shù)值平均數(shù)值平均150804 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌72 84 86 90 92.5 8 10 95.9 72 88 95 金黃色葡萄球菌72 86 84 93 91.5 97.0 72 82 90 12 大腸埃希菌72 84 85.5 91 92 95.9 72 87 93 玫瑰紅鈉培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌120 86 86.5 84 85 0 0 98.3 12087 86 金黃色葡萄球菌12087 87.5 85 86 98.3 12088 87 0 大腸埃希菌12087 85.

16、5 83 83 97.1 12084 83 150805 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌72 88 85 95 92.5 6 5 97.1 72 86 90 金黃色葡萄球菌72 85 84.5 95 93.5 95.5 72 84 92 4 大腸埃希菌72 81 84.5 89 91.5 97.7 72 87 94 玫瑰紅鈉培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌120 83 85 87 87.5 0 0 97.1 12087 88 金黃色葡萄球菌12086 84 88 86.5 97.1 12082 85 0 大腸埃希菌12088 84 86 88 95.5 12080 90 150806 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌

17、72 87 85.5 94 95.5 6 6 95.5 72 84 97 金黃色葡萄球菌72 83 86 96 96 95.6 72 89 96 6 大腸埃希菌72 85 85.5 95 96 95.0 72 86 97 玫瑰紅鈉培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌120 84 84 85 87 0 0 96.6 12084 89 金黃色葡萄球菌12085 85.5 90 89 96.1 12086 88 0 大腸埃希菌12082 83.5 89 87 96.0 12085 85 通過連續(xù)三批次不同種菌類的加樣，回收率均在90%以上，說明本產(chǎn)品對(duì)于細(xì)菌、霉菌及酵母菌不具備抑菌性。3.2 控制菌3.2.1大腸埃希

18、菌取 10 ml 供試液（制備方法同3.1.1）及大腸埃希菌菌懸液 1ml(10100cfu)加入膽鹽乳糖培養(yǎng)基 100ml，于 35培養(yǎng) 24 小時(shí)。取上述培養(yǎng)物 0.2ml，接種至含 5ml mug 培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)，于 5 小時(shí)、24小時(shí)在 366nm紫外燈下觀察，同時(shí)用未接種的 mug 培養(yǎng)基作本底對(duì)照。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液。紫外燈照射時(shí)管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光，為 mug 陽性；不呈現(xiàn)熒光，為 mug 陰性；加入靛基質(zhì)試液時(shí)液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽性；呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。3.2.2沙門氏菌取 10 ml 供試液（制備方法同3.1.1）及乙型副傷寒沙門菌 1ml(10100cfu)，直接接種至 200ml 的營養(yǎng)肉湯培 養(yǎng)基中，混勻，于 35培養(yǎng)培養(yǎng) 24 小時(shí)，取上述培養(yǎng)物 1ml，接種于 10ml 四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基中， 35培養(yǎng) 24小時(shí)后，分別劃線接種于膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基和曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基的平板上， 35