靈芝酸的應(yīng)用

1、靈芝酸的純化及其應(yīng)用摘 要：靈芝酸是靈芝中除多糖外另一類具有廣泛生理活性的物質(zhì)，被證明具有止痛、鎮(zhèn)靜、抑制組織胺釋放、解毒、保肝、抗腫瘤等活性。研究還表明結(jié)構(gòu)類似的單體靈芝酸具有不同的生物活性。由于其重要的藥理作用，近年來靈芝酸成為國內(nèi)外研究的一個熱點。The Purification and Application of Ganoderic AcidsAbstract:Ganoderic acids(GA), production by Ganoderma Lucidum, is a physiological active compounds and applied in acesodyn

2、e, nervous system, antihistaminic activity, liver protection antitumer etc. Recent research has also shown that different individual GAs have different activities. Due to the important pharmacological functions of GAs, the interest in G.lucidum has increased around the world in recent years.1、 國內(nèi)外技術(shù)

3、現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢1. 靈芝的經(jīng)濟(jì)價值、營養(yǎng)價值和保健功能1.1靈芝的經(jīng)濟(jì)價值在自然界中，靈芝多生長于森林中樹樁或朽木上，對環(huán)境要求比較嚴(yán)格。別錄中記載靈芝的產(chǎn)地為霍山、恒山、泰山、華山、篙山、高夏。現(xiàn)在靈芝主要來源于多孔菌科植物紫芝和同屬植物赤芝。紫芝主要分布于浙江、江西、湖南、廣西、福建、廣東等省區(qū)，赤芝主要分布于河北、山東、山西、四川、安徽、江蘇、浙江、江西、貴州、云南、廣西、福建、廣東等省區(qū)，生于棟及其它闊葉樹的根部或枯干上。我國地域?qū)拸V、人口眾多，是世界靈芝生產(chǎn)和消費的主要國家，近年間整個生產(chǎn)和消費穩(wěn)中有升，發(fā)展前景廣闊，隨著科學(xué)技術(shù)和人們對靈芝認(rèn)識的加深，需求量將與日俱增。中國藥典20

4、00版首次承認(rèn)靈芝的藥用價值，衛(wèi)生部2001年發(fā)布的“可用于保健食品的真菌菌種名單”中，承認(rèn)了靈芝、紫芝和松衫靈芝。安徽省大別山平均海拔500m，由于地理氣候的因素，非常有利于靈芝生長。大別山素有“西山藥庫”“靈芝之鄉(xiāng)”之美譽大別山靈芝是一種無公害，低農(nóng)殘的“綠色食品”。大別山靈芝基地年產(chǎn)靈芝約600噸，靈芝抱子粉約50噸，是目前中國最大的鍛木靈芝種植基地，也是國內(nèi)最大的鍛木靈芝及靈芝抱子粉的供應(yīng)基地。正是由于靈芝具有廣泛的藥理活性，其療效已為人們所接受，使得以靈芝為原料的產(chǎn)品種類多，市場大，僅在中國大陸、臺灣、日本及韓國就產(chǎn)生了數(shù)百萬美元的效益，尤其是以靈芝酸和靈芝多糖為開發(fā)對象的產(chǎn)品在國外

5、受到人們的關(guān)注和歡迎。據(jù)日本藥局方記載的各種靈芝制劑有片劑、丸劑、膠囊劑、顆粒劑、沖劑、干燥濃縮劑、糖衣劑等內(nèi)服固體制劑配劑、酒精劑等內(nèi)服液體制劑涂抹劑等外用液體制劑硬膏劑、軟膏劑等外用制劑，以上制劑已經(jīng)制劑化生產(chǎn)。另外，可能制劑化的靈芝制劑有吸入劑、注射劑、眼藥水等。國內(nèi)外開發(fā)的部分靈芝酸產(chǎn)品有肝功能促進(jìn)劑、降血壓制品、降膽固醇制品、降血糖制劑、慢性支氣管炎治療劑等。1.2靈芝的營養(yǎng)價值靈芝含有多種氨基酸，蛋白質(zhì)，生物堿、香豆精、甾類、三萜類、揮發(fā)油、甘露醇、樹脂及糖類、維生素B2、維生素C、內(nèi)酯和酶類。硬脂酸、延胡索酸、苯甲酸等為其所含酸內(nèi)的主要成分硬孔靈芝的化學(xué)成分研究 。可養(yǎng)心安神，寂

