銅綠假單胞菌耐藥

1、收稿日期:2003 - 12 - 15作者簡介:李學如,男,生于1958年,博士,副教授,主要從事微生物藥物和細菌耐藥分子機理研究。文章編號:1001 - 8751 (2004) 03 - 0105 - 04銅綠假單胞菌耐藥機理研究進展李學如 孟濤 王 艷綜述(西南交通大學生物工程系,成都610031 )摘要:銅綠假單胞菌對抗菌藥物主要存在以下四種耐藥機理:產(chǎn)生抗生素滅活酶或抗生素修飾酶; 改變抗菌藥物作用的靶位,從而逃避抗菌藥物的抗菌作用;膜屏障與主動外排,限制藥物到達其作用靶位; 形成生物膜 。銅綠假單胞菌對抗生素的耐藥往往不是由單一因素造成的。有關銅綠假單胞菌的耐藥性,仍存在許多問題有待

2、進一步探索,銅綠假單胞菌耐藥性防治還需要深入研究,尋找能夠拮抗細菌生物膜形成和主動泵出機制抗菌藥物是今后必須解決的問題和研究方向。關鍵詞:銅綠假單胞菌;耐藥機理;拓撲異構酶;主動外排中圖分類號:r915文獻標識碼:a銅綠假單胞菌是一種臨床上最常見的引起嚴重院內(nèi)獲得性感染條件致病菌。由銅綠假單胞菌引起的醫(yī)院內(nèi)感染高達30 %以上 ,而呼吸道感染率更高,居病原菌之首 。隨著抗菌藥物的廣泛應用,細菌的耐藥性變得越來越嚴重,使得治療銅綠假單胞菌感染十分困難1、2 。銅綠假單胞菌主要通過以下四種途徑產(chǎn)生耐藥: 產(chǎn)生抗生素滅活酶或抗生素修飾酶,如產(chǎn)生 - 內(nèi)酰胺酶 、 氨基糖苷鈍化酶等; 改變抗菌藥物作用

3、的靶位 ,從而逃避抗菌藥物的抗菌作用,如青霉素結合蛋白( pbps ) 和 dna 促旋酶等結構發(fā)生改變; 膜屏障與主動外排 ,限制藥物到達其作用靶位; 形成生物膜(biofilm ) 。本文就銅綠假單胞菌對目前臨床上常用的抗銅綠假單胞菌藥物的耐藥機理方面研究進展作一簡要介紹 。1 產(chǎn)生抗生素滅活或修飾酶細菌產(chǎn)生- 內(nèi)酰胺酶是細菌耐藥的最重要的機制之一 。產(chǎn)酶菌通過對 - 內(nèi)酰胺類抗生素的水解作用 ,使其能在有 - 內(nèi)酰胺類抗生素存在的環(huán)境下生存 。由于銅綠假單胞菌具有比較特殊的細胞壁和細胞膜結構 ,對許多 - 內(nèi)酰胺類抗生素存在固有耐藥,臨床上多采用羧基及酰胺類青霉素、 三代頭孢菌素和碳青霉

4、烯類 - 內(nèi)酰胺抗生素治療銅綠假單胞菌感染。因此 ,深入研究銅綠假單胞菌產(chǎn)超廣譜- 內(nèi)酰胺酶( extended - spectrum- lactamases、 esbls) 的耐藥機制具有重要的臨床意義。目前臨床上將所有能夠水解第三代頭孢菌素及碳青霉烯類抗生素的酶都稱之為超廣譜 - 內(nèi)酰胺酶3 。所有的銅綠假單胞菌都能夠表達由染色體介導的ampc 酶 ,ampc 酶的結構基因為ampc,位于染色體上。與其相近的ampr基因編碼一個分子質量為31kda 調(diào)控蛋白的表達,即 amp r 蛋白 。此蛋白具有激活和抑制兩種作用,控制著am pc基因的表達。amp r 為 lysr 受體家族,當誘導性

