狂犬病病毒-分子生物學(xué)基礎(chǔ)

1、狂犬病病毒分子生物學(xué)基礎(chǔ)狂犬病病毒分子生物學(xué)基礎(chǔ)狂犬?。≧abies）俗稱“瘋狗病”，是由狂犬病病毒引起的一種接觸性傳染病，呈世界性流行，死亡率幾乎為100%。每年造成超過55,000人死亡，其中99%在亞洲，印度具首位，中國第二位。臨床特征是前期神經(jīng)興奮，后期意識障礙，局部和全身麻痹而死。因采取疫苗接種及綜合防治措施，目前已有日、韓、馬來、澳等36個國家消滅了狂犬病。病原狂犬病病毒：Rabies virus, RV。有兩種主要抗原：一種是外膜上的糖蛋白抗原，為主要抗原，決定病毒的嗜神經(jīng)性、致病性和產(chǎn)生中和抗體；內(nèi)層的核蛋白抗原，可使體內(nèi)產(chǎn)生補體結(jié)合抗體和沉淀素，無保護作用。從患者或患病動物體

2、內(nèi)分離的毒株成為自然毒株或街毒株（street virus），毒力強；經(jīng)過腦組織多次傳代后，成為固定毒株（fixed virus），毒力弱，可以用于疫苗制備。病原學(xué)病毒主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、唾液腺和唾液內(nèi)。在唾液腺、海馬角、大腦皮層細胞漿內(nèi)形成嗜酸性包涵體，稱為Negri bodies (NB)，是病毒復(fù)制和裝配的場所。病毒可以在大鼠、小鼠、家兔和雞胚等腦組織內(nèi)增殖、致弱，也可以通過馴化，適應(yīng)于非腦組織細胞?？袢∫呙缫呙纾核杏脺p毒或者殺死的病原生物（包括細菌、病毒、立克次氏體等）或其抗原性物質(zhì)所制成，用于預(yù)防接種的生物制品。目的：預(yù)防、控制疾病（如狂犬?。┑陌l(fā)生、流行。1881年法國巴斯

3、德最早應(yīng)用連續(xù)傳代減弱病毒毒力，成功制造出狂犬病疫苗。目前接種狂犬病疫苗是預(yù)防狂犬病唯一有效的手段。由于狂犬病幾乎100%的致死性，人用狂犬病疫苗必須是滅活苗。狂犬病疫苗的歷史經(jīng)歷五代疫苗1. 神經(jīng)組織疫苗2. 禽胚培養(yǎng)疫苗3.3. 細胞培養(yǎng)疫苗細胞培養(yǎng)疫苗4. 亞單位及精致疫苗5. 基因工程疫苗人用狂犬病疫苗生產(chǎn)流程細胞制備及培養(yǎng)接種毒株培育收獲病毒上清病毒純化病毒滅活原液檢定分裝及凍干RV的滅活病毒對H2O2、KMNO4、新潔爾液、來蘇兒、肥皂水、70%酒精、碘酒以及-丙內(nèi)酯敏感。目前通用-丙內(nèi)酯來滅活疫苗收獲液中的活毒，用量為1:4000，方法：4過夜，37水浴2h水解殘留的-丙內(nèi)酯。里

4、程碑：分子生物學(xué)的誕生1962 Nobel prize in Physiology or Medicine中心法則蛋白質(zhì)原核生物和真核生物在基因表達上的區(qū)別什么是病毒？生物病毒是一類個體微小，結(jié)構(gòu)簡單，只含單一核酸（DNA或RNA），必須在活細胞內(nèi)寄生并以復(fù)制方式增殖的非細胞型微生物。特點：不具細胞結(jié)構(gòu)，具有遺傳、復(fù)制等生命特征，既無能能量代謝系統(tǒng)也無蛋白質(zhì)和核酸合成系統(tǒng)病毒的形態(tài)病毒的形態(tài)球狀病毒；桿狀病毒；磚形病毒；冠狀病毒；絲狀病毒；鏈狀病毒；有包膜的球狀病毒；具有球狀頭部的病毒；封于包含體內(nèi)的昆蟲病毒等。病毒粒的對稱體制： 病毒粒的對稱體制只有兩種，即螺旋對稱（代表煙草花葉病毒） 二十