6、肺益氣，滋肝健脾。主治虛勞體弱，神疲乏力，心悸失眠，頭目昏暈，久咳氣喘，食少納呆。靈芝含有極豐富的稀有元素“鍺”，能使人體血液吸收氧的能力增加1.5倍，因此可以促進(jìn)新陳代謝并有延緩老化的作用，還有增強皮膚本身修護(hù)功能的功效，可用于各種慢性病所致的面色黃萎及由于氣血不足而致的面部光澤等癥。靈芝中的多糖具有雙向調(diào)節(jié)機體免疫力，抗腫瘤和護(hù)肝的作用；靈芝所含有機鍺可誘導(dǎo)人體產(chǎn)生并激活NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活性，參與免疫調(diào)節(jié)；靈芝中的生物堿可以抗炎鎮(zhèn)痛；靈芝可以理氣化淤、安氣益神；靈芝孢子粉能止血、排毒、抗氧化。1.3靈芝的保健及藥用價值1.3.1 保肝作用王明宇等59從赤芝子實體中得到粗靈芝三菇GT，經(jīng)進(jìn)

7、一步純化得GT和GT2主要含靈芝酸A和赤芝酸A。實驗表明GT和GT對四氯化碳、氨基半乳糖普和卡介苗+脂多糖所致的3種肝損傷模型小鼠有較好的保肝作用，可明顯降低模型動物的血清ALT和肝臟TG的含量，并不同程度減輕動物肝損傷。Hirotani等25的結(jié)果顯示靈芝中的靈芝酸提取物能增強肝功能，加強其解毒作用，能降低由四氯化碳中毒引起的血清中轉(zhuǎn)氨酶水平的上升，促進(jìn)肝炎小鼠肝的再生，增強小鼠對毛地黃皂等毒物的抵抗力作用，它也能降低甘油三脂的合成。1.3.2抗腫瘤作用 Toth等60最早報道了靈芝三菇類化合物的抗腫瘤藥理活性。作者從赤芝菌絲體中提取得到6個有細(xì)胞毒活性的三菇類化合物，體外實驗表明能明顯抑制

8、小鼠肝肉瘤(HTC)細(xì)胞的增殖。Xin liu等6z對休眠期飽子、發(fā)芽期抱子和破壁抱子的抗腫瘤活性進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示發(fā)芽期抱子和破壁抱子的脂溶性提取物對小鼠肝細(xì)胞腫瘤、惡性毒瘤S-180和網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤有顯著的抑制作用，抑制作用達(dá)80-90%，受試物表現(xiàn)出劑量依賴性。周昌艷等圓采用體外腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)增殖抑制試驗與體內(nèi)腫瘤細(xì)胞抑制試驗，結(jié)果顯示靈芝酸在體外對腫瘤細(xì)胞株SW 620，LS 180，S 180的增殖具有明顯的抑制作用，體內(nèi)抗腫瘤療效試驗顯示靈芝酸對Lewis肺癌具有一定的療效，對荷Lewis肺癌的小鼠IL-2的生成及NK細(xì)胞的免疫活性均有一定的促進(jìn)作用。因此可以認(rèn)為靈芝酸通過直接細(xì)胞毒

9、作用及激活免疫體系實現(xiàn)抑制腫瘤作用。1.3.3抗氧化作用Zhu等66從赤芝水煮提取物中得到含有三菇類成分的粗組分，通過觀察該粗組分對聯(lián)苯三酚誘導(dǎo)的紅細(xì)胞膜氧化以及Fe(II)-抗壞血酸誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的影響，受試物表現(xiàn)出劑量依賴性的抗氧化作用。1.3.4消炎抗菌作用李平作等67從靈芝深層發(fā)酵菌絲體中分離得到三種靈芝酸，其抗菌活性實驗顯示三種四環(huán)三菇酸具有抑制大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌、腸炎桿菌、金黃色葡萄菌和枯草芽抱桿菌生長的活性。藺麗等68報道從紅芝中分離出溶菌酶及酸性蛋白酶，具有抗菌和消炎作用；從紫芝分離出3種葡聚糖能抑制發(fā)炎，但不能抑制狗血小板的花生四烯酸的代謝。靈芝的CH2C12提取物具有

10、極好的抗炎活性和顯著抵抗PLA2(可誘發(fā)鼠后爪水腫活性)。此外，靈芝三菇的藥用價值還有：鎮(zhèn)痛作用，抑制組胺釋放，抑制膽固醇合成，對血小板凝聚的影響等，而且有越來越多的新活性不斷被發(fā)現(xiàn)和證實。1.4靈芝的活性成分靈芝含有多種活性成分，如多糖、三萜類化合物、核苷、甾醇類、生物堿類、呋喃衍生物、氨基酸多肽、多種酶類等10?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，靈芝中有效成分主要為靈芝多糖和靈芝三萜5， 10， 13-14。三萜類化合物大多具有苦味，強弱隨品種、產(chǎn)地、生產(chǎn)條件而異。作為靈芝類的主要化學(xué)成分之一，靈芝三萜類化合物吸引了越來越多研究者的關(guān)注。 靈芝中三萜類化合物包括靈芝酸，靈芝醇，赤芝酮等，按分子中所含碳原子