5、抗生素不存在時,在胞壁質前體尿苷二磷酸乙酰胞壁酸五肽的作用下,對am pc基因的表達起抑制作用。ampc 酶能水解幾乎所有類型的- 內(nèi)酰胺類抗生素,克拉維酸也不能抑制該酶的活性。銅綠假單胞菌對亞胺培南等碳青霉烯類耐藥是ampc 酶與外膜蛋白o2prd (d2 孔蛋白 ) 的缺失協(xié)同作用的結果4 。2 改變抗菌藥物作用的靶位銅綠假單胞菌通過改變靶位青霉素結合蛋白和dna 拓撲異構酶ii 的結構 ,對- 內(nèi)酰胺類和喹諾酮類抗生素產(chǎn)生耐藥。211 青霉素結合蛋白pbp是一組位于細菌內(nèi)膜的蛋白質,對細菌細胞壁的合成 、 形態(tài)維持和糖肽結構調(diào)整等功能具有催化作用 。 - 內(nèi)酰胺類抗生素通過抑制pbp而干

6、擾細菌細胞壁的合成,從而達到殺滅細菌的作用,因此 pbp是 - 內(nèi)酰胺類抗生素的作用靶位。幾乎所有的細菌都含有 pbp ,一種細菌通常含有48 種 pbps,分子質量在 35kda120kda 范圍 ,習慣上按分子質量降序命名 。在同一種pbp 中 ,又細分出多種命名,如 pbpla?501?國外醫(yī)藥抗生素分冊2004年5月第25卷第3期? 1995-2005 tsinghua tongfang optical disc co., ltd. all rights reserved.和 pbp1b 等銅綠假單胞菌pbp 類型與大腸埃希氏菌高度相似 。sds- page 電泳中銅綠假單胞菌表現(xiàn)有6

7、 個主要 pbp 區(qū)帶和數(shù)個小的帶型。在實驗室菌株和臨床分離菌中,均發(fā)現(xiàn)耐藥銅綠假單胞菌中有pbp 改變現(xiàn)象的存在 。在染色體介導- 內(nèi)酰胺酶缺失的銅綠假單胞菌中 ,通過分子生物學方法使pbp3 過度表達后,發(fā)現(xiàn)其對氨曲南、 頭孢吡肟、 頭孢磺啶和頭孢他啶的m ic 上升 2 8倍 ,而對以 pbp1 為靶位的抗生素頭孢噻啶 、 以 pbp2 為主要靶位的亞胺培南敏感性沒有改變5 。在一株亞胺培南耐藥的銅綠假單胞菌臨床分離菌中 ,發(fā)現(xiàn)其耐藥性與pbp4 的改變密切相關,并與膜通透性改變協(xié)同作用4 。銅綠假單胞菌的pbp5 具有- 內(nèi)酰胺酶活性,能夠降低青霉素的濃度。對作用于銅綠假單胞菌的- 內(nèi)

8、酰胺類抗生素的敏感性和耐藥性 ,pbp5 的 2內(nèi)酰胺酶活性具有重要作用,pbp5缺失銅綠假單胞菌顯示出高敏特性。2. 2 dna 拓撲異構酶ii 基因的突變喹諾酮類抗菌藥是通過抑制dna 拓撲異構酶ii(dna 促旋酶 )和拓撲異構酶iv ,阻斷 dna 的復制而產(chǎn)生抗菌作用。這種作用對細菌的選擇性高,特別是氟喹諾酮類的出現(xiàn),創(chuàng)造了合成抗菌藥的新時代。但隨著該類藥物的廣泛使用,細菌的耐藥性也隨之發(fā)生,嚴重影響其臨床應用。大量的研究表明:細菌編碼喹諾酮類藥物作用靶位的dna 促旋酶和拓撲異構酶iv的基因突變,改變了酶的結構,使藥物不能與酶-dna 復合物穩(wěn)定結合是細菌對喹諾酮類藥物的主要耐藥機