5、面體對稱（等軸對稱，代表腺病毒）。一些結(jié)構(gòu)較復(fù)雜的病毒，實質(zhì)上是上述兩種對稱相結(jié)合的結(jié)果，故稱作復(fù)合對稱（代表T偶數(shù)噬菌體）。桿狀病毒 HIV絲狀病毒 腺病毒病毒的分類從遺傳物質(zhì)分類：DNA病毒、RNA病毒、蛋白質(zhì)病毒（如：朊病毒）。從病毒結(jié)構(gòu)分類：真病毒（EuvirusEuvirus，簡稱病毒）和亞病毒（SubvirusSubvirus，包括類病毒、擬病毒、朊病毒）。從寄主類型分類：噬菌體（細菌病毒）、植物病毒（如煙草花葉病毒）、動物病毒（如禽流感病毒、天花病毒、H等）。從性質(zhì)來分：溫和病毒（H）、烈性病毒（狂犬病病毒）。病毒的分類國際病毒分類委員會（International Commit

6、tee on Taxonomy of Viruses：ICTV）彈狀病毒科病毒結(jié)構(gòu)示意圖彈狀病毒科成員彈狀病毒科水泡性病毒屬狂犬病病毒屬短暫熱病毒屬細胞核彈狀病毒屬非毒粒彈狀病毒屬細胞質(zhì)彈狀病毒屬58種植物病毒未歸類植物病毒VSVVSVRVRV狂犬病病毒：Rabies virus, RV75 nm (6085 nm)180 nm (60400 nm)RV基因組構(gòu)成大?。杭s12 kbp。單股負鏈RNA (-ssRNA)?；蚺挪迹?to 5）：核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、糖蛋白（G）和大蛋白（即依賴RNA的RNA聚合酶，L）。其中N基因最保守，常用于進化分析；G基因編碼的G蛋白是

7、病毒唯一暴露在外表面的蛋白，是病毒的主要抗原，同時也是引起宿主免疫應(yīng)答的主要組分。-ssRNA vs +ssRNA定義：一般來說根據(jù)RNA能否直接起mRNA作用而分成單股正鏈RNA病毒(正股RNA病毒)與單股負鏈RNA病毒(負股RNA病毒)兩種。RV屬于單股負鏈RNA病毒，即-ssRNA病毒。RV感染周期(Cited from Dietzschold et al., 2005)逆軸突運輸機制(Cited from Dietzschold et al., 2005)小結(jié)狂犬病病毒RV是彈狀病毒科(Rhabdoviridae )狂犬病病毒屬 (Lyssavirus )的模式病毒種。RV 呈子彈狀，

8、長約為180 nm (60-400 nm)，直徑約為75 nm (60-85 nm) 。具有囊膜包被，基因組為12 kbp大小的單股負鏈 RNA (-ssRNA)。高度嗜神經(jīng)性，且逆軸突傳播。含有5個結(jié)構(gòu)基因，從3到5依次為N、P、M、G和L。病毒粒子大?。?1058105 kDa，沉降系數(shù)為600S。根據(jù)N基因5端500 bp堿基的同源性分析，可以將狂犬病病毒屬分為7種基因型（Genotype，GT）：狂犬病病毒屬的分類GTGT病毒名稱病毒名稱縮寫縮寫I I狂犬病病毒狂犬病病毒RVRVIIIILagosLagos蝙蝠株蝙蝠株LagVLagVIIIIIIMokolaMokola病毒病毒MokV

9、MokVIVIVDuvenhageDuvenhage病毒病毒DuvVDuvVV V歐洲蝙蝠病毒歐洲蝙蝠病毒-1-1EBLEBL-1-1VIVI歐洲蝙蝠病毒歐洲蝙蝠病毒-2-2EBLEBL-2-2VIIVII澳大利亞蝙蝠病毒澳大利亞蝙蝠病毒ABLABL.兩個遺傳譜系疫苗的交叉保護作用僅存在與同一個遺傳譜系內(nèi)的病毒中！病毒感染的一般步驟吸附進入脫殼病毒基因轉(zhuǎn)錄和復(fù)制子代病毒裝配釋放RV感染的一般步驟RV的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄RV基因轉(zhuǎn)錄vs復(fù)制兩種狀態(tài)的RNA聚合酶：RNA轉(zhuǎn)錄酶和RNA復(fù)制酶。RNA轉(zhuǎn)錄酶：L、P、EF-1、Hsp60、GT（鳥苷轉(zhuǎn)移酶），從N基因處直接開始轉(zhuǎn)錄。RNA復(fù)制酶：L、P、可溶