11、數(shù)分為 C24，C27，C30三大類，一般將含有羧基的三萜類物質(zhì)稱為靈芝酸。2. 靈芝酸的提取、分離研究進(jìn)展2.1 靈芝酸的提取2.1.1溶劑浸提法三菇類化合物難溶于水，易溶于有機溶劑，一般可用甲醇、乙醇或氯仿等有機溶劑提取。常用的方法大致有兩類：一是用甲醇、乙醇或氯仿為溶劑提取，提取物直接進(jìn)行層析分離，二是用甲醇或乙醇提取，提取物經(jīng)堿處理分出總酸部分再進(jìn)行分離。李平作對發(fā)酵液中靈芝酸和菌絲體中靈芝酸的提取分離進(jìn)行了研究。發(fā)酵液經(jīng)過濾后，用水飽和正丁醇提取三次，合并正丁醇提取液，然后減壓濃縮至干，即得粗靈芝酸。菌絲體加入10倍體積的甲醇，回流提取3h，過濾后殘渣繼續(xù)回用提取，重復(fù)5次，合并濾液

12、，濃縮至膏狀，即為胞內(nèi)粗靈芝酸。鐘建江等對菌絲體中靈芝酸的分離進(jìn)行了研究，先用乙醇提取菌絲體，再用氯仿萃取，碳酸氫鈉除雜質(zhì)的方法來進(jìn)行分離。王幫武等用乙醇浸體子實體，得黑色浸膏，浸膏復(fù)溶于氯仿，用碳酸氫鈉萃取，調(diào)酸后再以氯仿反萃取。馬林等用甲醇、95%乙醇、氯仿等3種提取溶劑，分別冷浸2，4，8，16和24 h，回流1，2和4h或超聲提取15，30和60 min。結(jié)果表明靈芝子實體以氯仿回流提取1h，提取率最高，且樣品中雜質(zhì)干擾較少，故選用氯仿為提取溶劑。2.1.2 5%的 NaHCO3水溶液結(jié)合超聲提取 靈芝酸是難溶于水的物質(zhì)，通常只能用有機溶劑作為提取劑，但是有機溶劑多數(shù)是有毒的，對操作者

13、不利。由于靈芝酸是弱酸性物質(zhì)，通過使用堿性溶液可以提高其在水溶液中的溶解度，以便安全地提取出靈芝酸量。5NaHCO3具有較強的堿性和緩沖能力，并且在用HCl把NaHCO3溶液層調(diào)至pH值為3時對氯仿萃取無干擾，所以使用5NaHCO3作為溶劑是個較好選擇。顧劍40在比較了不同比例的乙醇作為提取劑發(fā)現(xiàn)效果不理想后，對直接使用5%的NaHCO3水溶液結(jié)合超聲提取作了研究。結(jié)果證明，使用5NaHCO3無超聲提取可以獲得與50乙醇冷提時相似的值。用5%的NaHCO3水溶液超聲提取，2mol/L HCl 調(diào)pH至3，氯仿萃取，揮干。在29（室溫）超聲3h，得到粗靈芝酸濃度為2.63±0.13mg

14、/100mg干細(xì)胞，是可提最大靈芝酸濃度的97%，大大減少了提取所用時間有超聲輔助時，得到的值明顯提高，比無超聲時提高了18.2，說明用5NaHCO3作溶劑時超聲提取是最佳的實驗條件。同時發(fā)現(xiàn)用5NaHCO3作溶劑在無超聲輔助提取時，靈芝酸得率隨時間的變化較明顯，一天后即可達(dá)到超聲輔助1.5小時的值，說明該溶劑用于提取是很合適的。 2.1.3超臨界二氧化碳萃取法 使二氧化碳?xì)怏w在超臨界狀態(tài)下與天然原料接觸，有關(guān)天然成分就會溶解于超臨界二氧化碳流體之中，達(dá)到了有效成分與原料的分離。然后通過減壓或升溫的方法，將超臨界流體中萃取的有效成分在分離器中分離出來，即得到高品質(zhì)的有效成分，這就是超臨界二氧化