9、制之一6 。2. 2. 1 dna 促旋酶dna 促旋酶為能量依賴性拓撲異構酶 ,由兩對亞單位gyra 和 gyrb 組成 ,分別由gy ra、gyrb基因編碼,gyra參與dna的斷裂與重新連接 ,gyrb 參與 a tp 酶水解 ,提供反應的能量。kukeishi 等7 首先報道了gyra基因的突變,通過對銅綠假單胞菌的dna 促旋酶gyra基因的克隆并測序 ,發(fā)現(xiàn)了一個2769 bp 的開放閱讀框架(orf) ,它編碼一個由923 個氨基酸組成的蛋白,分子質量約103kda 。 用 pcr 擴增銅綠假單胞菌臨床分離株的gyra基因上一段長為360bp的序列 (喹諾酮耐藥決定區(qū) ,qrdr

10、 ) ,發(fā) 現(xiàn) gyra 有 三 種 突 變 方 式 : asp87 asn ,asp87 tyr 及 thr83 ile。takashi 等8 通過對臨床分離株銅綠假單胞菌gyra基因的研究又發(fā)現(xiàn)了三種新的雙突變現(xiàn)象,即 : thr83 ile 和 asp87 gly ;thr83 ile 和 asp87 asn ; thr83 ile 和 asp87 his。takenouchi 等進行非同位素單股構象多肽性分析和直接測序檢測gyra點突變時 ,發(fā)現(xiàn)gyra的七種錯義方式,其中包括 2 種以前未報道過的新的雙突變,即 :ala67 ser和 asp87 gly ;ala84 pro 和 g

11、ln106 leu 。盡 管gyra基 因 的 突 變 方 式 多 種 多 樣 , 但thr83 ile 仍為最主要的突變方式。2. 2. 2 dna 拓撲異構酶 對耐喹諾酮類藥物的銅綠假單胞菌的研究主要集中于dna 促旋酶 ,對 dna 拓撲異構酶iv 的研究則鮮有進展。直到最近,dna 拓撲異構酶iv 才被認為是喹諾酮類藥物作用的一個替代靶位 。多數(shù)喹諾酮類藥物首先以dna 促旋酶為主要作用靶點,然而越來越多的研究表明某些抗菌譜增寬的新一代喹諾酮類藥物對dna 促旋酶和dna 拓撲異構酶iv 有等同作用9 。李學如等10 對臨床分離銅綠假單胞菌環(huán)丙沙星耐藥株的拓撲異構酶gyra、gyrb、

12、parc和par e基因的喹諾酮類藥物耐藥決定區(qū)(qrdr) 基因突變與耐藥性的關系研究結果表明,90 %以上的銅綠假單胞菌耐藥株表現(xiàn)出拓撲異構酶 基因突變 。突變主要發(fā)生在gyra基因和parc基因上,其中gyra基因的第83位氨基酸密碼子表現(xiàn)出高頻突變,占拓撲異構酶基因突變的90 % ,parc基因第 80 位氨基酸密碼子也表現(xiàn)出較高的突變,占拓撲異構酶基因突變的50 %。gyra基因和par e基因同時發(fā)生突變的變異株比只發(fā)生單突變(gyra或gyrb或parc或par e)的菌株對喹諾酮類藥物有更高的耐藥性,大都呈現(xiàn)較高水平的耐藥 ;發(fā)生 3 點突變的變異株都是高水平耐藥株。結果表明g

13、yra的突變是銅綠假單胞菌臨床分離株對喹諾酮類藥物的主要耐藥機理,parc基因的突變只是使銅綠假單胞菌對喹諾酮類藥物的耐藥上升到更高的水平 。3 膜通透性障礙銅綠假單胞菌的天然多重耐藥特點與細胞膜結構密切相關,細菌細胞膜對抗菌藥物進入細菌具有阻礙作用 。銅綠假單胞菌l ps分子有 67 條脂肪酸鏈相互共價連接,使得膜流動性非常低,對藥物的屏障作用十分強 。細菌細胞膜上鑲嵌有孔蛋白( porin) ,在運輸 、 交換細菌生命必須的物質的同時,小分子藥物可以通過孔蛋白進入細菌內(nèi)。但銅綠假單胞菌缺乏這種典型的通道,它的孔蛋白具有特殊性,在維持銅綠假單胞菌基本生理代謝的同時,即使小分子水溶性抗菌素通過