10、性的N蛋白（N-P復(fù)合物形式存在，為復(fù)制必須），從基因組的第一個bp處開始合成leader RNA和復(fù)制基因組。RV基因的轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄重要的順式作用元件：啟動子、轉(zhuǎn)錄起始位點和轉(zhuǎn)錄終止信號。RV基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式：stop-start model。RV基因組僅有一個啟動子，5個基因有相同的轉(zhuǎn)錄起始位點：UUGU和轉(zhuǎn)錄終止信號：A/UCUUUUUUU。通用模式：-間隔區(qū)UUGU-ORF-A/UCUUUUUUU間隔區(qū)。RV轉(zhuǎn)錄元件Stop-start model一個基因轉(zhuǎn)錄的終止是下一個基因轉(zhuǎn)錄起始必須的。RNA聚合酶在終止上一個基因轉(zhuǎn)錄時，大約有30%的RNA聚合酶不能起始下游基因的轉(zhuǎn)錄，造成轉(zhuǎn)錄依次

11、遞減30%。研究發(fā)現(xiàn)，-ssRNA基因表達的調(diào)控主要是通過基因與3端啟動子的位置來控制的。RV基因組的復(fù)制3leader和5trailer互補鏈均含有復(fù)制起始信號，但5的trailer互補鏈的復(fù)制信號強度大于3 leader，造成-ssRNA：+ssRNA=50:1，因此包裝成熟的病毒粒子含有-ssRNA與含有+ssRNA的比例也約為50:1VSV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制模型病毒粒子的裝配研究發(fā)現(xiàn)，RV的基因組兩端不存在特定的包裝信號，-ssRNA或+ssRNA包裝入病毒粒子完全由兩種RNA在細胞內(nèi)的豐度決定(Finker et al., 1997)。然而，對VSV的研究發(fā)現(xiàn)，VSV基因組-ssRNA 5端

12、的trailer區(qū)含有包裝信號，使-ssRNA被選擇性包裝入核衣殼 (Whelan and Wertz , 1999)。G 蛋白簡介狂犬病病毒G蛋白參與病毒的組織趨向性和致病性，是主要的保護性抗原，負責(zé)誘導(dǎo)病毒中和抗體的產(chǎn)生。 整個G蛋白分為四個結(jié)構(gòu)域：信號肽(signal peptite, SP)膜外區(qū)(ectodomain, ECTO)，跨膜區(qū)(transmembrane region, TM)和膜內(nèi)區(qū) (endodomain, ENDO)，成熟的G蛋白包括后面三個結(jié)構(gòu)域。G 全長: 522-533 aa成熟G蛋白: 503-514 aaSP: 19 aa, TM: 22 aa, ECTO

13、: 439 aa, ENDO: 42-53 aaRV G蛋白主要抗原位點膜34-4234-42198-200198-200IIII膜外區(qū)：膜外區(qū)：1-439 aa1-439 aaI I231231IVIV264264IIIIII330-357330-357a a342-343342-343244-281244-281G5G5跨膜區(qū)：跨膜區(qū)：440-460 aa440-460 aa膜內(nèi)區(qū)：膜內(nèi)區(qū)：462-505 aa462-505 aa反向遺傳學(xué)技術(shù)經(jīng)典遺傳學(xué)技術(shù) Gregor Johann Mendel 1822 -18841 ： 1表型（表型（phenotypephenotype）基因型（基因型（genotypegenotype）反向遺傳學(xué)技術(shù)表型（表型（phenotypephenotype）基因型（基因型（genotypegenotype）基因重組技術(shù)基因重組技術(shù)-ssRNA反向遺傳學(xué)建立的基礎(chǔ)L、P、N和病毒-ssRNA或+ssRNA包裝形成核糖核蛋白復(fù)合體( ribonucleoprotein, RNP)。RNP負責(zé)病毒進入細胞后的所有復(fù)制過程，包括病毒基因的轉(zhuǎn)錄和基因組的復(fù)制等。體外構(gòu)建具有活性的病毒單位必須提供：1.病毒-ssRNA或+ssRNA；2.L、P和N三種蛋白。病毒-ssRNA或+ssRNA