15、碳萃取的簡單過程。超臨界二氧化碳有氣、液兩重性的特點(既有與液體溶劑相當(dāng)?shù)妮腿∧芰?，又有?yōu)良的傳質(zhì)效果)，與傳統(tǒng)的分離方法相比具有許多獨特的優(yōu)點，尤其適用于提取和精制難揮發(fā)性、熱敏性的天然物質(zhì)，在醫(yī)藥、食品、香料等領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。超臨界二氧化碳萃取是唯一能在萃取有效成份同時擯棄其他成份的快速有效方式。 馬禮金等研究了超臨界流體萃取方法提取紅芝子實體中的三菇類化合物的工藝條件，為利用超臨界二氧化碳法規(guī)?；腿§`芝有效成分奠定了理論基礎(chǔ)。結(jié)果顯示：55、改性劑甲醇體積分?jǐn)?shù)10%、萃取劑二氧化碳密度0.40g/mL(不添加甲醇時為0.80g/mL)、平衡3min、流體流速3.5mL/min是較好的

16、萃取工藝條件。中國科學(xué)院已采用超臨界二氧化碳法直接從破壁的靈芝抱子中萃取出了靈芝三菇類物質(zhì)，所制得的靈芝抱子油總?cè)筋惡看笥诘扔?0% 。2.2靈芝酸的純化2.2.1大孔樹脂提取法利用大孔樹脂吸附分離純化有效成分是近年來在天然產(chǎn)物分離純化中廣泛采用的技術(shù)，具有成本低、效率高、可再生等優(yōu)點。已有研究報道利用大孔樹脂吸附提取分離三菇類化合物。大孔樹脂是一種不含交換團(tuán)，具有大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子吸附劑。它所具有的吸附性是由于范德華引力或產(chǎn)生氫鍵吸附的結(jié)果，而篩選性分離則是它的多孔性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)所決定的。大孔樹脂對有機物選擇性較好，不受無機鹽類存在的影響。一般非極性樹脂適宜從極性溶劑中吸附非極性物質(zhì)；極性

17、樹脂適宜從非極性溶劑中吸附極性物質(zhì)，而中極性樹脂則對上述兩種情況都具有吸附力。菇類化合物主要集中在乙醇或甲醇洗脫液中，菇類配糖體主要集中在50%乙醇或甲醇洗脫液中。2.2.2硅膠柱層析法 這是目前靈芝酸分離純化最基本的方法，也是最主要的方法。在分離不同的三萜時所使用的溶劑略有不同，常用的溶劑有CHCl3-MeOH，CHCl3- MeOH-H2O， C6H6-MeOH， C6H6-acetone等，用不同配比分段洗脫得到不同分離物。但是這種分離方法較為繁瑣，時間較長，而且所使用的試劑都是有毒有機溶劑，所獲得的產(chǎn)品純度較低，不是最佳分離途徑。2.2.3薄層色譜法 李平作等45，46以甲苯-乙酸乙酯

18、-乙酸(12:4:0.5)為展開劑分離從靈芝發(fā)酵物中提取的粗四環(huán)三萜酸得到3個明顯斑點，Rf 分別為0.56，0.49，0.17，分離結(jié)果理想。馬禮金等47用氯仿-甲醇-水(30:40:1)作為展開劑，結(jié)果顯示赤芝子實體含15種三萜酸，而菌絲體僅含5種三萜酸。王幫新 48以靈芝子實體整體為原料，乙醇提取后分出總酸部分，用正己烷：二氯甲烷：三氯甲烷：甲醇(4.0:3.0:2.5:0.5)為展開劑展開，薄層板上顯示6個主要組分。但是此方法分離效率不高，產(chǎn)率低，難以作為常規(guī)制備的有效方法使用。 2.2.4制備高效液相色譜法 Lin 等50用反相高壓液相色譜(RP-HPLC)采用梯度洗脫法在1h內(nèi)從赤芝菌絲體的甲醇提取物中成功分離出14種三萜化合物，其中包括常規(guī)方法難以分離的三萜立體異構(gòu)體。Chen等52等以乙腈/2%乙酸=1:4-1:2為流動相的梯度洗脫法用半制備RP-HPLC（C18）從靈芝菌絲體甲醇提取物中分離出靈芝酸 A、B、C1和C2。Tang等53用半制備RP-HPLC（C18）以90%的甲醇為流動相從靈芝菌絲體中分離出靈芝酸T，Me，并考察了溫度對制備的影響。GAO38 等 Gilson HPLC系統(tǒng)上（硅膠柱）用制備型 HPLC以