14、孔道的速度依然很慢,因而銅綠假單胞菌具有天然的多重耐藥性。4 主動外排系統(tǒng)銅綠假單胞菌特殊的膜結構和低通透性不能完全?601?國外醫(yī)藥抗生素分冊2004年5月第25卷第3期? 1995-2005 tsinghua tongfang optical disc co., ltd. all rights reserved.解釋其固有的多重耐藥性,因為許多對銅綠假單胞菌靶位可以產(chǎn)生作用的抗生素通過其細胞外膜的速率高于細菌生長的速率,但銅綠假單胞菌仍能夠繼續(xù)生長,因此推測可能有主動外排機制的存在。許多研究表明銅綠假單胞菌細胞膜上的許多蛋白的確具有將抗菌藥物主動外排的作用,并與其細胞外膜的低通透性協(xié)同作用

15、 ,導致銅綠假單胞菌固有多重耐藥2 。411 銅綠假單胞菌的外排泵銅綠假單胞菌細胞膜上的主動外排蛋白是導致銅綠假單胞菌對多種抗生素表現(xiàn)固有或獲得性多重耐藥的原 因 。這 些 蛋 白 包 括 : 轉 運 抗 生 素 的 內(nèi) 膜 蛋 白mexb 、 mexd 、 mexf 或 mex y; 控制抗生素進出細胞的外膜通道蛋白oprm 、 oprj 或 oprn ;連接膜與相關外排蛋白的膜連接蛋白mexa 、 mexc 、 mexe 或 mexx 。銅綠假單胞菌細胞膜上的這些主動外排蛋白組成四類主動外排系統(tǒng),即 mexab - oprm 、 mexcd - oprj、mexef - oprn和mexx

16、y - oprm。mexab - oprm 主動外排導致野生型銅綠假單胞菌對四環(huán)素類、 氯霉素類 、 氨基糖苷類、 大環(huán)內(nèi)酯類、- 內(nèi) 酰 胺 類 和 喹 諾 酮 類 等 多 種 抗 生 素 產(chǎn) 生 耐 藥 。mexcd - oprj 和 mexef - oprn 操縱子基因在一般的實驗條件下并不表達,在銅綠假單胞菌的野生菌株中 ,不存在這兩種主動外排系統(tǒng),它們與銅綠假單胞菌的固有多重耐藥性無關,但當其過度表達時,則參與銅綠假單胞菌的獲得性多重耐藥的形成11 。mexxy -oprm 目前發(fā)現(xiàn)它只能外排氨基糖苷類抗生素。41111 mexab - oprm 銅綠假單胞菌mexab - o2pr

17、m 外排系統(tǒng)是迄今為止最具有臨床意義的藥物外排系統(tǒng) 。由 3 個結構基因編碼,mexa 是 40kda 的漿膜蛋白 ,起連接 mexb 和 oprm 的作用 ;mexb 是漿膜上108kda的蛋白,為跨膜的底物輸出亞單位;oprm形成外膜通道并加速底物輸出外膜。masuda 等12 首先發(fā)現(xiàn)一株 50kda 的外膜蛋白明顯增加的銅綠假單胞菌變異株,該外膜蛋白即oprm ,其過度表達與銅綠假單胞菌對環(huán)丙沙星、 四環(huán)素等多種抗生素產(chǎn)生耐藥,但是 ,oprm 不能單獨起到外排抗生素的作用,外排泵的三 聯(lián) 結 構 是 其 泵 出 底 物 抗 生 素 的 基 礎 。最 近 ,wang13 評價了銅綠假單

18、胞菌外膜蛋白oprm的結構模式 ,他們認為oprm 與 tolc 在結構上相似,在 o2prm 模式中 ,oprm 將其序列線狀排列成tolc 晶體結構 ,對 tolc 結構起重要作用的殘基則在空間中呈現(xiàn)出保守性 。該模式使我們能夠作出更多關于oprm 功能區(qū)及與之相關外排蛋白家族的假說。最近有研究表明mexab -oprm 的作用至少部分地依賴tonb 能量偶聯(lián)蛋白 ,說明該外排泵的外膜組件可能由通道閘門控制 。mexab - oprm 生理條件下的阻遏蛋白為mexr基因所編碼的產(chǎn)物, mexr的突變導致mexab - o2prm 脫抑制而表達增強,從而形成獲得性耐藥14 。41112 me

19、xcd - oprj li 等2 對銅綠假單胞菌突變株外膜蛋白分析表明,其上存在分子質量分別為50、46、 100kda的 3 個蛋白 ,后兩者過度表達。這個系統(tǒng)與 mexab - oprm 類似 ,被命名為 mexcd - oprj。此后 ,naomasa等發(fā)現(xiàn) mexcd - oprj 外排泵與銅綠假單胞菌對普通頭孢類藥物、 氟喹諾酮類藥物及第四代頭孢類藥物的耐藥性有關,而與羧芐青霉素及氨曲南的耐藥性無關 。41113 mexef - oprn kohler 等15 發(fā)現(xiàn)用環(huán)丙沙星和氯霉素篩選出的多重耐藥的銅綠假單胞菌也過度表達一個50kda 的外膜蛋白,western blot 分析表明

20、該蛋白是oprn ,系能量依賴的主動外排系統(tǒng)的一部分,存在3個orf ,這3個orf ,即mexe、mexf和o2prn 。類似于銅綠假單胞菌外排操縱子mexab - o2prm 和 mexcd - oprj 的組分 。41114 mexxy - oprm mexxy - oprm 存在于天然野生株銅綠假單胞菌中,mexxy 與 oprm 并不由同一操縱子所表達,但 mexxy 需要 oprm 的參與發(fā)揮外排功能 ,主要參與氨基糖苷類固有耐藥性的形成。mexxy - oprm的作用底物也包括四環(huán)素類、 氯霉素類 、 大環(huán)內(nèi)酯類、- 內(nèi)酰胺類和喹諾酮類等多種抗生素16 。目前還不斷有其他類型的銅

21、綠假單胞菌主動外排系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn)的報道17 ,搜尋銅綠假單胞菌基因文庫發(fā)現(xiàn) ,該菌至少有12 種主動外排系統(tǒng)。目前很難推測其他外排系統(tǒng)是否與細菌的耐藥性有關。5 細菌生物膜細菌生物膜是近年來引起國內(nèi)外學者高度重視的一種細菌群體生物學特性,是細菌吸附于惰性或活性材料表面形成的,由細菌和它所分泌的胞外多聚物組成的外觀呈膜狀的多菌集合體(community ) ,是細菌在生長過程中,為了適應生存環(huán)境而形成的一種與游走細胞相對應的存在形式,由細菌和它所分泌的胞外多聚物如胞外多糖等組成。進年來研究表明,65 %以上的人類細菌感染與生物膜有關,銅綠假單胞菌極易形成生物膜18 。細菌生物膜具有極強的耐藥性和抵抗

22、機體免疫系統(tǒng)作用的能力,由已形成生物膜的細菌感染的組織和污染的生物材料,即使使用正常劑量成百倍的藥物也難以治愈,最終導致病人系統(tǒng)性衰竭,危及生命 。細菌生物膜表現(xiàn)出的這種極強耐藥性的機理目前?701?國外醫(yī)藥抗生素分冊2004年5月第25卷第3期? 1995-2005 tsinghua tongfang optical disc co., ltd. all rights reserved.還不十分清楚,有滲透限制 、 營養(yǎng)限制和表型推斷三種學說 。滲透限制學說認為19 ,細菌生物膜對抗菌劑的不敏感性是由于生物膜內(nèi)細菌分泌的胞外多聚物被膜所形成的屏障,阻止了抗生素的穿入。這一假說被許多研 究 者

23、 所 接 受 ,并 被 一 些 研 究 所 證 實 。但 正 如stewart 所指出 ,對多數(shù)抗生素來說,滲透限制還不足以解釋生物膜的耐藥性。營養(yǎng)限制學說認為,生物膜內(nèi)細胞 ,至少是部分細胞,由于受到營養(yǎng)供給的限制,處于緩慢生長或饑餓狀態(tài),這種狀態(tài)的細胞對抗生素不敏感 ,或者使對只殺傷處于分裂狀態(tài)的細胞的抗生素難以發(fā)揮作用。但 karen 認為 ,該假說很難對生物膜引起的頑固性難治感染做出滿意的解釋,如果該假說成立 ,那末生物膜頂部具有代謝活性的細胞就能被殺菌劑所殺死,之后 ,原來位于次層的受到營養(yǎng)限制處于緩慢生長或不生長的細胞,就成為生物膜頂部細胞,重新具有代謝活性,可被殺菌劑殺死。這樣生

24、物膜內(nèi)層細胞就會逐步被消滅,最終細胞全部被消滅,生物膜消失 。顯然 ,這與實際情況不符。表型推斷學說認為,細菌生物膜表現(xiàn)出的抗藥性可能是生物膜內(nèi)細胞,至少某些細胞采用一種與游走細胞不同的具有保護作用的生物膜表型,這種表型不是對營養(yǎng)限制的一種反應,而是細菌附著在表面的一種生物學反應,細菌的一些新基因表達產(chǎn)物對生物膜的抗藥性起著關鍵作用。表型推斷學說從基因一表型角度來解釋其抗藥性,涉及到細菌生物膜抗藥性的實質20 。雖然上述三種學說都被一定的實驗所證實,但都不足以全面揭示生物膜的耐藥性 。細菌生物膜引起的難治性感染的防治是臨床上亟待解決的問題之一21 。人類對單個細菌所引起的感染的研究已經(jīng)很深入,

25、但對細菌生物膜的了解才剛剛開始,還有許多有關細菌生物膜的基礎問題有待解決,尤其需要搞清細菌生物膜形成的遺傳物質基礎,搞清細菌生物膜的耐藥機理,尋找其薄弱環(huán)節(jié),以便研究出更好的目前又迫切需要的處理方法。近年來的研究標明 ,由于細菌生物膜的信號傳遞系統(tǒng)對生物膜的形成和生物膜結構的穩(wěn)定起著關鍵性作用,該信號傳遞系統(tǒng)被認為是消滅細菌生物膜最有希望的突破口22 。6 結語銅綠假單胞菌對抗生素的耐藥往往不是由單一因素造成的 。產(chǎn)生滅活抗生素酶或修飾抗生素酶;改變抗菌藥物作用的靶位;形成膜屏障;主動外排等機理之間可以發(fā)生協(xié)同作用。細菌群體的生物膜耐藥與多種耐藥機理相關。有關銅綠假單胞菌的耐藥性,仍存在許多問

26、題有待進一步探索,如生物膜形成的機理、 主動處排系統(tǒng)的作用方式,各外排系統(tǒng)之間的相互關系等等 。同時 ,細菌耐藥性的傳播影響著銅綠假單胞菌感染的臨床治療,雖然銅綠假單胞菌中質粒含量很少,噬菌體引發(fā)的耐藥性傳播在銅綠假單胞菌臨床分離菌中已有報道 。綜合評價耐藥銅綠假單胞菌臨床分離菌的耐藥性 ,分析總結其耐藥規(guī)律和特點,可以指導臨床合理使用抗生素,開發(fā)新的抗銅綠假單胞菌藥物。銅綠假單胞菌耐藥性防治還需要深入研究,尋找能夠拮抗細菌生物膜形成和主動外排的抗菌藥物是今后必須解決的問題和研究方向。參考文獻1 stove ck , pham qx , erwinal , et al . complete g

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